Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم الموافقة 287/2020B02).
1. إعداد لوحات زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم
<ol><li>تحضير محلول مخزون الكالسيوم (25 mM CaCl 2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl 2·6H 2 O in Tris buffer)<ol>
<li>قم بإعداد مخزن م?...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC تحت تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، رمز الجين ACP5). في وجود كل من M-CSF ومنشط مستقبلات رباط NF-κB (RANKL ، رمز الجين TNFSF11) ، يفرق أسلاف OC بشكل أكبر في OCs أحادية النواة ثم يندمجون لاحقا ليصبحوا OCs متعددة النوى 8,9,10. كل من السيتوكينات M-CSF و RANKL لا غنى عنهما وكافيان لتحريض علامات العظم مثل مستقبلات الكالسيتونين (CT) ، منشط مستقبلات العامل النووي κ B (RANK) ، مضخة البروتون V-ATPase ، الوحدة الفرعية لقناة الكلوريد 7 ألفا (CIC-7) ، integrin β3 ، فوسفاتيز حمض التطرطرات المقاوم للطرطرات (TRAP ، رمز الجين ACP5) ، كاسيبسين البروتياز البروتيني الليزوسومي K (CTSK) ، ومصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9). تشكل OCs المنشطة منطقة مانعة للتسرب على سطح العظام من خلال تكوين حلقة أكتين ذات حدود كشكش11,12. داخل منطقة الختم ، تتوسط OCs في الارتشاف من خلال إفراز البروتونات عبر مضخة البروتون V-ATPase12,13 و MMP9 14 و CTSK15 ، مما يؤدي إلى تكوين الثغرات.
بالنسبة للتجارب المخبرية ، يمكن الحصول على أسلاف OC عن طريق توسيع البلاعم في نخاع العظم من عظم الفخذ والساق 16,17 ، وكذلك عن طريق عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) من عينات الدم والمعاطف الباهتة18,19,20 ، أو عن طريق تمايز الخلايا الوحيدة المخلدة في الفئران RAW 264.7 21,22.
في هذا البروتوكول ، نصف اختبار ارتشاف العظام في لوحات زراعة الخلايا المطلية ب CaP باستخدام OCs المشتقة من PBMCs الأولية. تم اعتماد طريقة لوحات زراعة الخلايا المطلية CaP المستخدمة هنا وصقلها من الطريقة التي وصفها سابقا Patntirapong et al.17 و Maria et al.21. للحصول على سلائف OC ، يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتوسيعها كما هو موضح سابقا20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.

تم تنفيذ طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا في خطوتين للطلاء تتضمنان تكلس مسبق لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم الحصول على فوسفات الكالسيوم الموزع بشكل موحد في الجزء السفلي من لوحات البئر 96. التزم الطلاء جيدا بالقاع بعد خ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

