Name: coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

נתמך על ידי NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (קלוג), ו- NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 ו- FRAXA (מק'קולה). הדמיית CARS בוצעה בחלק הליבה של מיקרוסקופיית האור המתקדמת של המרכז לנוירוטכנולוגיה בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ, הנתמך בחלקו על ידי NIH P30 NS048154 ו-NIH P30 DK116073.

כל הניסויים עמדו בכל החוקים החלים, הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ.
1. בעלי חיים
<ol><li>השתמש בעכברי C57BL/6J (מלאי #000664) (Mus musculus ) שהתקבלו ממעבדת ג'קסון או גרבילים מונגולים (Meriones unguic...

<ol>
	<li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity.">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li><li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow.">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li><li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+computations.">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).</li><li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept.">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li><li>Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+and+design+principles+of+axons.">Integrative properties and design principles of axons.</a> International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).</li><li>Fitzhugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computation+of+impulse+initiation+and+saltatory+conduction+in+a+myelinated+nerve+fiber.">Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber.</a> Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).</li><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).</li><li>Salzer, J. L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination.">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li><li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+myelin.">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li><li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+in+development,+myelin+generation+and+beyond.">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424 (2019).</li><li>Saab, A. S., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+dynamics:+protecting+and+shaping+neuronal+functions.">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li><li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS?+A+theoretical+approach.">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).</li><li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing.">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073 (2015).</li><li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem.">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li><li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+NG2++glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer.">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li><li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li><li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+(ReBUILD):+a+randomised,+controlled,+double-blind,+crossover+trial.">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).</li><li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders.">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li><li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+deletion+of+Gtf2i,+associated+with+Williams+syndrome,+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug.">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li><li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder.">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li><li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues.">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li><li>Kim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains.">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li><li>. Fluorescence SpectraViewer Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022)</li><li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+centrale+geh&#246;rleitung.">Die centrale geh&#246;rleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis.">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825 (2019).</li><li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration.">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).</li><li>K&#250;tna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model.">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li><li>Ozsv&#225;r, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas.">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li><li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown.">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li><li>B&#233;gin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue.">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li></ol>

גוף הולך וגדל של ספרות מדגיש את תפקידו של המיאלין בתפקוד המוח 13,16,21,28. יתר על כן, אנו יודעים כי עובי המיאלינציה ודפוס המיאלינציה יכולים להשתנות במספר מצבים נוירולוגיים כגון טרשת נפוצה (נבדק ב -29), הזדקנות (נבד...

