Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

이 작품은 부분적으로 중국 장학금위원회 (CSC No. 201808440394)가 자금을 지원했습니다. W.C.는 CSC에 의해 자금을 조달했다.

이 프로토콜은 지역 윤리위원회 (승인 번호 287/2020B02)에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 인산칼슘이 코팅된 세포배양접시의 제조
<ol><li>칼슘 원액의 제조 (트리스 완충액 중 25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mMMgCl2·6H2O)<ol>
<li>1.0 M 트리스 완충액을 준비하고 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.</li>
		<li>마그네틱 교반기에 유리 비커?...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

여기서는 PBMCs로부터 시험관내에서 유도되고 확장된 OCs를 이용한 파골세포 재흡수 분석에 대한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트는 실험실에서 이용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 제조되고 시각화될 수 있다. 이 프로토콜에 채택된 분류되지 않은 PBMCs 이외에도, 뮤린 단핵구 세포(21 ) 및 골수 대식세포 세포(17</s...

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An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

파골세포 (OCs)는 조혈 줄기 세포 (HSCs)로부터 유래 된 조직 특이적 대식세포이며, 조골 세포1과 함께 뼈 리모델링에 중추적 인 역할을합니다. 전신 또는 국부적으로 뼈를 파괴하는 성 호르몬 유도, 면역학적 및 악성 골 장애는 폐경기 관련 골다공증2, 류마티스 관절염3, 치주 질환4, 골수종 골 질환5, 및 골용해성 골 전이6를 포함하는 과도한 골형성 활성에 기인한다. 대조적으로, OC 형성 및 기능의 결함은 또한 골페트로시스7를 야기할 수 있다. HSCs는 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF, 유전자 기호 ACP5) 자극 하에 OC 선조로 분화를 겪는다. NF-κB 리간드 (RANKL, 유전자 기호 TNFSF11)의 M-CSF 및 수용체 활성화제 둘 다의 존재하에, OC 선조는 단핵 OCs로 더 분화되고 이어서 융합되어 다핵 OCs 8,9,10이 된다. 사이토카인 M-CSF 및 RANKL 둘 다 칼시토닌 수용체 (CT), 핵 인자 κB의 수용체 활성화제 (RANK), 양성자 펌프 V-ATPase, 클로라이드 채널 7 알파 서브유닛 (CIC-7), 인테그린 β3, 타르트레이트 내성 산 포스파타제 (TRAP, 유전자 기호 ACP5), 리소좀 시스테인 프로테아제 카텝신 K (CTSK), 및 매트릭스 메탈로펩티다제 9 (MMP9)와 같은 파골세포 마커의 유도에 필수적이며 충분하다. 활성화된 OCs는 주름진 경계(11,12)를 갖는 액틴 링의 형성을 통해 뼈 표면 상에 밀봉 구역을 형성한다. 밀봉 영역 내에서, OCs는 양성자 펌프 V-ATPase 12,13, MMP914 및 CTSK15를 통해 양성자 분비를 통해 재흡수를 매개하여, 라쿠나의 형성을 유도한다.
시험관내 실험을 위해, OC 선조는 마우스의 대퇴 골 및 경골 16,17로부터 골수 대식세포의 확장뿐만 아니라, 혈액 샘플 및 버피 코트 18,19,20으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 단리에 의해, 또는 불멸화된 뮤린 단핵구 세포 RAW 264.7 21,22의 분화에 의해 수득될 수 있다.
본 프로토콜에서, 우리는 일차 PBMCs로부터 유래된 OCs를 사용하는 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트에서의 파골세포 재흡수 검정을 기술한다. 여기에 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트 방법은 Patntirapong et al.17 및 Maria et al.21에 의해 이전에 기술된 방법으로부터 채택되고 정제된다. OC 전구체를 얻기 위해, PBMCs는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리되고 앞서 기술된 바와 같이 팽창된다(20).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

