Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal China Scholarship Council [CSC No. 201808440394]. W.C. è stato finanziato dal CSC.

Il protocollo è stato rivisto e approvato dal comitato etico locale (numero di approvazione 287/2020B02).
1. Preparazione di piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio
<ol><li>Preparazione di soluzione madre di calcio (25 mM CaCl2·2H 2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O in tampone Tris)<ol>
<li>Preparare il tampone Tris da 1,0 M e regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl.</li>
		<li>Impostare un becher di vetro su...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. 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L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Qui descriviamo un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico utilizzando OC derivati ed espansi in vitro da PBMC. Le piastre di coltura cellulare rivestite in CaP utilizzate possono essere facilmente preparate e visualizzate utilizzando materiali disponibili in laboratorio. Oltre alle PBMC non selezionate adottate in questo protocollo, anche le OC generate da cellule monocitiche murine21 e cellule macrofagiche del midollo osseo17 sono...

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Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Gli osteoclasti (OC) sono macrofagi tessuto-specifici derivati da cellule staminali ematopoietiche (HSC), che svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento osseo insieme agli osteoblasti1. I disturbi ossei indotti da ormoni sessuali, immunologici e maligni che distruggono l'osso a livello sistemico o locale sono dovuti all'eccessiva attività osteoclastica, tra cui l'osteoporosi correlata alla menopausa2, l'artrite reumatoide3, la malattia parodontale4, la malattia ossea del mieloma5 e le metastasi ossee osteolitiche6. Al contrario, i difetti nella formazione e nella funzione dell'OC possono anche causare osteopetrosi7. Le HSC subiscono la differenziazione in progenitori OC sotto stimolazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, simbolo genico ACP5). In presenza sia di M-CSF che di attivatore recettoriale del ligando NF-κB (RANKL, simbolo genico TNFSF11), i progenitori OC si differenziano ulteriormente in OC mononucleati e successivamente si fondono per diventare OC multinucleati 8,9,10. Entrambe le citochine M-CSF e RANKL sono indispensabili e sufficienti per l'induzione di marcatori osteoclastici come il recettore della calcitonina (CT), l'attivatore del recettore del fattore nucleare κ B (RANK), la pompa protonica V-ATPasi, la subunità alfa del canale del cloruro 7 (CIC-7), l'integrina β3, la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP, simbolo genico ACP5), la cisteina lisosomiale proteasi catepsina K (CTSK) e la metallopeptidasi 9 della matrice (MMP9). Gli OC attivati formano una zona di tenuta sulla superficie ossea attraverso la formazione di un anello di actina con un bordo arruffato11,12. All'interno della zona di tenuta, gli OC mediano il riassorbimento attraverso la secrezione di protoni tramite la pompa protonica V-ATPasi 12,13, MMP914 e CTSK15, portando alla formazione di lacune.
Per esperimenti in vitro, i progenitori oc possono essere ottenuti mediante espansione di macrofagi del midollo osseo dal femore e dalla tibia16,17 dei topi, nonché mediante isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) da campioni di sangue e buffy coat 18,19,20, o mediante differenziazione delle cellule monocitiche murine immortalizzate RAW 264.7 21,22.
Nel presente protocollo, descriviamo un saggio di riassorbimento osteoclastico in piastre di coltura cellulare rivestite di CaP utilizzando OC derivati da PBMC primari. Il metodo delle piastre di coltura cellulare rivestite di CaP qui utilizzato è adottato e perfezionato dal metodo descritto in precedenza da Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Per ottenere precursori OC, i PBMC vengono isolati mediante centrifugazione a gradiente di densità ed espansi come descritto in precedenza20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Gli osteoclasti maturi sono cellule multinucleate che possono degradare l'osso attraverso la secrezione di acidi ed enzimi. Svolgono un ruolo cruciale in varie malattie (ad esempio, l'osteoporosi e il cancro alle ossa) e sono quindi importanti oggetti di ricerca. In vitro, la loro attività può essere analizzata dalla formazione di pozzi di riassorbimento. In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo di analisi dei pozzi che utilizza piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio (CaP), che possono essere facilmente visualizzate e quantificate. I precursori degli osteoclasti derivati da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati coltivati sulle piastre rivestite in presenza di stimoli osteoclastogeni. Dopo 9 giorni di incubazione, gli osteoclasti sono stati fissati e colorati per l'imaging a fluorescenza mentre il rivestimento CaP è stato controcolorato dalla calceina. Per quantificare l'area riassorbita, il rivestimento CaP sulle piastre è stato colorato con AgNO3 al 5% e visualizzato mediante imaging a campo luminoso. L'area della fossa di riassorbimento è stata quantificata utilizzando ImageJ.