פוטנציאל פעולה הוא יחידת המידע הבסיסית במוח, ופוטנציאל פעולה המתפשט באמצעות אקסונים מהווה נדבך אחד של עיבוד מידע 1,2,3. תאי עצב בדרך כלל מקבלים קלטים ממספר תאי עצב אחרים ומשלבים את הקלטים האלה בחלון זמן צר נתון 4,5. לכן, מנגנוני הפעולה של התפשטות פוטנציאלית באקסונים קיבלו כמות משמעותית של תשומת לב מהחוקרים.
בעת התפשטות דרך אקסון, פוטנציאל פעולה מתחדש שוב ושוב לאורך האקסון כדי להבטיח התפשטות אמינה6. ברוב תאי העצב של בעלי חוליות לסתות (gnathostomes) אקסונים מוקפים בנדן של מיאלין, שהוא חומר עשיר בשומנים המיוצר על ידי אוליגודנדרוציטים סמוכים או תאי שוואן, שהם סוגים של תאי גליה (שנסקרוב-7,8). מעטפת המיאלין הזו מבודדת חשמלית את האקסון, מפחיתה את קיבוליותו ומאפשרת התפשטות פוטנציאלית של פעולה ביעילות, במהירות ובצריכת אנרגיה נמוכה יותר. המיאלין אינו מכסה את האקסון באופן אחיד, אך הוא עוטף את האקסון במקטעים שיש ביניהם רווחים קצרים, הנקראים הצמתים של Ranvier (נסקרב-9,10). הן עובי המיאלינציה, השולט ברמת הבידוד החשמלי של אקסון, והן הריווח של הצמתים של Ranvier, השולטים בתדירות שבה פוטנציאל הפעולה מתחדש לאורך אקסון, משפיעים על מהירות התפשטות פוטנציאל הפעולה (נבדק ב-11).
ישנה ספרות גדולה המציעה כי עובי המיאלינציה משפיע על מהירות ההתפשטות הפוטנציאלית של הפעולה באקסונים12,13,14. יתר על כן, שינויים במיאלינציה של האקסון יכולים לגרום למספר גירעונות CNS 15,16,17,18,19,20,21. לכן אין זה מפתיע שהתמקדות במאמצי מחקר רבים כרוכה במדידה ואפיון של אקסון מיאלינציה. מדידות של עובי המיאלין נעשו לרוב באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים, טכניקה הדורשת כמות משמעותית של הכנת רקמות ומאתגרת לשימוש בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה. עם זאת, יש גם טכניקה מהירה ופשוטה יותר למדידת מיאלינציה של אקסון המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS). ניתן לכוונן לייזר CARS לתדרים שונים וכאשר מכוונים אותו לתדרים המתאימים לעורר שומנים, ניתן לדמות את המיאלין ללא צורך בתוויות נוספות22. ניתן לשלב את הדמיית השומנים עם אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כך שניתן לדמות שומנים יחד עם מספר תעלות פלואורסצנטיות23. הדמיה של מיאלינציה עם CARS מהירה משמעותית ממיקרוסקופיית אלקטרונים ויש לה רזולוציה שהיא, אם כי נמוכה יותר מ- EM, מספיקה כדי לזהות אפילו הבדלים קטנים במיאלינציה באותו סוג של אקסונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5&#34;</td>
			<td>Exel int</td>
			<td>260040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal +</td>
			<td>Vortech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - 8mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF994 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 23 GA x 1&#34;</td>
			<td>BD precision glide</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump with variable flow or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumphosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL vial with 4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>230331000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass or plastic tray, approximately 10&#34; x 10&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, plant</td>
			<td>RPI</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>well plate</td>
			<td>Alkali Sci.</td>
			<td>TPN1048-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1n 1,000 mL of Millipore H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered (PB):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosohate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>A2153-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>x100-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nissl 435/455</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE&#160;picoemerald laser</td>
			<td>Angewandte Physik &#38; Elektronik&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (420-520 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ470/100m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (500-530 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ515/30m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filters (640-680 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ660/40m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Transfer pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 565 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>565dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 585 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>585dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic shortpass 750 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T750spxrxt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)</td>
			<td>Allen Scientific Glass Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton shortpass emission filter 680 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET680sp-2p8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices

ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) היא טכניקה המשמשת באופן קלאסי על ידי כימאים ופיזיקאים כדי לייצר אות קוהרנטי של תנודות חתימה של מולקולות. עם זאת, חתימות רטט אלה אופייניות גם למולקולות בתוך רקמה אנטומית כמו המוח, מה שהופך אותו יותר ויותר שימושי וישים עבור יישומים במדעי המוח. לדוגמה, CARS יכולה למדוד שומנים על ידי קשרים כימיים מרגשים במיוחד בתוך מולקולות אלה, מה שמאפשר כימות של היבטים שונים של רקמות, כגון מיאלין המעורב בהעברה עצבית. בנוסף, בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות בדרך כלל לכימות מיאלין, ניתן גם להגדיר את CARS כך שיהיה תואם לטכניקות אימונופלואורסצנטיות, מה שמאפשר תיוג משותף עם סמנים אחרים כגון תעלות נתרן או רכיבים אחרים של העברה סינפטית. שינויים במיאלינציה הם מנגנון חשוב מטבעו במחלות דה-מיאלינציה כגון טרשת נפוצה או מצבים נוירולוגיים אחרים כגון תסמונת X שביר או הפרעות בספקטרום האוטיזם הוא תחום מחקר מתפתח. לסיכום, ניתן להשתמש ב-CARS בדרכים חדשניות כדי לענות על שאלות בוערות במדעי המוח ולספק ראיות למנגנונים בסיסיים הקשורים למצבים נוירולוגיים רבים ושונים.

