Name: expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples at JoVE.com

Yazarlar, bu makaleyi düzenlediği için Düzenleme Hizmetleri, MD Anderson'daki Araştırma Tıp Kütüphanesi ve MD Anderson'daki Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü'ndeki Multipleks İmmünofloresan ve Görüntü Analizi Laboratuvarı'ndan Don Norwood'a teşekkür etmektedir. Bu yayın kısmen, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) İşbirliği Anlaşması (U24CA224285) aracılığıyla Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kanser İmmün İzleme ve Analiz Merkezi'ne (CIMAC) sağlanan Kanser İmmünolojik Veri Müşterekleri Ağı'na (CIMAC-CIDC) bilimsel ve finansal desteğin kolaylaştırdığı araştırmalardan kaynaklanmıştır.

Doku örnekleri, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu'na uygun olarak araştırma amacıyla elde edildi ve örnekler daha da tanımlandı.
1. Antikor seçimi
<ol><li>Mevcut en iyi antikor klonlarını seçmek için araştırma sorularını tanımlayın. İnsan Protein Atlası, yayınlanmış araştırma ve antikor üreticisi web sitelerini araştırma kaynakları olarak kullanın. NOT: Farklı adımlarda boyanacak yeterli insan doku ko...

<ol>
	<li>Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+tumour+microenvironment.">Beyond the tumour microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).</li><li>Galli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+immune+cell+and+tumor+microenvironment+imaging+in+the+new+era+of+immunotherapy.">Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).</li><li>Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+approaches+for+characterizing+the+tumor+immune+microenvironment.">Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment.</a> Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).</li><li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+Divide+and+conquer.">Cell sorting: Divide and conquer.</a> Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).</li><li>Scognamiglio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+assay+to+evaluate+the+melanoma+tumor+microenvironment.">Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment.</a> Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).</li><li>Guo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+34-marker+panel+for+imaging+mass+cytometric+analysis+of+human+snap-frozen+tissue.">A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue.</a> Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).</li><li>Fu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+architecture+of+the+immune+microenvironment+orchestrates+tumor+immunity+and+therapeutic+response.">Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 98 (2021).</li><li>Rost, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+analysis+for+quantitation+of+protein+expresssion+in+cancer+tissue+sections.">Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).</li><li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+tumor-immune+microenvironment+in+triple+negative+breast+cancer+revealed+by+multiplexed+ion+beam+imaging.">A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging.</a> Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).</li><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+formalin-fixed,+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine:+An+evidence-based+review+and+conclusion.">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design.">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Rad, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pandora's+box+of+novel+technologies+that+may+revolutionize+lung+cancer.">The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.</a> Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+(MIBI)+for+characterization+of+the+tumor+microenvironment+across+tumor+types.">Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types.</a> Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).</li></ol>

Bir TME'nin çoklu bileşenleri arasındaki karmaşık, karmaşık etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde aydınlatılması, kanser araştırmalarının önemli bir amacı olmaya devam etmektedir. Üreticiler, özellikle son 5 yılda, bu çabanın bir parçası olarak çok sayıda çoklanmış tahlil başlattılar. Çok katlı mekansal analiz, tümör örneklerinde yapısal morfolojiyi korurken birkaç hedefin eşzamanlı kategorizasyonunu kolaylaştıran çok yönlü ve güçlü bir araçtır. Mekansal analiz teknikleri...

