Name: coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

Stöds av NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) och NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 och FRAXA (McCullagh). CARS-avbildningen utfördes i Advanced Light Microscopy Core-delen av NeuroTechnology Center vid University of Colorado Anschutz Medical Campus som delvis stöds av NIH P30 NS048154 och NIH P30 DK116073.

Alla experiment följde alla tillämpliga lagar, National Institutes of Health riktlinjer och godkändes av University of Colorado Anschutz Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Djur
<ol><li>Använd C57BL/6J (stock #000664) möss (Mus musculus ) erhållna från Jackson Laboratory eller mongoliska gerbiler (Meriones unguiculatus) som ursprungligen erhållits från Charles River.</li>
</ol>2. Vävnadsberedning<...

<ol>
	<li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity.">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li><li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow.">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li><li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+computations.">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).</li><li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept.">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li><li>Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+and+design+principles+of+axons.">Integrative properties and design principles of axons.</a> International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).</li><li>Fitzhugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computation+of+impulse+initiation+and+saltatory+conduction+in+a+myelinated+nerve+fiber.">Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber.</a> Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).</li><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).</li><li>Salzer, J. L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination.">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li><li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+myelin.">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li><li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+in+development,+myelin+generation+and+beyond.">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424 (2019).</li><li>Saab, A. S., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+dynamics:+protecting+and+shaping+neuronal+functions.">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li><li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS?+A+theoretical+approach.">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).</li><li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing.">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073 (2015).</li><li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem.">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li><li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+NG2++glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer.">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li><li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li><li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+(ReBUILD):+a+randomised,+controlled,+double-blind,+crossover+trial.">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).</li><li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders.">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li><li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+deletion+of+Gtf2i,+associated+with+Williams+syndrome,+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug.">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li><li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder.">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li><li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues.">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li><li>Kim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains.">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li><li>. Fluorescence SpectraViewer Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022)</li><li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+centrale+geh&#246;rleitung.">Die centrale geh&#246;rleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis.">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825 (2019).</li><li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration.">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).</li><li>K&#250;tna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model.">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li><li>Ozsv&#225;r, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas.">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li><li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown.">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li><li>B&#233;gin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue.">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li></ol>

En växande mängd litteratur betonar myelins roll i hjärnans funktion 13,16,21,28. Dessutom vet vi att myelineringstjocklek och myeliniseringsmönster kan förändras vid flera neurologiska tillstånd som multipel skleros (granskad i29), åldrande (granskad i 30), autism20,31 och många andra....

