Name: expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples at JoVE.com

המחברים מודים לדון נורווד משירותי עריכה, מהספרייה הרפואית למחקר ב- MD Anderson על עריכת מאמר זה ומהמעבדה לאימונופלואורסצנציה וניתוח תמונות במחלקה לפתולוגיה מולקולרית תרגומית ב- MD Anderson. פרסום זה נבע בחלקו ממחקר שהתאפשר על ידי התמיכה המדעית והכספית במרכזי הניטור והניתוח של מערכת החיסון לסרטן - רשת הנתונים האימונולוגיים של הסרטן (CIMAC-CIDC) שסופקו באמצעות הסכם שיתוף הפעולה של המכון הלאומי לסרטן (NCI) (U24CA224285) למרכז הסרטן של אוניברסיטת טקסס MD Anderson מרכז לניטור וניתוח חיסונים לסרטן (CIMAC).

דגימות רקמה התקבלו למטרות מחקר בהתאם למועצת הביקורת המוסדית של מרכז הסרטן MD Anderson של אוניברסיטת טקסס, והדגימות בוטלו עוד יותר.
1. בחירת נוגדנים
<ol><li>הגדר את שאלות המחקר כדי לבחור את שיבוטי הנוגדנים הטובים ביותר הזמינים. השתמש באטלס החלבונים האנושיים, במחקרים שפורסמ...

<ol>
	<li>Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+tumour+microenvironment.">Beyond the tumour microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).</li><li>Galli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+immune+cell+and+tumor+microenvironment+imaging+in+the+new+era+of+immunotherapy.">Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).</li><li>Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+approaches+for+characterizing+the+tumor+immune+microenvironment.">Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment.</a> Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).</li><li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+Divide+and+conquer.">Cell sorting: Divide and conquer.</a> Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).</li><li>Scognamiglio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+assay+to+evaluate+the+melanoma+tumor+microenvironment.">Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment.</a> Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).</li><li>Guo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+34-marker+panel+for+imaging+mass+cytometric+analysis+of+human+snap-frozen+tissue.">A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue.</a> Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).</li><li>Fu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+architecture+of+the+immune+microenvironment+orchestrates+tumor+immunity+and+therapeutic+response.">Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 98 (2021).</li><li>Rost, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+analysis+for+quantitation+of+protein+expresssion+in+cancer+tissue+sections.">Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).</li><li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+tumor-immune+microenvironment+in+triple+negative+breast+cancer+revealed+by+multiplexed+ion+beam+imaging.">A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging.</a> Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).</li><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+formalin-fixed,+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine:+An+evidence-based+review+and+conclusion.">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design.">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Rad, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pandora's+box+of+novel+technologies+that+may+revolutionize+lung+cancer.">The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.</a> Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+(MIBI)+for+characterization+of+the+tumor+microenvironment+across+tumor+types.">Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types.</a> Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).</li></ol>

ההבהרה המקיפה של יחסי הגומלין המורכבים והמורכבים בין המרכיבים המרובים של TME נותרה מטרה מרכזית בחקר הסרטן. היצרנים הציגו מבחנים מרובים רבים כחלק ממאמץ זה, במיוחד במהלך 5 השנים האחרונות. ניתוח מרחבי מרובב הוא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה המאפשר סיווג סימולטני של מספר מטרות תוך שמירה על מורפולוגי?...

חשיבותם של סוגי התאים הרבים המקיפים את אוכלוסיות הגידול הקלונלי היא מרכיב מכריע בסיווג של קרצינוגנזה. העניין בהבהרת הרכב המיקרו-סביבה של הגידול (TME) והאינטראקציות איתו עלה ברציפות בעקבות הקמת טיפול מבוסס חיסון כחלק מארסנל הטיפול בסרטן. לכן, אסטרטגיות הטיפול עברו מגישה ממוקדת גידול לגישה ממוקדת TME1.
המאמצים להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון במעקב אחר גידולים ובהתפתחות סרטן עלו באופן בולט בשנים האחרונות 2,3. במחקר הרפואי, שפע של שיטות, כולל שיטות מבוססות ציטומטריה וטכנולוגיות הדמיה של סינגלפלקס ומולטיפלקס, נוצרו כחלק מניסיון זה לפענח את האינטראקציות הייחודיות של אלמנטים מרובים של TMEs.
שיטות חלוציות כגון ציטומטריה של זרימה (שהומצאה בשנות ה-60 של המאה ה-20), מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה וציטומטריה המונית מתמקדות בעיקר בזיהוי וכימות רכיבי TME4. אף על פי שטכניקות כמותיות מבוססות ציטומטריה מאפשרות פנוטיפ של הנוף החיסוני, קביעת ההתפלגות המרחבית של התאים אינה אפשרית. לעומת זאת, שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית של סינגלפלקס משמרות את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרות לחוקרים לנתח את התפלגות התאים, אם כי מספר מופחת של מטרות בחלק רקמה אחת הוא מגבלה של שיטות אלה 5,6. במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות הדמיה מרובות עבור רזולוציה של תא יחיד כגון אימונופלואורסצנציה מרובה, הדמיית ברקוד פלואורסצנטי וספקטרומטריית מסה הדמיה התפתחו כאסטרטגיות מקיפות להשגת מידע על צביעת סמנים בו זמנית באמצעות אותה רקמה סעיף7.
כאן אנו מציגים טכנולוגיה המשלבת נוגדנים מתויגים במתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית ומאפשרת כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים (פנוטיפינג) ואנליזה מרחבית באמצעות פורמלין קבוע, משובץ פרפין (FFPE) ודגימות רקמה קפואות טריות (FF) 8,9. דגימות FFPE הן החומרים הנפוצים ביותר עבור דגימות ארכיון רקמות ומייצגות משאב זמין יותר עבור טכנולוגיות הדמיה מרובות מאשר דגימות קפואות טריות10. בנוסף, טכנולוגיה זו מציעה את האפשרות לרכוש מחדש תמונות חודשים לאחר מכן. כאן נדון בפרוטוקולי הצביעה ועיבוד התמונה שלנו באמצעות דגימות רקמות FFPE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS-T</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Low-Barium PBS pH 7.4</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris pH 8.5&#160;</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>REVCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Ultrafree-MC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized H2O</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Jar, Green</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71385-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Jar, Yellow</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71385-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71388-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Stainless Steel Holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 70% EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant slide chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62705-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBI/O software</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIcontrol software</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIslide</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIscope</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture Chamber (Humid Chamber)</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M922-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT Module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>097403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>BioRocker</td>
			<td>S2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1&#956;m )</td>
			<td>MillQ</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum Cabinet Desiccator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task-whipe</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples

ההתקדמות בטיפולים מבוססי חיסון חוללה מהפכה בטיפול בסרטן ובמחקר. זה עורר ביקוש הולך וגובר לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. למרות שאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית מתאימה לחקר ארכיטקטורת רקמות, היא מוגבלת לניתוח של מספר קטן של סמנים. לעומת זאת, טכניקות כגון ציטומטריה של זרימה יכולות להעריך סמנים מרובים בו זמנית, אם כי מידע על מורפולוגיה של רקמות הולך לאיבוד. בשנים האחרונות, אסטרטגיות מרובות המשלבות ניתוח פנוטיפי ומרחבי התפתחו כגישות מקיפות לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. במאמר זה נדון בטכנולוגיה חדשנית המשלבת נוגדנים בעלי תווית מתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית המתמקדת בשלבים הטכניים בפיתוח ואופטימיזציה של בדיקות, הכנת רקמות ורכישה ועיבוד תמונה. לפני הצביעה, יש לפתח פאנל נוגדנים עם תווית מתכת ולייעל. מערכת תמונה גבוהה זו תומכת בעד 40 נוגדנים המתויגים במתכת במקטע רקמה אחד. שימו לב, הסיכון להפרעות אות עולה עם מספר הסמנים הכלולים בלוח. לאחר תכנון הפאנל, יש לתת תשומת לב מיוחדת להקצאת איזוטופ המתכת לנוגדן כדי למזער הפרעה זו. בדיקת פאנל ראשונית מתבצעת באמצעות תת-קבוצה קטנה של נוגדנים ולאחר מכן בדיקה של הלוח כולו ברקמות הבקרה. מקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין, מתקבלים ומותקנים על שקופיות מצופות זהב ומוכתמות עוד יותר. ההכתמה אורכת יומיים ודומה מאוד לצביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית. לאחר שהדגימות מוכתמות, הן ממוקמות במכשיר רכישת התמונה. שדות תצוגה נבחרים, ותמונות נרכשות, מועלות ומאוחסנות. השלב הסופי הוא הכנת התמונה לסינון והסרת הפרעות באמצעות תוכנת עיבוד התמונה של המערכת. חסרון של פלטפורמה זו הוא היעדר תוכנה אנליטית. עם זאת, התמונות שנוצרו נתמכות על ידי תוכנות פתולוגיה חישוביות שונות.

מקטעי רקמת TMA של שקדים וריאות אדנוקרצינומה (בעובי 5 מ"מ) התקבלו והונחו על אמצע שקופיות מצופות זהב בהתאם למפרטים לגבי גודל הרקמה והשוליים הבטוחים של השקופיות. שולי זכוכית חופשיים של 5 מ"מ ו -10 מ"מ בין קצה הרקמה לבין הגבולות הצדדיים והנחותים של שקופיות הזכוכית, בהתאמה, נחוצים להכתמה אופטימלית. ח...

Watch this Scientific Journal Video about Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples at JoVE.com

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

בעידן האימונותרפיה של הסרטן, העניין בהבהרת הדינמיקה של מיקרו-סביבה של הגידול גדל באופן בולט. פרוטוקול זה מפרט טכניקת הדמיה של ספקטרומטריית מסה ביחס לשלבי הצביעה וההדמיה שלה, המאפשרים אנליזה מרחבית מרובבת מאוד.