אחד היתרונות הגדולים ביותר של מיקרוסקופיית CARS על פני טכניקות אחרות הוא התאימות עם הדמיה פלואורסצנטית23. איור 1 מראה את ספקטרום ה-CARS בהשוואה ל-Nissl המתויג עם סמן אימונופלואורסצנטי המציג חפיפה מועטה/ללא חפיפה בספקטרה. איור 2 ממחיש את מערך הלייזר עב?...

Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

טכניקה זו יכולה לדמות מיאלין בקטעי רקמת המוח. מיאלינציה ממלאת תפקיד חשוב בהולכה של פוטנציאל פעולה והבנת המיאלין תעזור לנו להבין את תפקוד המוח. היתרון העיקרי של טכניקת CARS על פני, למשל, מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא ש- CARS היא טכניקת מיקרוסקופיה קלה, וניתן לשלב אותה בקלות עם הדמיה פלואורסצנטית אחרת, כגון המשמשת באימונוהיסטוכימיה.מספר מצבים רפואיים נובעים משינויים במיאלינציה, למשל, טרשת נפוצה, הזדקנות ואוטיזם. הבנת השינויים הללו תעזור לנו להבין את הבעיות הרפואיות הבסיסיות. במקרה זה, לייזר CARS מכוון לתמונה שומנים או, במיוחד, אג"ח CH2.במוח, המקור הגדול ביותר של שומנים הוא המיאלין. לכן, זוהי טכניקה כדי לדמיין מיאלין ברקמת המוח. זה צריך להיות אפשרי להשתמש באותה שיטה עבור סוגים אחרים של רקמות כאשר הדמיה שומנים הוא עניין.כוונון ויישור לייזר CARS דורש מומחיות משמעותית, והוא מבוצע בצורה הטובה ביותר על ידי מומחה לייזר או מיקרוסקופיה קלה. לאחר הכנת הרקמות כפי שמתואר בכתב היד, יש להכתים חתכים שצפים בחופשיות עבור משקעי ניסל ונוגדנים כדי לדמיין את גופי התאים, ולאחר מכן לדגור את החלקים על שייקר מעבדה סטנדרטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לפני הבאת הדגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר ה- CARS למשך שעה אחת לפחות, ולאחר מכן יישר את לייזר ה- CARS על ידי חפיפה מרחבית של קרני הלייזר של המשאבה והסטוקס, וכוונן את ההשהיה בין שתי קרני הלייזר.צבעו את אופטיקת המעבה ואת הסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדמית, ולאחר מכן התאימו את הפריסקופ החיצוני כך שירכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ. לזיהוי הטוב ביותר של CARS קדימה ללא ייבוש. ודא שהמעבה מתפתה בצבע.עבור אימונופלואורסצנציה, הדמיה קונפוקלית והדמיית מכוניות, התאימו את לייזר ה-CARS עם גלאים קדמיים ואפי-CARS שאינם מנוקבים על ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיית פלואורסצנציה. כעת, הניחו את החלקים בצלחת תרבית עם תחתית מחליק כיסוי, ו- PBS כדי למנוע ייבוש הרקמה. כמו כן, השתמש במשקל זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי להחליק.באמצעות ממשק המשתמש הגרפי, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה עבור מכוניות והדמיית פלואורסצנציה של טילים. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, מקדו את הדגימה ותפסו את התמונות. טווח הספקטרום של CARS נע בין 640 ל-660 ננומטר, ונראה שאין חפיפה בספקטרום עם סמן אימונופלואורסצנטי המתויג על-ידי ניסל, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש באותות CARS עם אותות אימונופלואורסצנטיים.ניסל שימשה להדמיה של גופי התאים של מוחות גרביל ועכברים מונגולים, וההדמיה של CARS שימשה להמחשת מעטפת המיאלין, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו על פני מינים שונים. שתי קבוצות התמונות מציגות מקטע של הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז בגזע המוח. הרזולוציה של CARS נמוכה יותר מאשר במיקרוסקופ אלקטרונים והיא בסדר גודל של כמה מאות ננומטרים.ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית, כגון ImageJ כדי לכמת את הפרמטרים המעניינים, למשל, עובי או אורך המיאלין.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...