성숙한 파골세포는 산과 효소의 분비를 통해 뼈를 분해할 수 있는 다핵 세포입니다. 그들은 다양한 질병 (예 : 골다공증 및 골암)에서 중요한 역할을하므로 연구의 중요한 대상입니다. 시험관 내에서, 그들의 활성은 재흡수 구덩이의 형성에 의해 분석 될 수있다. 이 프로토콜에서는 인산칼슘(CaP) 코팅된 세포 배양 플레이트를 사용하는 간단한 피트 분석 방법을 설명하며, 이는 쉽게 시각화되고 정량화될 수 있습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 유래된 파골세포 전구체를 파골세포형성 자극의 존재 하에 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 인큐베이션 9일 후, 파골세포를 고정시키고 형광 이미징을 위해 염색하는 한편, CaP 코팅은 칼세인에 의해 역염색되었다. 재흡수된 영역을 정량화하기 위해, 플레이트 상의 CaP 코팅을 5% AgNO3로 염색하고 브라이트필드 이미징에 의해 시각화하였다. 재흡수 구덩이 면적을 ImageJ를 사용하여 정량화하였다.

세포 배양 플레이트의 바닥에 인산칼슘 코팅은 3-일 예비 석회화 및 1-일 석회화 단계를 포함하는 두 가지 코팅 단계로 수행되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균일하게 분포된 인산칼슘은 96-웰 플레이트의 바닥에 얻어졌다. 코팅은 세척 단계를 수행한 후에 바닥에 매우 잘 부착되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/f...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