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

פרוטוקולים אלה מאפשרים כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים וניתוח מיוחד באמצעות דגימות רקמה קפואה קבועה פורמלין ומשובצת פרפין כדי להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון בסרטן. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר אפיון בו זמנית של סמן 40 על קטע רקמה בודד, באופן נרחב לשמר את מבנה הרקמה בדגימות. השלב הקריטי הוא אופטימיזציה ואימות של נוגדנים.אי השלמת השלב, עלולה לגרום לתמונות באיכות נמוכה שעלולות לפגוע בשמירה על נתונים ותוצאות הניתנים לשחזור באיכות גבוהה. התחל על ידי סיבוב כל הנוגדנים המכילים צינורות ב 10, 000 x G במשך חמש דקות, להוסיף נוגדנים בודדים למאגר החוסם ומערבבים היטב. אין להפריע לתחתית צינור הנוגדנים בעת ניקופו.סנן את לוח הנוגדנים על ידי הרטבה מראש של מכשיר מסנן צנטריפוגלי בגודל 0.1 מיקרומטר עם 100 מיקרוליטרים של מאגר חוסם. סובב את המסנן ב 10, 000 x G במשך שתי דקות ולהסיר את זרימת המאגר החוסם דרך עם פיפטה. לאחר מכן העבר את לוח הנוגדנים לעמודת ספין וסובב את המסנן ב 10, 000 x G למשך שתי דקות.השליכו את עמודת הסיבוב והשתמשו בזרימה כחלונית הנוגדנים המסוננת. לצביעת הנוגדנים, הסר את המאגר החוסם מהשקופיות על ידי הטיית כל שקופית על צדה והקשה עדינה על הקצוות כנגד מגב משימה. מניחים את השקופיות בתא לחות ומוסיפים 100 עד 200 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר נוגדנים לרקמה.הוסיפו שקופיות בקרה חיוביות ושליליות לאצווה המכתימה ודגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להגדיר את המכשיר, היכנס לתוכנת הבקרה ולחץ על Wake Up, אם המכשיר נמצא במצב שינה. לחץ על דוגמה של Exchange כדי לטעון שקופית ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לפתוח את הדלת.הנח את השקופית בחריץ הטעינה כאשר דוגמה פונה כלפי מעלה והתווית בצד ימין, לחץ על המשך כדי לסגור את הדלת. בחר את הפרוייקט ולאחר מכן בחר את שם השקופית עבור הדוגמה שנטענה. דמיין את התמונה הפנורמית בחלונית התמונה האופטית של השקופית עבור שדה הראייה או בחירת FOV, לחץ על תפריט מצב ובחר גלאי אלקטרונים משני, ולאחר מכן לחץ על תפריט מצב הדמיה ובחר QC 300 מיקרומטר.לחץ על Jog Stage כדי לשלוט במיקום FOV ולאחר מכן לחץ על החצים כדי לנווט ולבחור את המיקום של ה- FOV. לחץ על הוסף FOV, הגדר 400 מיקרומטר על 400 מיקרומטר כגודל השדה ובחר פיין כמצב הדמיה ואלפית השנייה של זמן השהייה, לחץ על אישור. לאחר יצירת רשימת FOV, המשך למיקוד התמונה והתאם את הסטיגמה על ידי הזזת הקרן לאזור רקמה שלא יהיה בתמונה.התאם את הפרמטרים עד לקבלת תמונה מרכזית ברורה, לחץ על התחל הפעלה. התמונות שנרכשו יועלו ויאוחסנו באופן אוטומטי ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט. המטריצה המוצגת כאן מתארת את אחוז ההצלבה הנגזר מטוהר הבדיקה והתחמוצות.כאן תיבות כחולות מציינות יותר או שוות ל- 0.5% crosstalk ותיבות שקופות מציינות פחות מ- 0.5% crosstalk. עבור תגי Mass, בדיקות שתרמו לפחות 0.5% crosstalk ללא ערוצים, ערוץ אחד או שניים, או יותר משני ערוצים מוצגים כאן. כמו כן מוצגים ערוצים המוניים המקבלים לפחות 0.5% הצלבה ללא גשושיות, גשושית אחת או שתיים, או יותר משתי גשושיות.תמונות הכתמים המייצגות ברקמות שונות כמו אדנוקרצינומה של הריאות, כליות לא ניאופלסטיות ושקדים מתוארות כאן. כאן מוצגת תמונה של מקטע רקמת שקדים המוכתם בטכניקה זו וממחישה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי לפני סינון ותיקון. התמונה של אותו מקטע באותם תנאים לאחר שלבי סינון ותיקון מוצגת כאן.שיטה זו מייצרת תמונות שניתן להעלות לתוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי, ומאפשרת ניתוח מקיף כגון מידור רקמות, סגמנטציה של תאים, ביטוי משותף של סמן, כמו גם ניתוח שכנים וניתוח מרוחק. שיטות הדמיה מולטיפלקס מאוד זמינות באמצעות מחקר. על ידי בניית פאנלים שונים, חוקרים יכולים לחקור דגימות סרטן, נורמליות, פאראנופלסטיות, דלקתיות ומדבקות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

הערכת מיקרוסביבה הגידול של גרורה בתיווך החדירות כלי דם הקשורים להפצת תאים סרטניים באמצעות הדמיה Intravital וניתוח רקמות קבוע

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...