Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
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Diese Arbeit wurde teilweise vom China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394] finanziert. W.C. wurde von CSC finanziert.

Das Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 287/2020B02).
1. Herstellung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten
<ol><li>Herstellung von Calcium-Stammlösung (25 mM CaCl 2·2H 2 O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O im Tris-Puffer)<ol>
<li>Bereiten Sie den 1,0 M Tris-Puffer vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein.</li>
		<li>Stellen Sie ein Glasbeche...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay unter Verwendung von OCs, die in vitro von PBMCs abgeleitet und expandiert wurden. Die verwendeten CaP-beschichteten Zellkulturplatten können mit laborverfügbaren Materialien einfach vorbereitet und visualisiert werden. Zusätzlich zu den unsortierten PBMCs, die in diesem Protokoll übernommen wurden, wurden OCs, die aus murinen monozytären Zellen21 und Knochenmarkmakrophagenzellen...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Osteoklasten (OCs) sind gewebespezifische Makrophagen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) gewonnen werden und zusammen mit Osteoblasten 1 eine zentrale Rolle beim Knochenumbauspielen. Sexualhormon-induzierte, immunologische und maligne Knochenerkrankungen, die Knochen systemisch oder lokal zerstören, sind auf übermäßige osteoklastische Aktivität zurückzuführen, einschließlich Menopause-bedingte Osteoporose2, rheumatoide Arthritis3, Parodontitis4, Myelom-Knochen-Krankheit5 und osteolytische Knochenmetastasen6. Im Gegensatz dazu können Defekte in der OC-Bildung und -Funktion auch Osteopetrose7 verursachen. HSCs werden unter Stimulation des Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF, Gensymbol ACP5) in OC-Vorläufer differenziert. In Gegenwart von M-CSF und Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL, Gensymbol TNFSF11) differenzieren OC-Vorläufer weiter in mononukleäre OCs und fusionieren anschließend zu mehrkernigen OCs 8,9,10. Beide Zytokine M-CSF und RANKL sind unverzichtbar und ausreichend für die Induktion osteoklastischer Marker wie Calcitonin-Rezeptor (CT), Rezeptoraktivator des Kernfaktors κ B (RANK), Protonenpumpe V-ATPase, Chloridkanal 7 alpha-Untereinheit (CIC-7), Integrin β3, tartratresistente Säurephosphatase (TRAP, Gensymbol ACP5), lysosomale Cysteinprotease-Cathepsin K (CTSK) und Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP9). Aktivierte OCs bilden eine Dichtungszone auf der Knochenoberfläche durch die Bildung eines Aktinrings mit einem gerüschten Rand11,12. Innerhalb der Dichtungszone vermitteln OCs die Resorption durch Sekretion von Protonen über die Protonenpumpe V-ATPase 12,13, MMP914 und CTSK 15, was zur Bildung von Lücken führt.
Für In-vitro-Experimente können OC-Vorläufer durch Expansion von Knochenmarkmakrophagen aus Femur und Tibia 16,17 von Mäusen sowie durch Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Blutproben und Buffy Coats18,19,20 oder durch Differenzierung der immortalisierten murinen monozytären Zellen RAW 264.7 21,22 erhalten werden.
Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir einen osteoklastischen Resorptionsassay in CaP-beschichteten Zellkulturplatten unter Verwendung von OCs, die von primären PBMCs abgeleitet sind. Die hier verwendete CaP-beschichtete Zellkulturplattenmethode wurde von der zuvor von Patntirapong et al.17 und Maria et al.21 beschriebenen Methode übernommen und verfeinert. Um OC-Vorläufer zu erhalten, werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und wie zuvor beschriebenexpandiert 20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Reife Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, die Knochen durch die Sekretion von Säuren und Enzymen abbauen können. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen (z.B. Osteoporose und Knochenkrebs) und sind daher wichtige Forschungsgegenstände. In vitro kann ihre Aktivität durch die Bildung von Resorptionsgruben analysiert werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Pit-Assay-Methode unter Verwendung von mit Calciumphosphat (CaP) beschichteten Zellkulturplatten, die leicht visualisiert und quantifiziert werden können. Osteoklastenvorläufer, die aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) gewonnen wurden, wurden auf den beschichteten Platten in Gegenwart von osteoklastogenen Reizen kultiviert. Nach 9 Tagen Inkubation wurden Osteoklasten fixiert und für die Fluoreszenzbildgebung gefärbt, während die CaP-Beschichtung durch Calcein gefärbt wurde. Um die resorbierte Fläche zu quantifizieren, wurde die CaP-Beschichtung auf Platten mit 5% AgNO3 gefärbt und durch Hellfeldbildgebung visualisiert. Die Resorptionsgrubenfläche wurde mit ImageJ quantifiziert.

