Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מועצת המלגות של סין [CSC No. 201808440394]. W.C. מומן על ידי CSC.

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור מספר 287/2020B02).
1. הכנת צלחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט
<ol><li>הכנת תמיסת מלאי סידן (25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O במאגר Tris)<ol>
<li>הכינו מאגר Tris של 1.0 M והתאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl.</li>
		<li>הגדר ...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית באמצעות OCs הנגזרים ומורחבים במבחנה מ- PBMCs. ניתן להכין בקלות את לוחות תרביות התאים המשומשים בציפוי CaP ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בנוסף ל-PBMCs לא ממוינים שאומצו בפרוטוקול זה, OCs שנוצרו מתאים מונוציטיים של מורין<sup cl...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

אוסטאוקלסטים (OCs) הם מקרופאגים ספציפיים לרקמות שמקורם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), וממלאים תפקיד מרכזי בשיפוץ העצם יחד עם אוסטאובלסטים1. הפרעות עצם הנגרמות על ידי הורמוני מין, אימונולוגיות וממאירות שהורסות את העצם באופן מערכתי או מקומי נובעות מפעילות אוסטאוקלסטית עודפת, כולל פעילות אוסטאוקלסטית נוספת הקשורה לגיל המעבר2, דלקת מפרקים שגרונית3, מחלת חניכיים4, מחלת עצם מיאלומה5 וגרורות עצם אוסטאוליטיות6. לעומת זאת, פגמים בהיווצרות OC ובתפקוד יכולים גם הם לגרום לאוסטיאופטרוזיס7. HSCs עוברים התמיינות לאבות OC תחת גירוי גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF, סמל הגן ACP5). בנוכחות הן M-CSF והן מפעיל הקולטנים של ליגנד NF-κB (RANKL, סמל הגן TNFSF11), אבות OC מתמיינים עוד יותר ל-OCs חד-גרעיניים ולאחר מכן מתמזגים והופכים ל-OCs מרוביגרעינים 8,9,10. שני הציטוקינים M-CSF ו- RANKL הם הכרחיים ומספיקים להשראת סמנים אוסטאוקלסטיים כגון קולטן קלציטונין (CT), מפעיל קולטן של גורם גרעיני κ B (RANK), משאבת פרוטון V-ATPase, כלוריד ערוץ 7 תת-יחידה אלפא (CIC-7), אינטגרין β3, חומצה פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט (TRAP, סמל הגן ACP5), ציסטאין ליזוזומי פרוטאז פרוטאז קתפסין K (CTSK), ומטריצה מטאלופטידז 9 (MMP9). OCs מופעלים יוצרים אזור איטום על פני העצם באמצעות היווצרות של טבעת אקטין עם גבולמקופל 11,12. בתוך אזור האיטום, OCs מתווכים ספיגה באמצעות פרוטונים מפרישים באמצעות משאבת הפרוטונים V-ATPase12,13, MMP914 ו- CTSK15, מה שמוביל להיווצרות לקונה.
עבור ניסויים במבחנה, ניתן להשיג אבות OC על ידי הרחבה של מקרופאגים של מח עצם מעצם הירך והטיביה של עכברים16,17, כמו גם על ידי בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם אנושי (PBMCs) מדגימות דם ומצופים באפיים 18,19,20, או על ידי התמיינות של התאים המונוציטיים המורין המונצחים RAW 264.7 21,22.
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים בדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית בלוחות תרבית תאים מצופים CaP באמצעות OCs שמקורם ב-PBMCs ראשוניים. שיטת לוחות תרבית התאים המצופה CaP המשמשת כאן מאומצת ומעודנת מהשיטה שתוארה קודם לכן על ידי Patntirapong et al.17 ו- Maria et al.21. כדי להשיג מבשרי OC, PBMCs מבודדים על ידי צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות ומורחבים כפי שתואר קודם לכן20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