Il rivestimento di fosfato di calcio sul fondo delle piastre di coltura cellulare è stato eseguito in due fasi di rivestimento comprendenti una precalcificazione di 3 giorni e una fase di calcificazione di 1 giorno. Come mostrato nella Figura 1, il fosfato di calcio uniformemente distribuito è stato ottenuto sul fondo delle piastre a 96 pozzetti. Il rivestimento ha aderito molto bene al fondo dopo le fasi di lavaggio eseguite.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-p...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Il nostro protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico. L'uso di piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio può essere facilmente preparato e visualizzato utilizzando i materiali disponibili in laboratorio. A differenza delle fette opache di ossa o dentine, il rivestimento in fosfato di calcio consente la visualizzazione di pozzi di riassorbimento e cellule allo stesso tempo.In questo protocollo, utilizziamo PBMC per la differenziazione degli osteoclasti. Tuttavia, può anche essere applicato ad altri tipi di cellule come i monociti derivati dal midollo osseo o le cellule Raw 264.7. Per prima cosa prendi una piastra di coltura cellulare a fondo piatto da 96 pozzi e pipetta 300 microlitri di soluzione di fosfato di calcio precedentemente preparata in ciascun pozzetto.Quindi, coprire la piastra con il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre giorni. Dopo tre giorni, aspirare la soluzione di precalcificazione dalle piastre di coltura cellulare pre-calcificate a 96 pozzetti e aggiungere 300 microlitri di soluzione di fosfato di calcio a ciascun pozzetto. Coprire le piastre con un coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per un giorno.Quindi capovolgere la piastra per versare la soluzione e lavare accuratamente la piastra tre volte con acqua deionizzata. Asciugare immediatamente la piastra utilizzando un asciugacapelli o anidride carbonica compressa o azoto gassoso per mantenere una superficie uniforme. Ora, irradiare la piastra rivestita su un banco pulito con raggi ultravioletti per un'ora.Utilizzare immediatamente la piastra rivestita o sigillare la piastra con Parafilm e conservarla a temperatura ambiente. Diluire 15 millilitri di sangue fresco con un volume uguale di PBS e mescolarli invertendo o pipettando più volte. Quindi prendere 15 millilitri di soluzione di gradiente di densità in un tubo conico da 50 millilitri, inclinare il tubo e stratificare accuratamente 30 millilitri di campione di sangue diluito sulla soluzione di gradiente di densità da 15 millilitri.Successivamente, centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante senza interruzione a 810 volte G per 20 minuti a 20 gradi Celsius. Quindi aspirare lo strato superiore lasciando indisturbato lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia. Trasferire con attenzione lo strato cellulare mononucleare in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Riempire il tubo con PBS, mescolare e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Sospendere nuovamente i PBMC in un alfa-MEM completo contenente 20 nanogrammi per millilitro fattore stimolante la colonia di macrofagi e seminare 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per centimetro quadrato PBMC in un pallone. Incubare le piastre rivestite di fosfato di calcio con 50 microlitri di siero bovino fetale a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, lavare il pallone due volte con PBS per staccare i precursori dell'osteoclasti da cellule morte o non aderenti, quindi aggiungere quattro millilitri di tripsina per pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 30 minuti, interrompere la digestione aggiungendo quattro millilitri di alfa-MEM completo, quindi staccare accuratamente le cellule usando un raschietto cellulare. Trasferire le celle in un tubo da 50 millilitri e contare il numero totale di celle utilizzando una camera di conteggio.Centrifugare il tubo a 350 volte G per sette minuti per pellettizzare le celle e risuscimare il pellet e completare alfa MEM contenente M-CSF e RANKL per ottenere una volta 10 alle sei celle per millilitro. Aspirare il siero bovino fetale dalla piastra rivestita di fosfato di calcio e pipettare 200 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS.Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide per 10 minuti e lavare di nuovo con PBS. Per la colorazione, aggiungere un tampone di permeabilizzazione alle cellule fisse e incubarle per cinque minuti. Per colorare i filamenti di actina, incubare le cellule con 100 microlitri di Alexa Fluor 546 soluzione di falloidina marcata in PBS per 30 minuti, quindi aspirare la soluzione colorante e macchiare i nuclei usando 100 microlitri di Hoechst per 10 minuti.Rivestimento in fosfato di calcio colorato con 100 microlitri di calceina micromolare e PBS per 10 minuti. Dopo aver lavato tre volte con PBS, cattura le immagini. Per la colorazione von Kossa del rivestimento in fosfato di calcio aggiungere 50 microlitri di nitrato d'argento al 5% e acqua deionizzata a ciascun pozzo e incubare la piastra sotto radiazione ultravioletta per un'ora fino a quando il rivestimento sul fondo dei pozzetti è diventato marrone.Il rivestimento di fosfato di calcio nella parte inferiore delle piastre del pozzo 96 sembrava essere uniforme e ben aderente. Dopo nove giorni di coltura in M-CSF e RANKL sulle piastre rivestite di fosfato di calcio, i precursori degli osteoclasti hanno formato pozzi di riassorbimento e grandi osteoclasti. Gli osteoclasti multinucleati situati nelle fosse esprimevano alti livelli di TRAP.Gli osteoclasti maturi hanno mostrato la presenza di tre o più nuclei e l'anello di actina distinto. Il rivestimento verde di fosfato di calcio ha mostrato la presenza di pozzi di riassorbimento nero. Le immagini di fluorescenza dell'area della fossa sono state misurate utilizzando lo strumento di soglia dell'immagine J.Il numero e le dimensioni degli osteoclasti sono stati calcolati utilizzando il ROI manager e lo strumento di selezione dei poligoni dell'immagine I precursori di J.Osteoclasts cresciuti in assenza di RANKL non potevano formare pozzi di riassorbimento, tuttavia M-CSF e RANKL hanno facilitato la formazione di fosse osteoclastogeniche.E l'area della fossa è stata quantificata utilizzando l'immagine J.Asciugare immediatamente la piastra rivestita con flusso d'aria aiuta a creare un rivestimento uniforme di fosfato di calcio. Altrimenti è incline a formare un rivestimento più spesso nel mezzo del pozzo.

Research

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