Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

Ce travail a été partiellement financé par le China Scholarship Council [CSC n° 201808440394]. W.C. a été financé par le SCC.

Le protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique local (numéro d’approbation 287/2020B02).
1. Préparation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium
<ol><li>Préparation de la solution mère de calcium (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O dans le tampon Tris)<ol>
<li>Préparez un tampon Tris de 1,0 M et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl.</li>
		<li>Installez...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines21 et de cellules macrophages de moelle oss...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes1. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause2, la polyarthrite rhumatoïde3, la maladie parodontale4, la maladie osseuse myélomateuse5 et les métastases osseuses ostéolytiques6. En revanche, des défauts dans la formation et la fonction du CO peuvent également provoquer une ostéopétrose7. Les CSH subissent une différenciation en progéniteurs OC sous stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, symbole du gène ACP5). En présence à la fois de M-CSF et d’activateur de récepteur du ligand NF-κB (RANKL, symbole du gène TNFSF11), les progéniteurs OC se différencient davantage en OC mononucléaires et fusionnent ensuite pour devenirdes OC multinucléés 8,9,10. Les cytokines M-CSF et RANKL sont indispensables et suffisantes pour l’induction de marqueurs ostéoclastiques tels que le récepteur de la calcitonine (CT), l’activateur du récepteur du facteur nucléaire κ B (RANK), la pompe à protons V-ATPase, la sous-unité alpha du canal chlorure 7 (CIC-7), l’intégrine β3, la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, symbole du gène ACP5), la cystéine protéase lysosomale cathepsine K (CTSK) et la métallopeptidase matricielle 9 (MMP9). Les CO activés forment une zone d’étanchéité à la surface osseuse par la formation d’un anneau d’actine avec une bordure ébouriffée11,12. Dans la zone d’étanchéité, les CO médient la résorption par la sécrétisation de protons via la pompe à protons V-ATPase 12,13, MMP914 et CTSK15, conduisant à la formation de lacunes.
Pour les expériences in vitro, les progéniteurs OC peuvent être obtenus par expansion des macrophages de la moelle osseuse à partir du fémur et du tibiade souris 16,17, ainsi que par isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) à partir d’échantillons de sang et de pelages bouffants 18,19,20, ou par différenciation des cellules monocytaires murines immortalisées RAW 264,7 21,22.
Dans le présent protocole, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique dans des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP à l’aide d’OC dérivés de PBMC primaires. La méthode des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisée ici est adoptée et affinée à partir de la méthode décrite précédemment par Patntirapong et al.17 et Maria et al.21. Pour obtenir des précurseurs OC, les PBMC sont isolés par centrifugation par gradient de densité et élargis comme décrit précédemment20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO3 et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Le revêtement de phosphate de calcium sur le fond des plaques de culture cellulaire a été effectué en deux étapes de revêtement comprenant une pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. Comme le montre la figure 1, du phosphate de calcium uniformément réparti a été obtenu au fond des plaques de 96 puits. Le revêtement a très bien adhéré au fond après les étapes de lavage effectuées.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-pa...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.

Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Notre protocole décrit une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique. L’utilisation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium peut être facilement préparée et visualisée à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. Contrairement aux tranches opaques d’os ou de dentine, le revêtement de phosphate de calcium permet de visualiser les fosses de résorption et les cellules en même temps.Dans ce protocole, nous utilisons des PBMC pour la différenciation des ostéoclastes. Cependant, il peut également être appliqué à d’autres types de cellules comme les monocytes dérivés de la moelle osseuse ou les cellules Raw 264.7. Prenez d’abord une plaque de culture cellulaire à fond plat de 96 puits et pipettez 300 microlitres de solution de phosphate de calcium préalablement préparée dans chaque puits.Ensuite, couvrez la plaque avec le couvercle et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Après trois jours, aspirer la solution de pré-calcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées de 96 puits et ajouter 300 microlitres de solution de phosphate de calcium à chaque puits. Couvrez les plaques avec un couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant une journée.Ensuite, inversez la plaque pour verser la solution et lavez soigneusement la plaque trois fois avec de l’eau désionisée. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou de dioxyde de carbone comprimé ou d’azote gazeux pour maintenir une surface uniforme. Maintenant, irradiez la plaque enduite sur un banc propre avec des rayons ultraviolets pendant une heure.Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec Parafilm et conservez-la à température ambiante. Diluer 15 millilitres de sang frais avec un volume égal de PBS et les mélanger en inversant ou en piquant plusieurs fois. Ensuite, prenez 15 millilitres de solution de gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres, inclinez le tube et superposez soigneusement 30 millilitres d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 millilitres.Plus tard, centrifugez le tube dans un rotor à godet oscillant sans casser à 810 fois G pendant 20 minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, aspirez la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire intacte à l’interface. Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Remplissez le tube avec du PBS, mélangez et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Remettez en suspension les PBMC dans un alpha-MEM complet contenant 20 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages, et ensemencez 2,5 fois 10 à cinq cellules par centimètre carré de PBMC dans une fiole. Incuber les plaques enduites de phosphate de calcium avec 50 microlitres de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, lavez la fiole deux fois avec du PBS pour détacher les précurseurs d’ostéoclastes des cellules mortes ou non adhérentes, puis ajoutez quatre millilitres de trypsine par flacon de 75 centimètres carrés. Après 30 minutes, arrêtez la digestion en ajoutant quatre millilitres d’alpha-MEM complet, puis détachez soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et comptez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de comptage.Centrifugez le tube à 350 fois G pendant sept minutes pour granuler les cellules et remettre en suspension la pastille et complétez l’alpha MEM contenant M-CSF et RANKL pour obtenir une fois 10 à six cellules par millilitre. Aspirer le sérum bovin fœtal de la plaque enduite de phosphate de calcium et pipeter 200 microlitres de suspension cellulaire par puits. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS.Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes et lavez-les à nouveau avec du PBS. Pour la coloration, ajoutez un tampon de perméabilisation aux cellules fixes et incuubez-les pendant cinq minutes. Pour colorer les filaments d’actine, incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de phalloïdine marquée Alexa Fluor 546 dans du PBS pendant 30 minutes, puis aspirer la solution de coloration et colorer les noyaux à l’aide de 100 microlitres de Hoechst pendant 10 minutes.Coloration en phosphate de calcium avec 100 microlitres de 10 micromolaires de calccéine micromolaire et de PBS pendant 10 minutes. Après avoir lavé trois fois avec PBS, capturez des images. Pour la coloration Von Kossa du revêtement de phosphate de calcium, ajoutez 50 microlitres de nitrate d’argent à 5% et d’eau désionisée à chaque puits, et incubez la plaque sous rayonnement ultraviolet pendant une heure jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.Le revêtement de phosphate de calcium au fond des 96 plaques de puits semblait uniforme et bien adhérent. Après neuf jours de culture dans le M-CSF et le RANKL sur les plaques revêtues de phosphate de calcium, les précurseurs d’ostéoclastes ont formé des fosses de résorption et de grands ostéoclastes. Les ostéoclastes multinucléés situés dans les fosses exprimaient des niveaux élevés de TRAP.Les ostéoclastes matures ont montré la présence de trois noyaux ou plus et de l’anneau d’actine distinct. Le revêtement de phosphate de calcium vert a montré la présence de fosses de résorption noires. Les images de fluorescence de la zone de fosse ont été mesurées à l’aide de l’outil de seuil de l’image J.Le nombre et la taille des ostéoclastes ont été calculés à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement et de l’outil de sélection de polygones de l’image J.Les précurseurs des ostéoclastes cultivés en l’absence de RANKL ne pouvaient pas former de fosses de résorption, mais M-CSF et RANKL ont facilité la formation de fosses ostéoclastogènes.Et la zone de la fosse a été quantifiée à l’aide de l’image J.Le séchage immédiat de la plaque revêtue avec un flux d’air aide à créer un revêtement uniforme de phosphate de calcium. Sinon, il est susceptible de former un revêtement plus épais au milieu du puits.

Research

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Medicine

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