Die Calciumphosphatbeschichtung auf dem Boden der Zellkulturplatten wurde in zwei Beschichtungsschritten durchgeführt, die eine 3-tägige Vorverkalkung und einen 1-tägigen Verkalkungsschritt umfassten. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde gleichmäßig verteiltes Calciumphosphat auf der Unterseite der 96-Well-Platten erhalten. Die Beschichtung haftet nach den durchgeführten Waschschritten sehr gut am Boden.
<img alt="Figu...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Unser Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay. Die Verwendung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten kann mit Hilfe von im Labor verfügbaren Materialien leicht vorbereitet und visualisiert werden. Im Gegensatz zu undurchsichtigen Knochen- oder Dentinscheiben ermöglicht die Calciumphosphatbeschichtung die gleichzeitige Visualisierung von Resorptionsgruben und -zellen.In diesem Protokoll verwenden wir PBMCs zur Osteoklastendifferenzierung. Es kann jedoch auch auf andere Zelltypen wie aus Knochenmark abgeleitete Monozyten oder Raw 264.7-Zellen angewendet werden. Nehmen Sie zuerst eine flache Bodenzellkulturplatte mit 96 Vertiefungen und pipettieren Sie 300 Mikroliter zuvor vorbereitete Calciumphosphatlösung in jede Vertiefung.Dann bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei Tage. Nach drei Tagen aspirieren Sie die Vorverkalkungslösung aus den vorverkalkten 96 Zellkulturplatten und fügen Sie 300 Mikroliter Calciumphosphatlösung zu jeder Vertiefung hinzu. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für einen Tag.Dann drehen Sie die Platte um, um die Lösung auszugießen, und waschen Sie die Platte dreimal gründlich mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platte sofort mit einem Haartrockner oder komprimiertem Kohlendioxid oder Stickstoffgas, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Bestrahlen Sie nun die beschichtete Platte auf einer sauberen Bank eine Stunde lang mit ultravioletten Strahlen.Verwenden Sie die beschichtete Platte sofort oder versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie 15 Milliliter frisches Blut mit einem gleichen Volumen PBS und mischen Sie sie durch mehrmaliges Umdrehen oder Pipettieren. Nehmen Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenlösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, kippen Sie das Röhrchen und schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter verdünnte Blutprobe auf die 15 Milliliter Dichtegradientenlösung.Später zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor ohne Pause bei 810 mal G für 20 Minuten bei 20 Grad Celsius. Dann aspirieren Sie die obere Schicht und lassen Sie die mononukleäre Zellschicht ungestört an der Grenzfläche. Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig auf ein neues 50-Milliliter-konisches Rohr.Füllen Sie das Röhrchen mit PBS, mischen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Resuspendieren Sie PBMCs in einem vollständigen Alpha-MEM, das 20 Nanogramm pro Milliliter Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor enthält, und säen Sie 2,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Zentimeter Quadrat PBMCs in einem Kolben. Inkubieren Sie die mit Calciumphosphat beschichteten Platten mit 50 Mikrolitern fetalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Als nächstes waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS, um die Osteoklastenvorläufer von toten oder nicht adhärenten Zellen zu lösen, und fügen Sie dann vier Milliliter Trypsin pro 75 Quadratzentimeter Kolben hinzu. Stoppen Sie nach 30 Minuten die Verdauung, indem Sie vier Milliliter vollständiges Alpha-MEM hinzufügen, und lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellenschaber ab. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Zählkammer.Zentrifen Sie das Röhrchen bei 350 mal G für sieben Minuten, um die Zellen zu pelletieren und das Pellet wiederzubeleben und das Alpha-MEM mit M-CSF und RANKL zu vervollständigen, um einmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten. Saugen Sie das fetale Rinderserum von der mit Calciumphosphat beschichteten Platte ab und pipettieren Sie 200 Mikroliter Zellsuspension pro Well. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen.Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen Sie sie erneut mit PBS. Für die Färbung fügen Sie den festen Zellen Permeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie sie für fünf Minuten. Um die Aktinfilamente zu färben, inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Alexa Fluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 Minuten, saugen dann die Färbelösung ab und färben Sie die Kerne mit 100 Mikrolitern Hoechst für 10 Minuten.Färben Sie die Calciumphosphatbeschichtung mit 100 Mikrolitern 10 mikromolarem Calcein und PBS für 10 Minuten. Nachdem Sie dreimal mit PBS gewaschen haben, nehmen Sie Bilder auf. Für die Von Kossa-Färbung der Calciumphosphatbeschichtung fügen Sie 50 Mikroliter 5% Silbernitrat und deionisiertes Wasser zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte unter ultravioletter Strahlung für eine Stunde, bis die Beschichtung auf dem Boden der Bohrlöcher braun geworden ist.Die Calciumphosphatbeschichtung am Boden der 96 Wellplatten schien gleichmäßig und gut haftend zu sein. Nach neun Tagen Kultur in M-CSF und RANKL auf den mit Calciumphosphat beschichteten Platten bildeten Osteoklastenvorläufer Resorptionsgruben und große Osteoklasten. Die in den Gruben befindlichen mehrkernigen Osteoklasten drückten hohe TRAP-Werte aus.Die reifen Osteoklasten zeigten das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen und den ausgeprägten Aktinring. Die grüne Calciumphosphatbeschichtung zeigte das Vorhandensein von schwarzen Resorptionsgruben. Die Fluoreszenzbilder der Grubenfläche wurden mit dem Schwellenwertwerkzeug von Bild J gemessen.Die Anzahl und Größe der Osteoklasten wurden mit dem ROI-Manager und dem Polygonauswahlwerkzeug von Bild J berechnet.Osteoklasten-Vorläufer, die in Abwesenheit von RANKL gezüchtet wurden, konnten keine Resorptionsgruben bilden, jedoch erleichterten M-CSF und RANKL die Bildung von osteoklastogenen Gruben.Und die Grubenfläche wurde mit dem Bild J quantifiziert.Das sofortige Trocknen der beschichteten Platte mit Luftstrom hilft, eine gleichmäßige Calciumphosphatbeschichtung herzustellen. Andernfalls neigt es dazu, eine dickere Beschichtung in der Mitte des Brunnens zu bilden.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

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The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Forschung

Medizin

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

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Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

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Eine einfache Kritische große Femoral Defect Modell an der Maus

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Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...