Name: coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

NIH R01 DC 17924、R01 DC 18401 (Klug)、NIH 1R15HD105231-01、T32DC012280、FRAXA (McCullagh) でサポートされています。CARSイメージングは、NIH P30 NS048154およびNIH P30 DK116073によって部分的にサポートされているコロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのニューロテクノロジーセンターの高度な光学顕微鏡コア部分で実行されました。

すべての実験は、適用されるすべての法律、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、コロラド大学アンシュッツ施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.動物
<ol><li>ジャクソン研究所から入手したC57BL/6J(ストック#000664)マウス(Mus musculus )またはチャールズリバーから入手したモンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)を使用して?...

<ol>
	<li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity.">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li><li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow.">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li><li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+computations.">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).</li><li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept.">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li><li>Waxman, S. 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L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination.">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li><li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+myelin.">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li><li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+in+development,+myelin+generation+and+beyond.">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424 (2019).</li><li>Saab, A. S., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+dynamics:+protecting+and+shaping+neuronal+functions.">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li><li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS?+A+theoretical+approach.">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).</li><li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing.">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073 (2015).</li><li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem.">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li><li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+NG2++glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer.">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li><li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li><li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+(ReBUILD):+a+randomised,+controlled,+double-blind,+crossover+trial.">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).</li><li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders.">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li><li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+deletion+of+Gtf2i,+associated+with+Williams+syndrome,+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug.">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li><li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder.">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li><li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues.">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li><li>Kim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains.">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li><li>. Fluorescence SpectraViewer Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022)</li><li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+centrale+geh&#246;rleitung.">Die centrale geh&#246;rleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis.">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825 (2019).</li><li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration.">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).</li><li>K&#250;tna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model.">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li><li>Ozsv&#225;r, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas.">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li><li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown.">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li><li>B&#233;gin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue.">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li></ol>

ますます多くの文献が脳機能におけるミエリンの役割を強調しています13,16,21,28。さらに、髄鞘形成の厚さと髄鞘形成パターンは、多発性硬化症(29でレビュー)、老化(30でレビュー)、自閉症20,31などのいくつかの神経学的</...

活動電位は脳内の情報の基本単位であり、軸索を介した活動電位の伝播は情報処理の1つの柱を形成します1,2,3。ニューロンは、典型的には、複数の他のニューロンから求心性入力を受け取り、所与の狭い時間窓内でこれらの入力を統合する4,5。したがって、軸索における潜在的な伝播のメカニズムは、研究者からかなりの注目を集めています。
軸索を伝播する場合、活動電位は軸索に沿って繰り返し再生され、信頼性の高い伝播が保証されます6。顎脊椎動物(グナトストーム)のほとんどのニューロンでは、軸索は、グリア細胞の一種である近くの希突起膠細胞またはシュワン細胞によって産生される脂質が豊富な物質であるミエリンの鞘に囲まれています(7,8でレビュー)。このミエリン鞘は軸索を電気的に絶縁し、その静電容量を低減し、活動電位の伝播を効率的、迅速、そしてより低いエネルギー消費で可能にする。ミエリンは軸索を均一に覆うわけではありませんが、Ranvierの節と呼ばれる、それらの間に短いギャップがあるセグメントで軸索を覆います(9,10でレビュー)。軸索の電気的絶縁レベルを制御する髄鞘形成の厚さと、軸索に沿って活動電位が再生される頻度を制御するランビエの節の間隔の両方が、活動電位伝播の速度に影響を与えます(11でレビュー)。
髄鞘形成の厚さが軸索12,13,14の活動電位伝播速度に影響を与えることを示唆する文献が多数ある。さらに、軸索髄鞘形成の変化は、多数のCNS欠損をもたらし得る15、16、17、18、19、20、21。したがって、多くの研究努力の焦点が軸索髄鞘形成の測定と特性評価を含むことは驚くべきことではありません。ミエリンの厚さの測定は、電子顕微鏡で最も一般的に行われてきましたが、これは大量の組織調製を必要とし、免疫組織化学と組み合わせて使用するのが難しい技術です。ただし、コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)に基づく軸索髄鞘形成を測定するためのより高速で簡単な技術もあります。CARSレーザは、様々な周波数に同調することができ、脂質を励起するのに適した周波数に同調すると、追加の標識22を必要とせずにミエリンを画像化することができる。脂質画像化は、脂質をいくつかの蛍光チャネル23と共に画像化することができるように、標準的な免疫組織化学と組み合わせることができる。CARSによる髄鞘形成のイメージングは、電子顕微鏡法よりも有意に高速であり、EMよりも低いものの、同じタイプの軸索における髄鞘形成のわずかな違いを検出するのに十分な分解能を有する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5&#34;</td>
			<td>Exel int</td>
			<td>260040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal +</td>
			<td>Vortech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - 8mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF994 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 23 GA x 1&#34;</td>
			<td>BD precision glide</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump with variable flow or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumphosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL vial with 4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>230331000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass or plastic tray, approximately 10&#34; x 10&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, plant</td>
			<td>RPI</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>well plate</td>
			<td>Alkali Sci.</td>
			<td>TPN1048-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1n 1,000 mL of Millipore H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered (PB):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosohate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>A2153-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>x100-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nissl 435/455</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE&#160;picoemerald laser</td>
			<td>Angewandte Physik &#38; Elektronik&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (420-520 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ470/100m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (500-530 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ515/30m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filters (640-680 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ660/40m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Transfer pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 565 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>565dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 585 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>585dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic shortpass 750 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T750spxrxt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)</td>
			<td>Allen Scientific Glass Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton shortpass emission filter 680 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET680sp-2p8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices

コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)は、分子の特徴的な振動のコヒーレント信号を生成するために化学者や物理学者によって古典的に採用されている技術です。ただし、これらの振動特性は、脳などの解剖学的組織内の分子にも特徴的であり、神経科学アプリケーションにますます有用で適用可能になっています。たとえば、CARSは、これらの分子内の化学結合を特異的に励起することによって脂質を測定でき、神経伝達に関与するミエリンなど、組織のさまざまな側面を定量化できます。さらに、ミエリンの定量に通常使用される他の技術と比較して、CARSは免疫蛍光技術と互換性があるように設定することもでき、ナトリウムチャネルやシナプス伝達の他の成分などの他のマーカーとの共標識を可能にします。髄鞘形成の変化は、多発性硬化症などの脱髄疾患、または脆弱X症候群や自閉症スペクトラム障害などの他の神経学的状態において本質的に重要なメカニズムであり、新たな研究分野です。結論として、CARSは革新的な方法で神経科学の差し迫った質問に答え、多くの異なる神経学的状態に関連する根本的なメカニズムの証拠を提供することができます。

他の技術に対するCARS顕微鏡の最大の利点の1つは、蛍光イメージングとの互換性です23。 図1 は、免疫蛍光マーカーでタグ付けされたNisslと比較したCARSスペクトルを示しており、スペクトルの重複はほとんどまたはまったくありません。 図2 は、共焦点顕微鏡と組み合わせたCARS用のレーザーセットアップを示しています。 <strong cl...

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Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

髄鞘形成を視覚化することは、神経系を研究する多くの研究者にとって重要な目標です。CARSは、ミエリンなどの特殊な構造を照らす脳などの組織内の脂質をネイティブにイメージングできる免疫蛍光法に対応した技術です。

コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

この技術は、脳組織切片中のミエリンを画像化することができる。髄鞘形成は活動電位の伝導に重要な役割を果たしており、ミエリンを理解することは脳機能を理解するのに役立ちます。例えば、電子顕微鏡法に対するCARS技術の主な利点は、CARSが光学顕微鏡技術であり、免疫組織化学で使用されるような他の蛍光イメージングと容易に組み合わせることができることである。いくつかの病状は、多発性硬化症、加齢、自閉症などの髄鞘形成の変化によるものです。これらの変化を理解することは、根本的な病状を理解するのに役立ちます。この場合、CARSレーザーは脂質、具体的にはCH2結合を画像化するように調整されます。脳では、脂質の最大の供給源はミエリンです。したがって、これは脳組織中のミエリンを画像化する技術である。脂質のイメージングが関心のある場合は、他の種類の組織にも同じ方法を使用できるはずです。CARSレーザーのチューニングとアライメントにはかなりの専門知識が必要であり、レーザーまたは光学顕微鏡の専門家が行うのが最適です。原稿に記載されているように組織を調製した後、細胞体を視覚化するためにニセルおよび抗体培地のために浮遊切片を染色し、次いで標準的な実験室用シェーカーで室温で30分間インキュベートする。サンプルを顕微鏡に持ち込む前に、CARSレーザーの電源を入れて少なくとも1時間ウォームアップし、ポンプとストークスレーザービームを空間的に重ね合わせてCARSレーザーを位置合わせし、2つのレーザービーム間の遅延を調整します。コンデンサー光学系と顕微鏡のダイアフラムを前方CARSイメージング用に着色し、外部潜望鏡を調整して、空間的に重なり合った2つのレーザーを顕微鏡のスキャンヘッドミラーの中央に配置します。最高の前方CARS非スキャン検出のために。コンデンサーが色に誘われていることを確認してください。免疫蛍光、共焦点イメージング、およびCARイメージングでは、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込むことにより、CARSレーザーを前方およびエピCARS非デススキャン検出器の両方に適合させます。次に、切片をカバースリップ底のある培養皿に入れ、組織の乾燥を避けるためにPBSを入れます。また、ガラスの重りを使用して、ティッシュをカバースリップの近くに保ちます。グラフィックユーザーインターフェイスを使用して、自動車およびミサイル蛍光共焦点イメージングの画像取得パラメータを設定します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、サンプルに焦点を合わせて画像をキャプチャします。CARSのスペクトルは640〜660ナノメートルの範囲であり、ナイセルタグ付き免疫蛍光マーカーとのスペクトルの重複はないようであり、CARSシグナルを免疫蛍光シグナルで使用できることを示しています。Niselはモンゴルスナネズミとマウスの脳の細胞体を視覚化するために使用され、CARSのイメージングはミエリン鞘を視覚化するために使用され、この技術が種を超えて使用できることを示しています。両方の画像セットは、脳幹の台形体の内側核のセクションを示しています。CARSの分解能は電子顕微鏡よりも低く、数百ナノメートルのオーダーです。画像は、ImageJなどの標準的な画像解析ソフトウェアで分析して、目的のパラメータ、例えばミエリンの厚さまたは長さを定量化することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...