Klonal tümör popülasyonlarını çevreleyen çok sayıda hücre tipinin önemi, karsinogenezin kategorizasyonunda çok önemli bir unsurdur. Bu tümör mikroçevre (TME) kompozisyonunu ve etkileşimlerini aydınlatmaya olan ilgi, kanser tedavisi cephaneliğinin bir parçası olarak bağışıklık temelli tedavinin kurulmasını takiben sürekli artmıştır. Bu nedenle, tedavi stratejileri tümör merkezli bir yaklaşımdan TME merkezli bir yaklaşıma kaymıştır1.
Bağışıklık hücrelerinin tümör sürveyansı ve kanser gelişimindeki rollerini aydınlatma çabaları son yıllarda çarpıcı bir şekilde artmıştır 2,3. Tıbbi araştırmalarda, sitometri tabanlı yöntemler ve singleplex ve multipleks görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere çok sayıda yöntem, TME'lerin çoklu elemanlarının benzersiz etkileşimlerini deşifre etme girişiminin bir parçası olarak ortaya çıkmıştır.
Akış sitometrisi (1960'larda icat edildi), floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ve kütle sitometrisi gibi öncü yöntemler esas olarak TME bileşenlerini tanımlamaya ve ölçmeye odaklanmıştır4. Sitometriye dayalı kantitatif teknikler immün peyzaj fenotiplemesine izin verse de, hücresel uzamsal dağılımın belirlenmesi imkansızdır. Tersine, standart singleplex immünohistokimyası gibi yöntemler doku mimarisini korur ve araştırmacıların hücresel dağılımı analiz etmelerini sağlar, ancak tek bir doku bölümünde daha az sayıda hedef bu yöntemlerin bir sınırlamasıdır 5,6. Son birkaç yılda, multipleks immünofloresan, barkodlamalı floresan görüntüleme ve görüntüleme kütle spektrometrisi gibi tek hücreli çözünürlük için çoklanmış görüntüleme teknolojileri, aynı doku bölüm7'yi kullanarak eşzamanlı belirteç boyama hakkında bilgi edinmek için kapsamlı stratejiler olarak ortaya çıkmıştır.
Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometrisini birleştiren ve tek hücreli çözünürlük ölçümü, işaretleyici ko-ekspresyonu (fenotipleme) ve formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) ve taze dondurulmuş (FF) doku örnekleri 8,9 kullanılarak mekansal analiz sağlayan bir teknoloji sunuyoruz. FFPE örnekleri, doku arşivleme örnekleri için en yaygın kullanılan malzemelerdir ve çoğaltılmış görüntüleme teknolojileri için taze dondurulmuş örneklerden daha kolay erişilebilir bir kaynağı temsil eder10. Ek olarak, bu teknoloji aylar sonra görüntüleri yeniden elde etme imkanı sunar. Burada, FFPE doku örneklerini kullanarak boyama ve görüntü işleme protokollerimizi tartışıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS-T</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Low-Barium PBS pH 7.4</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris pH 8.5&#160;</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>REVCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P200</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipette Tips P1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Ultrafree-MC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized H2O</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Jar, Green</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71385-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Jar, Yellow</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71385-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71388-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyDip Stainless Steel Holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 70% EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant slide chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62705-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBI/O software</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIcontrol software</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIslide</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>567001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBIscope</td>
			<td>Ionpath</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture Chamber (Humid Chamber)</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M922-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT Module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>097403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>BioRocker</td>
			<td>S2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1&#956;m )</td>
			<td>MillQ</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum Cabinet Desiccator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task-whipe</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples

Bağışıklık temelli tedavilerdeki ilerlemeler, kanser tedavisi ve araştırmalarında devrim yaratmıştır. Bu, tümör bağışıklık manzarasının karakterizasyonu için artan talebi tetiklemiştir. Standart immünohistokimya doku mimarisini incelemek için uygun olmasına rağmen, az sayıda belirtecin analizi ile sınırlıdır. Tersine, akış sitometrisi gibi teknikler, doku morfolojisi hakkında bilgi kaybolmasına rağmen, aynı anda birden fazla belirteci değerlendirebilir. Son yıllarda, fenotipik ve mekansal analizi bütünleştiren çoklanmış stratejiler, tümör immün manzarasının karakterizasyonuna kapsamlı yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır. Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometresini birleştiren, tahlil geliştirme ve optimizasyonu, doku hazırlama ve görüntü toplama ve işlemedeki teknik adımlara odaklanan yenilikçi bir teknolojiyi tartışıyoruz. Boyama işleminden önce, metal etiketli bir antikor paneli geliştirilmeli ve optimize edilmelidir. Bu hi-plex görüntü sistemi, tek bir doku bölümünde 40 adede kadar metal etiketli antikoru destekler. Not olarak, sinyal paraziti riski, panele dahil edilen işaretleyicilerin sayısıyla birlikte artar. Panel tasarımından sonra, bu paraziti en aza indirmek için antikora metal izotop atanmasına özellikle dikkat edilmelidir. Ön panel testi, küçük bir antikor alt kümesi kullanılarak ve ardından tüm panelin kontrol dokularında test edilmesi kullanılarak gerçekleştirilir. Formalin sabit, parafin gömülü doku kesitleri elde edilir ve altın kaplı slaytlara monte edilir ve daha fazla boyanır. Boyama 2 gün sürer ve standart immünohistokimyasal boyamaya çok benzer. Numuneler lekelendikten sonra, görüntü alma cihazına yerleştirilir. Görünüm alanları seçilir ve görüntüler alınır, karşıya yüklenir ve depolanır. Son aşama, sistemin görüntü işleme yazılımını kullanarak parazitin filtrelenmesi ve giderilmesi için görüntü hazırlamadır. Bu platformun bir dezavantajı, analitik yazılım eksikliğidir. Bununla birlikte, üretilen görüntüler farklı hesaplamalı patoloji yazılımları tarafından desteklenmektedir.

Tonsil ve akciğer adenokarsinomu TMA doku kesitleri (5 mm kalınlığında) elde edildi ve slaytların doku büyüklüğü ve güvenli kenar boşlukları ile ilgili spesifikasyonlara göre altın kaplı slaytların ortasına yerleştirildi. Optimum boyama için sırasıyla dokunun kenarı ile cam kızakların yanal ve alt kenarlıkları arasında 5 mm ve 10 mm'lik serbest cam kenar boşlukları gereklidir. Doku kesitleri, bölümün slayda uygun şekilde yapışmasını sağlamak için boyamadan önce bir fırında gece...

Watch this Scientific Journal Video about Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples at JoVE.com

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Kanser immünoterapisi çağında, tümör mikroçevre dinamiklerini aydınlatmaya olan ilgi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu protokol, boyama ve görüntüleme adımlarıyla ilgili olarak kütle spektrometresi görüntüleme tekniğini detaylandırır ve bu da oldukça çoklanmış mekansal analize izin verir.

Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Bu protokoller, bağışıklık hücrelerinin kanserdeki rollerini aydınlatmak için tek hücre çözünürlüğü miktarı, belirteç birlikte ekspresyonu ve formalin sabit ve parafin gömülü ve taze dondurulmuş doku örnekleri kullanılarak özel bir analiz sağlar. Bu teknik, tek bir doku kesitinde 40 işaretleyicinin eşzamanlı karakterizasyonunu kolaylaştıran, örneklerdeki dokunun yapısını geniş ölçüde koruyan güçlü bir araçtır. Kritik adım antikor optimizasyonu ve doğrulamasıdır.Adımın tamamlanmaması, yüksek kaliteli tekrarlanabilir verilerin ve sonuçların korunmasını tehlikeye atabilecek düşük kaliteli görüntülere neden olabilir. Tüm antikor içeren tüpleri beş dakika boyunca 10.000 x G'de döndürerek başlayın, bloke edici tampona bireysel antikorlar ekleyin ve iyice karıştırın. Pipetleme yaparken antikor tüpünün tabanını rahatsız etmeyin.Antikor panelini, 100 mikrolitre bloke tamponu olan 0,1 mikrometrelik santrifüj filtre cihazını önceden ıslatarak filtreleyin. Filtreyi iki dakika boyunca 10.000 x G'de döndürün ve engelleyici tampon akışını bir pipetle çıkarın. Ardından antikor panelini bir spin kolonuna aktarın ve filtreyi iki dakika boyunca 10.000 x G'de döndürün.Döndürme kolonunu atın ve filtrelenmiş antikor paneli olarak akış akışını kullanın. Antikor boyama için, her bir slaytı kendi tarafına devirerek ve kenarları bir görev sileceğine hafifçe vurarak bloke edici arabelleği slaytlardan çıkarın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve dokuya 100 ila 200 mikrolitre antikor ana karışımı ekleyin.Boyama partisine pozitif ve negatif kontrol slaytları ekleyin ve slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Cihazı kurmak için, kontrol yazılımına giriş yapın ve cihaz uyku modundaysa Uyandır'a tıklayın. Bir slayt yüklemek için Exchange Örneği'ne tıklayın ve ardından kapıyı açmak için Devam'a tıklayın.Slaytı yükleme yuvasına bir örnek yukarı bakacak şekilde ve etiket sağda olacak şekilde yerleştirin, kapıyı kapatmak için Devam'a tıklayın. Projeyi seçin ve ardından yüklenen örnek için slayt adını seçin. Panoramik görüntüyü slayt optik görüntü bölmesinde görüş alanı veya FOV seçimi için görselleştirin, Mod menüsüne tıklayın ve İkincil Elektron Dedektörü'nü seçin, ardından Görüntüleme Modu menüsüne tıklayın ve QC 300 mikrometreyi seçin.FOV konumunu kontrol etmek için Jog Stage'e tıklayın ve ardından FOV'un konumunu seçmek ve gezinmek için oklara tıklayın. FOV ekle'ye tıklayın, alan boyutu olarak 400 mikrometreyi 400 mikrometreye ayarlayın ve Görüntüleme Modu olarak İnce'yi ve Bekleme Süresi'nin 1 milisaniyesini seçin, Onayla'ya tıklayın. Bir FOV listesi oluşturduktan sonra, görüntü odağına ilerleyin ve ışını görüntülenmeyecek bir doku bölgesine hareket ettirerek Damgalamayı ayarlayın.Net bir merkezi görüntü elde edilene kadar parametreleri ayarlayın, Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Elde edilen görüntüler otomatik olarak yüklenecek ve web tabanlı görüntü yönetimi uygulamasında saklanacaktır. Burada gösterilen matris, prob saflığından ve oksitlerden türetilen yüzde çapraz konuşmayı açıklar.Burada mavi kutular %0,5 çapraz konuşmadan büyük veya buna eşit olduğunu ve açık kutular %0,5'ten az çapraz konuşmayı gösterir. Mass etiketleri için, hiçbir kanala, bir veya iki kanala veya ikiden fazla kanala en az %0,5 çapraz konuşmaya katkıda bulunan problar burada gösterilir. Hiçbir probdan, bir veya iki probdan veya ikiden fazla probdan en az% 0.5 çapraz konuşma alan kütle kanalları da gösterilmiştir.Burada akciğer adenokarsinomu, neoplastik olmayan böbrek ve bademcik gibi farklı dokulardaki temsili boyama görüntüleri tasvir edilmiştir. Bu teknik kullanılarak boyanmış ve filtreleme ve düzeltmeden önce üçüncü taraf bir dijital görüntü analiz yazılımı programı kullanılarak görselleştirilmiş bir bademcik dokusu kesitinin görüntüsü burada sunulmuştur. Filtreleme ve düzeltme adımlarından sonra aynı koşullar altında aynı bölümün görüntüsü burada gösterilmiştir.Bu yöntem, doku bölümlendirme, hücre segmentasyonu, işaretleyici birlikte ekspresyonu, komşu analizi ve uzaktan analiz gibi kapsamlı analizlere izin veren üçüncü taraf bir dijital görüntü analiz yazılımına yüklenebilen görüntüler üretir. Araştırma yoluyla yüksek oranda multipleks görüntüleme yöntemleri mevcuttur. Farklı paneller oluşturarak, araştırmacılar kanser, normal, paraneoplastik, enflamatuar ve enfeksiyöz örnekleri araştırabilirler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Parafin üzerinde elastik boyama-pT3N0M0 gastrik kanser dokusu gömülü slaytlar

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...