Åtgärdspotentialer är den grundläggande enheten för information i hjärnan, och handlingspotentialutbredning genom axoner utgör en pelare i informationsbehandling 1,2,3. Neuroner tar vanligtvis emot afferenta ingångar från flera andra neuroner och integrerar dessa ingångar inom ett givet smalt tidsfönster 4,5. Därför har verkningsmekanismerna potentiell förökning i axoner fått en betydande uppmärksamhet från utredare.
Vid förökning genom en axon regenereras en åtgärdspotential upprepade gånger längs axonen för att säkerställa tillförlitlig förökning6. I de flesta neuroner av käkade ryggradsdjur (gnathostomer) är axoner omgivna av en mantel av myelin, som är en lipidrik substans som produceras av närliggande oligodendrocyter eller Schwann-celler, som är typer av gliaceller (granskad i 7,8). Denna myelinmantel isolerar axonen elektriskt, minskar dess kapacitans och möjliggör utbredning av åtgärdspotential effektivt, snabbt och med lägre energiförbrukning. Myelin täcker inte axonen enhetligt, men den mantlar axonen i segment som har korta luckor mellan dem, kallade Ranviers noder (granskad i 9,10). Både myelineringstjocklek, som styr nivån på elektrisk isolering av en axon, och avståndet mellan Ranviers noder, som styr frekvensen med vilken åtgärdspotentialer regenereras längs en axon, påverkar hastigheten på åtgärdspotentialutbredningen (granskad i11).
Det finns en stor mängd litteratur som tyder på att myeliniseringstjockleken påverkar hastigheten på åtgärdspotentialutbredningen i axoner12,13,14. Dessutom kan förändringar i axonmyelinisering resultera i ett antal CNS-underskott 15,16,17,18,19,20,21. Det är därför inte förvånande att fokus för många forskningsinsatser involverar mätning och karakterisering av axonmyelinisering. Mätningar av myelintjocklek har oftast gjorts med elektronmikroskopi, en teknik som kräver en betydande mängd vävnadsberedning och är utmanande att använda i kombination med immunhistokemi. Det finns dock också en snabbare och enklare teknik för att mäta axonmyelinisering som bygger på Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). En CARS-laser kan ställas in på olika frekvenser och när den är inställd på frekvenser som är lämpliga för att excitera lipider kan myelin avbildas utan behov av ytterligare etiketter22. Lipidavbildningen kan kombineras med standardimmunhistokemi så att lipider kan avbildas tillsammans med flera fluorescerande kanaler23. Avbildningsmyelinering med CARS är betydligt snabbare än elektronmikroskopi och har en upplösning som, om än lägre än EM, är tillräcklig för att upptäcka även små skillnader i myelinering i samma typ av axoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5&#34;</td>
			<td>Exel int</td>
			<td>260040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal +</td>
			<td>Vortech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - 8mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF994 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 23 GA x 1&#34;</td>
			<td>BD precision glide</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump with variable flow or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumphosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL vial with 4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>230331000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass or plastic tray, approximately 10&#34; x 10&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, plant</td>
			<td>RPI</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>well plate</td>
			<td>Alkali Sci.</td>
			<td>TPN1048-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1n 1,000 mL of Millipore H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered (PB):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosohate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>A2153-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>x100-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nissl 435/455</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE&#160;picoemerald laser</td>
			<td>Angewandte Physik &#38; Elektronik&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (420-520 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ470/100m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (500-530 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ515/30m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filters (640-680 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ660/40m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Transfer pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 565 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>565dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 585 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>585dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic shortpass 750 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T750spxrxt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)</td>
			<td>Allen Scientific Glass Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton shortpass emission filter 680 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET680sp-2p8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices

Koherent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) är en teknik som klassiskt används av kemister och fysiker för att producera en sammanhängande signal om signaturvibrationer av molekyler. Dessa vibrationssignaturer är emellertid också karakteristiska för molekyler i anatomisk vävnad som hjärnan, vilket gör den alltmer användbar och tillämplig för neurovetenskapliga applikationer. Till exempel kan CARS mäta lipider genom specifikt spännande kemiska bindningar inom dessa molekyler, vilket möjliggör kvantifiering av olika aspekter av vävnad, såsom myelin som är involverat i neurotransmission. Dessutom, jämfört med andra tekniker som vanligtvis används för att kvantifiera myelin, kan CARS också ställas in för att vara kompatibelt med immunofluorescerande tekniker, vilket möjliggör sammärkning med andra markörer såsom natriumkanaler eller andra komponenter för synaptisk överföring. Myeliniseringsförändringar är en i sig viktig mekanism vid demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros eller andra neurologiska tillstånd som bräckligt X-syndrom eller autismspektrumstörningar är ett framväxande forskningsområde. Sammanfattningsvis kan CARS användas på innovativa sätt för att svara på pressande frågor inom neurovetenskap och ge bevis för underliggande mekanismer relaterade till många olika neurologiska tillstånd.

En av de största fördelarna med CARS-mikroskopi jämfört med andra tekniker är kompatibiliteten med fluorescerande avbildning23. Figur 1 visar CARS-spektra jämfört med Nissl taggade med immunofluorescerande markör som visar liten / ingen överlappning i spektra. Figur 2 illustrerar laseruppsättningen för CARS i kombination med konfokalmikroskopi. Figur 3 visar två representativa bilder, en som en en...

Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Att visualisera myelinisering är ett viktigt mål för många forskare som studerar nervsystemet. CARS är en teknik som är kompatibel med immunofluorescens som naturligt kan avbilda lipider i vävnad som hjärnan som belyser specialiserade strukturer som myelin.

Koherent Anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) Ansökan om avbildningsmyelinering i hjärnskivor

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Denna teknik kan avbilda myelin i hjärnvävnadssektioner. Myelinering spelar en viktig roll i ledningen av åtgärdspotentialer och förståelse av myelin hjälper oss att förstå hjärnans funktion. Den största fördelen med CARS-tekniken jämfört med till exempel elektronmikroskopi är att CARS är en ljusmikroskopiteknik, och lätt kan kombineras med annan fluorescensavbildning, såsom används i immunhistokemi.Flera medicinska tillstånd beror på förändringar i myelinering, till exempel multipel skleros, åldrande och autism. Att förstå dessa förändringar hjälper oss att förstå de underliggande medicinska tillstånden. I detta fall är CARS-lasern inställd på bildlipider eller specifikt CH2-bindningar.I hjärnan är den största källan till lipider myelin. Således är detta en teknik för att avbilda myelin i hjärnvävnad. Det bör vara möjligt att använda samma metod för andra typer av vävnad när avbildning av lipider är av intresse.Att ställa in och justera CARS-lasern kräver betydande expertis och utförs bäst av en laser- eller ljusmikroskopiexpert. Efter beredning av vävnaderna enligt beskrivningen i manuskriptet, fläcka fritt flytande sektioner för nisel och antikroppsmedier för att visualisera cellkroppar och inkubera sedan sektionerna på en vanlig laboratorieskakare i 30 minuter vid rumstemperatur. Innan du tar proverna till mikroskopet, slå på och värm upp CARS-lasern i minst en timme, justera sedan CARS-lasern genom att rumsligt överlappa pumpen och stokes laserstrålar och justera fördröjningen mellan de två laserstrålarna.Färglägg kondensoroptiken och membranet i mikroskopet för framåtriktad CARS-avbildning och justera sedan det yttre periskopet för att centrera de rumsligt överlappade två lasrarna på mikroskopets svephuvudspeglar. För bästa framåtriktade CARS icke-avskannade detektering. Se till att kondensorn är färglockad.För immunofluorescens, konfokal avbildning och bilavbildning, passa CARS-lasern med både framåtriktade och epi CARS icke-avkodade detektorer genom att införliva ett konfokalmikroskop utrustat med synliga lasrar för fluorescensavbildning. Lägg nu sektionerna i en odlingsskål med en täckglidningsbotten och PBS för att undvika att torka vävnaden. Använd också en glasvikt för att hålla vävnaden nära locket.Använd det grafiska användargränssnittet för att ställa in bildförvärvsparametrarna för bilar och missilfluorescenskonfokal avbildning. Placera provet på mikroskopstadiet, fokusera provet och ta bilderna. CARS'spektra sträcker sig från 640 till 660 nanometer och det verkar inte finnas någon överlappning i spektra med nisel-taggad immunofluorescerande markör, vilket indikerar att CARS-signaler kan användas med immunofluorescerande signaler.Nisel användes för att visualisera cellkropparna i mongoliska gerbil- och mushjärnor, och CARS'imaging användes för att visualisera myelinhöljet, vilket indikerar att denna teknik kan användas över arter. Båda uppsättningarna bilder visar en del av den mediala kärnan i trapetskroppen i hjärnstammen. Upplösningen av CARS är lägre än med elektronmikroskop och är i storleksordningen flera hundra nanometer.Bilderna kan analyseras med standardprogramvara för bildanalys, till exempel ImageJ för att kvantifiera parametrarna av intresse, till exempel myelintjocklek eller längd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

En snabb metod för högupplöst fluorescens avbildning i semi-Tjock hjärnan skivor

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Lokal applicering av läkemedel att studera Nicotinic Funktion acetylkolinreceptorn i skivor mushjärna

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enhet inspelning Metoder för att karaktärisera neural aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretsar

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...