אוסטאוקלסטים בוגרים הם תאים רב-גרעיניים שיכולים לפרק את העצם באמצעות הפרשת חומצות ואנזימים. הם ממלאים תפקיד מכריע במחלות שונות (למשל, אוסטאופורוזיס וסרטן העצמות) ולכן הם מושאי מחקר חשובים. במבחנה, ניתן לנתח את פעילותם על ידי היווצרות של בורות ספיגה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת בדיקת בור פשוטה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט (CaP), שניתן לדמיין ולכמת בקלות. מבשרי אוסטאוקלסט שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs) עברו תרבית על הלוחות המצופים בנוכחות גירויים אוסטאוקלסטוגניים. לאחר 9 ימי דגירה, אוסטאוקלסטים תוקנו והוכתמו לצורך הדמיה פלואורסצנטית בעוד שציפוי CaP הוכתם על ידי קלצין. כדי לכמת את האזור המחודש, ציפוי ה-CaP על הצלחות הוכתם ב-5% AgNO3 והודגם על ידי הדמיית שדה בהיר. אזור בור הספיגה כומת באמצעות ImageJ.

ציפוי הסידן פוספט בתחתית לוחות תרבית התאים בוצע בשני שלבי ציפוי הכוללים הסתיידות מוקדמת של 3 ימים ושלב הסתיידות של יום אחד. כפי שניתן לראות באיור 1, סידן פוספט בעל פיזור אחיד הושג בתחתית הלוחות בני 96 הבארות. הציפוי נדבק היטב לתחתית לאחר שלבי הכביסה שבוצעו.
<p class="jove_content biglege...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.

פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית. ניתן להכין בקלות את השימוש בלוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בניגוד לפרוסות עצם או דנטין אטומות, ציפוי הסידן פוספט מאפשר הדמיה של בורות ספיגה ותאים בו זמנית.בפרוטוקול זה, אנו משתמשים ב- PBMCs להבחנה אוסטאוקלסטית. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם על סוגי תאים אחרים כמו מונוציטים שמקורם במח העצם או תאי Raw 264.7. תחילה קחו צלחת תרבית תאים שטוחה של 96 באר ופיפטה 300 מיקרוליטרים של תמיסת סידן פוספט שהוכנה בעבר לתוך כל באר.לאחר מכן, מכסים את הצלחת במכסה ומדגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, שאפו את תמיסת הקדם-הסתיידות מ-96 לוחות תרבית התאים של 96 הקידוחים מראש והוסיפו 300 מיקרוליטרים של תמיסת סידן פוספט לכל באר. מכסים את הצלחות במכסה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ליום אחד.לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי לשפוך את התמיסה ולשטוף ביסודיות את הצלחת שלוש פעמים עם מים deionized. יש לייבש את הצלחת באופן מיידי באמצעות מייבש שיער או פחמן דו-חמצני דחוס או גז חנקן כדי לשמור על משטח אחיד. כעת, הקרינו את הצלחת המצופה על ספסל נקי עם קרניים אולטרה סגולות למשך שעה.השתמשו בצלחת המצופה באופן מיידי או אטמו את הצלחת עם Parafilm ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לדלל 15 מיליליטרים של דם טרי עם נפח שווה של PBS ולערבב אותם על ידי היפוך או pipetting מספר פעמים. לאחר מכן קח 15 מיליליטרים של תמיסת שיפוע צפיפות בצינור חרוטי 50 מיליליטר, הטה את הצינור, ושכב בזהירות 30 מיליליטרים של דגימת דם מדוללת על 15 מיליליטרים של תמיסת שיפוע צפיפות.מאוחר יותר, צנטריפוגה הצינור ברוטור דלי מתנדנד ללא הפסקה ב 810 פעמים G במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו לשכבה העליונה והשאירו את שכבת התא החד-גרעיני ללא הפרעה בממשק. העבירו בזהירות את שכבת התא החד-גרעינית לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.מלאו את הצינור ב-PBS, ערבבו וצנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. השעיה מחדש של מחשבי PBM בגורם מגרה של אלפא-MEM שלם המכיל 20 ננוגרם למיליליטרים של מקרופאגים בגורם מגרה מושבת מקרופאגים, וזרע 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים לסנטימטר PBMCs מרובעים בבקבוקון. דגירה של הצלחות מצופות הסידן פוספט עם 50 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.לאחר מכן, שטפו את הבקבוק פעמיים עם PBS כדי לנתק את מבשרי האוסטאוקלסט מתאים מתים או שאינם דבקים, ואז הוסיפו ארבעה מיליליטרים של טריפסין לכל בקבוקון של 75 סנטימטרים רבועים. לאחר 30 דקות, עצרו את העיכול על ידי הוספת ארבעה מיליליטרים של אלפא-MEM שלם, ואז נתקו בזהירות את התאים באמצעות מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור של 50 מיליליטר וסופרים את המספר הכולל של התאים באמצעות תא ספירה.צנטריפוגה של הצינור ב-350 פעמים G במשך שבע דקות כדי לכדור את התאים ולבצע החייאה של הכדור ולהשלים את האלפא MEM המכיל M-CSF ו-RANKL כדי להגיע פי 10 לששת התאים למיליליטר. שאפו את סרום הבקר העוברי מהצלחת המצופה בסידן פוספט, ופיפטה 200 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל באר. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות ושטוף שוב עם PBS. לצורך צביעה, יש להוסיף מאגר חדירה לתאים הקבועים ולדגום אותם במשך חמש דקות. כדי להכתים את חוטי האקטין, דגירו את התאים עם 100 מיקרוליטרים של אלקסה פלואור 546 המסומנים בתמיסת פלואידין ב-PBS למשך 30 דקות, ואז שאפו לתמיסת ההכתמה והכתימו את הגרעינים באמצעות 100 מיקרוליטרים של Hoechst במשך 10 דקות.ציפוי סידן פוספט עם 100 מיקרוליטרים של 10 קלצין מיקרומולרי ו- PBS למשך 10 דקות. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS, לצלם תמונות. עבור פון קוסה צביעה של ציפוי סידן פוספט להוסיף 50 microliters של 5% כסף חנקתי ומים deionized לכל באר, ודגירה את הצלחת תחת קרינה אולטרה סגולה במשך שעה אחת עד שהציפוי בתחתית הבארות הפך חום.ציפוי הסידן פוספט בתחתית 96 לוחות הבאר נראה אחיד ודבק היטב. לאחר תשעה ימים של תרבית ב-M-CSF וב-RANKL על הלוחות המצופים בסידן פוספט, נוצרו מבשרי אוסטאוקלסטים בורות ספיגה ואוסטאוקלסטים גדולים. האוסטיאוקלסטים מרובי הגרעין הממוקמים בבורות ביטאו רמות גבוהות של TRAP.האוסטיאוקלסטים הבוגרים הראו נוכחות של שלושה גרעינים או יותר וטבעת אקטין מובהקת. ציפוי הסידן הפוספט הירוק הראה נוכחות של בורות ספיגה שחורים. תמונות הפלואורסצנציה של אזור הבור נמדדו באמצעות כלי הסף של התמונה J.המספר והגודל של אוסטאוקלסטים חושבו באמצעות מנהל ROI וכלי בחירת המצולעים של מבשרי התמונה J.Osteoclasts שגדלו בהיעדר RANKL לא יכלו ליצור בורות ספיגה, אולם M-CSF ו- RANKL הקלו על היווצרות בורות אוסטאוקלסטוגניים.ואזור הבור כומת באמצעות תמונה J.ייבוש מיידי של הצלחת המצופה בזרימת אוויר מסייע ביצירת ציפוי סידן פוספט אחיד. אחרת הוא נוטה ליצור ציפוי עבה יותר באמצע הבאר.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

מכשיר פשוט להכין במהירות mounts כל ממעי העכבר

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...