우리의 프로토콜은 파골세포 재흡수 분석을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트의 사용은 실험실 사용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 준비하고 시각화 할 수 있습니다. 불투명 한 뼈 또는 상아질 조각과는 달리, 인산 칼슘 코팅은 재흡수 구덩이와 세포를 동시에 시각화 할 수 있습니다.이 프로토콜에서는 파골세포 분화를 위해 PBMC를 사용합니다. 그러나 골수 유래 단핵구 또는 Raw 264.7 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 먼저 평평한 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트와 이전에 준비된 인산 칼슘 용액 300 마이크로 리터를 각 웰에 피펫으로 가져 간다.그런 다음, 플레이트를 뚜껑으로 덮고 플레이트를 섭씨 37도에서 3일 동안 인큐베이션한다. 3 일 후, 사전 석회화 된 96 웰 세포 배양 플레이트에서 사전 석회화 용액을 흡인하고 300 마이크로 리터의 인산 칼슘 용액을 각 웰에 첨가하십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 37도에서 하루 동안 배양하십시오.그런 다음 접시를 뒤집어 용액을 붓고 탈이온수로 접시 세 번을 철저히 씻으십시오. 즉시 헤어 드라이어를 사용하여 플레이트를 건조하거나 균일 한 표면을 유지하기 위해 압축 된 이산화탄소 또는 질소 가스를 사용하십시오. 이제 코팅 된 플레이트를 깨끗한 벤치에 자외선으로 한 시간 동안 조사하십시오.코팅 된 플레이트를 즉시 사용하거나 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하고 실온에서 보관하십시오. 15 밀리리터의 신선한 혈액을 동일한 양의 PBS로 희석하고 여러 번 뒤집거나 피펫팅하여 혼합하십시오. 그런 다음 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 15 밀리리터의 밀도 구배 용액을 취하여 튜브를 기울인 다음 희석 된 혈액 샘플 30 밀리리터를 밀도 구배 용액 15 밀리리터에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.나중에, 튜브를 810배 G에서 휴식 없이 스윙 버킷 로터에서 섭씨 20도에서 20분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상층을 흡인하여 단핵 세포층을 계면에서 방해받지 않고 남겨 둡니다. 조심스럽게 단핵 세포층을 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.튜브를 PBS로 채우고, 섭씨 20도에서 10분 동안 300배 G에서 혼합하고, 원심분리한다. PBMCs를 밀리리터 당 20 나노그램의 대식세포 콜로니 자극 인자를 함유하는 완전한 알파-MEM에 재현탁하고, 플라스크에서 2.5배 센티미터 평방 PBMCs당 5 세포를 10배 시드한다. 인산칼슘 코팅된 플레이트를 섭씨 37도에서 50마이크로리터의 태아 소 혈청으로 한 시간 동안 배양한다.다음으로, 플라스크를 PBS로 두 번 세척하여 파골세포 전구체를 죽은 세포 또는 부착되지 않은 세포로부터 분리한 다음, 75 평방 센티미터 플라스크 당 네 밀리리터의 트립신을 첨가한다. 30 분 후, 네 밀리리터의 완전한 알파 MEM을 첨가하여 소화를 중단 한 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 분리하십시오. 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 카운팅 챔버를 사용하여 총 셀 수를 계산하십시오.튜브를 7분 동안 350배 G에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 펠릿을 소생시키고 M-CSF 및 RANKL을 함유하는 완전한 알파 MEM을 밀리리터당 6개의 세포에 1회 10회 수득한다. 인산칼슘 코팅 플레이트로부터 소 태아 혈청을 흡인하고, 웰 당 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫한다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 두 번 세척한다.세포를 10분 동안 4%파라포름알데히드로 고정시키고 PBS로 다시 세척한다. 염색을 위해, 고정된 세포에 투과 완충액을 첨가하고, 이들을 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 액틴 필라멘트를 염색하기 위해, 세포를 PBS 중의 100 마이크로리터의 알렉사 플루오르 546 표지된 팔로이딘 용액으로 30분 동안 인큐베이션한 다음, 염색 용액을 흡인하고 10분 동안 100 마이크로리터의 Hoechst를 사용하여 핵을 염색한다.10분 동안 10 마이크로몰 칼세인 및 PBS의 100 마이크로리터로 인산칼슘 코팅을 얼룩지게 하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 이미지를 캡처한다. 인산 칼슘 코팅의 Von Kossa 염색을 위해 5 % 질산은 및 탈 이온수 50 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하고 웰 바닥의 코팅이 갈색으로 변할 때까지 한 시간 동안 자외선으로 플레이트를 배양하십시오.96 웰 플레이트의 바닥에있는 인산 칼슘 코팅은 균일하고 잘 접착 된 것으로 나타났습니다. 인산칼슘 코팅 플레이트 상에서 M-CSF 및 RANKL에서 아홉 일간 배양한 후, 파골세포 전구체는 재흡수 구덩이 및 큰 파골세포를 형성하였다. 구덩이에 위치한 다핵 파골세포는 높은 TRAP 수준을 나타냈다.성숙한 파골세포는 세 개 이상의 핵과 뚜렷한 액틴 고리의 존재를 보여주었다. 녹색 인산 칼슘 코팅은 검은 재 흡수 구덩이의 존재를 보여주었습니다. 구덩이 영역 형광 이미지는 이미지 J의 임계 도구를 사용하여 측정되었습니다.파골세포의 수와 크기는 ROI 관리자를 사용하여 계산되었으며 RANKL이없는 상태에서 자란 J.Osteoclasts의 전구체는 재흡수 구덩이를 형성 할 수 없었지만 M-CSF와 RANKL은 파골 세포 생성 구덩이의 형성을 촉진했습니다.그리고 피트 면적을 이미지 J.Immediately 기류로 코팅된 플레이트를 건조시켜 균일한 인산칼슘 코팅을 만드는 데 도움을 주어 정량하였다. 그렇지 않으면 우물 중앙에 더 두꺼운 코팅을 형성하기 쉽습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

각막 공촛점 현미경 : 주변 Neuropathies에 작은 광섬유 병리를 정할 소설 비침습 기술

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

연구

의학

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

마우스의 Parabiosis : 자세한 프로토콜

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

세포 유전 분광법을 사용하여 특발성 척추 측만증의 예후 예측을위한 세포 기반 분석 프로토콜

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...