يصف بروتوكولنا طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام. يمكن بسهولة تحضير وتصور استخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم باستخدام المواد المتاحة في المختبر. على النقيض من شرائح العظام أو العاج غير الشفافة ، يسمح طلاء فوسفات الكالسيوم بتصور حفر وخلايا الارتشاف في نفس الوقت.في هذا البروتوكول ، نستخدم PBMCs للتمايز العظمي. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا على أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظم أو الخلايا الخام 264.7. أولا ، خذ صفيحة زراعة خلايا 96 بئرا مسطحة القاع وماصة 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم المعد مسبقا في كل بئر.ثم ، قم بتغطية اللوحة بالغطاء واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام ، قم بشفط محلول ما قبل التكلس من ألواح زراعة خلايا البئر 96 المتكلسة مسبقا وأضف 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم إلى كل بئر. غطي الألواح بغطاء واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد.ثم عكس اللوحة لصب المحلول وغسل الطبق جيدا ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. جفف اللوحة على الفور باستخدام مجفف شعر أو ثاني أكسيد الكربون المضغوط أو غاز النيتروجين للحفاظ على سطح موحد. الآن ، قم بتشعيع اللوحة المطلية على مقعد نظيف بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة.استخدم اللوحة المطلية على الفور أو أغلق اللوحة باستخدام Parafilm وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تمييع 15 ملليلتر من الدم الطازج مع حجم متساو من PBS ومزجها عن طريق عكس أو سحب عدة مرات. ثم خذ 15 ملليلتر من محلول تدرج الكثافة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، وقم بإمالة الأنبوب ، وقم بطبقة 30 ملليلتر بعناية من عينة الدم المخففة على محلول تدرج الكثافة 15 ملليلتر.في وقت لاحق ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في دوار دلو متأرجح دون كسر عند 810 مرات G لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. ثم قم بشفط الطبقة العليا تاركا طبقة الخلايا أحادية النواة دون إزعاج في الواجهة. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر.املأ الأنبوب ب PBS واخلطه وأجهزة الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. إعادة تعليق PBMCs في ألفا MEM كاملة تحتوي على 20 نانوغرام لكل ملليلتر عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، والبذور 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة في السنتيمتر مربع PBMCs في قارورة. احتضن الألواح المغلفة بفوسفات الكالسيوم مع 50 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك ، اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS لفصل السلائف العظمية عن الخلايا الميتة أو غير الملتصقة ، ثم أضف أربعة ملليلترات من التربسين لكل قارورة 75 سنتيمترا مربعا. بعد 30 دقيقة ، أوقف عملية الهضم بإضافة أربعة ملليلترات من ألفا ميم الكاملة ، ثم افصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلايا. انقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر واحسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام غرفة العد.الطرد المركزي للأنبوب في 350 مرة G لمدة سبع دقائق لتكوير الخلايا وإنعاش الكريات وإكمال ألفا MEM التي تحتوي على M-CSF و RANKL للحصول على مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. استنشاق مصل البقر الجنيني من الصفيحة المطلية بفوسفات الكالسيوم ، وماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق وغسل مرة أخرى مع PBS. للتلطيخ ، أضف المخزن المؤقت للتخلل إلى الخلايا الثابتة واحتضنها لمدة خمس دقائق. لتلطيخ خيوط الأكتين ، احتضن الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الفيلويدين المسمى Alexa Fluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة ، ثم استطلع محلول التلطيخ وصبغ النوى باستخدام 100 ميكرولتر من Hoechst لمدة 10 دقائق.قم بتلطيخ طلاء فوسفات الكالسيوم مع 100 ميكرولتر من 10 ميكرومولار كالسين و PBS لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، التقط الصور. بالنسبة لفون كوسا تلطيخ طلاء فوسفات الكالسيوم إضافة 50 ميكرولتر من نترات الفضة 5٪ والماء منزوع الأيونات إلى كل بئر ، واحتضان اللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة حتى يتحول الطلاء الموجود في قاع الآبار إلى اللون البني.يبدو أن طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من لوحات الآبار ال 96 موحد وملتصق جيدا. بعد تسعة أيام من الثقافة في M-CSF و RANKL على الألواح المغلفة بفوسفات الكالسيوم ، شكلت سلائف osteoclast حفر ارتشاف وخلايا عظمية كبيرة. عبرت الخلايا العظمية متعددة النوى الموجودة في الحفر عن مستويات عالية من TRAP.أظهرت الخلايا العظمية الناضجة وجود ثلاث نوى أو أكثر وحلقة الأكتين المتميزة. أظهر طلاء فوسفات الكالسيوم الأخضر وجود حفر ارتشاف سوداء. تم قياس صور التألق في منطقة الحفرة باستخدام أداة العتبة للصورة J.تم حساب عدد وحجم الخلايا العظمية باستخدام مدير عائد الاستثمار وأداة اختيار المضلع لسلائف الصورة J.Osteoclasts المزروعة في غياب RANKL لا يمكن أن تشكل حفر ارتشاف ، ومع ذلك فإن M-CSF و RANKL سهلت تكوين حفر osteoclastogenic.وتم تحديد مساحة الحفرة كميا باستخدام الصورة J.يساعد تجفيف اللوحة المطلية على الفور بتدفق الهواء على صنع طلاء فوسفات الكالسيوم الموحد. خلاف ذلك ، فهي عرضة لتشكيل طلاء أكثر سمكا في منتصف البئر.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

متحد البؤر المجهري القرنية : رواية غير الغازية تقنيات لقياس الصغيرة الأمراض الليفية في اعتلال الأعصاب المحيطية

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

دقيقة وبسيطة قياس الموالية للالتهابات سايتوكاين 1β ايل باستخدام تحفيز الدم الجامعة الفحص

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

طريقة بسيطة لتركيب الانبوبة الرئة ماوس

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

تعايش التصاقي في الفئران: بروتوكول مفصل

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

بروتوكول الفحص على أساس خلية للتنبؤ النذير من الجنف مجهول السبب عن طريق الخلوي عازل الطيفي

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

جهاز بسيط للتحضير السريع الجبال الجامعة للماوس الأمعاء

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...