Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert av China Scholarship Council [CSC No. 201808440394]. W.C. ble finansiert av CSC.

Protokollen ble gjennomgått og godkjent av den lokale etikkkomiteen (godkjenningsnummer 287/2020B02).
1. Fremstilling av kalsiumfosfatbelagte cellekulturplater
<ol><li>Tilberedning av kalsiumbestandsoppløsning (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O i Tris buffer)<ol>
<li>Forbered 1,0 M Tris buffer og juster pH til 7,4 ved hjelp av 1 M HCl.</li>
		<li>Sett opp et glassbeger på en magnetisk omrører og tilsett 100 ml ...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Her beskriver vi en enkel og pålitelig metode for en osteoklastisk resorpsjonsanalyse ved hjelp av OCer avledet og utvidet in vitro fra PBMCer. De brukte CaP-belagte cellekulturplatene kan enkelt tilberedes og visualiseres ved hjelp av lab-tilgjengelige materialer. I tillegg til usorterte PBMCer vedtatt i denne protokollen, har OCer generert fra murine monocytiske celler21 og benmargsmakrofagceller17 også blitt dyrket på lignende syntetiske substrater for pitana...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Osteoklaster (OCs) er vevsspesifikke makrofager avledet fra hematopoietiske stamceller (HSC), som spiller en sentral rolle i beinoppussing sammen med osteoblaster1. Kjønnshormoninduserte, immunologiske og ondartede bensykdommer som ødelegger bein systemisk eller lokalt skyldes overflødig osteoklastisk aktivitet, inkludert overgangsalderrelatert osteoporose2, revmatoid artritt3, periodontal sykdom4, myeloma bensykdom5 og osteolytisk benmetastase6. I motsetning kan defekter i OC-dannelse og funksjon også forårsake osteopetrose7. HSC gjennomgår differensiering i OC-forfedre under makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF, gensymbol ACP5) stimulering. I nærvær av både M-CSF og reseptoraktivator av NF-κB ligand (RANKL, gensymbol TNFSF11), skiller OC-forfedre seg lenger inn i mononukleære OCer og smelter deretter sammen for å bli multinukleerte OCer 8,9,10. Både cytokiner M-CSF og RANKL er uunnværlige og tilstrekkelige for induksjon av osteoklastiske markører som calcitoninreseptor (CT), reseptoraktivator av kjernefysisk faktor κ B (RANK), protonpumpe V-ATPase, kloridkanal 7 alfaunderenhet (CIC-7), integrin β3, tartratresistent syrefosfatase (TRAP, gensymbol ACP5), lysosomal cysteinproteasekatepiks K (CTSK) og matrisemetalllopeptidase 9 (MMP9). Aktiverte OCer danner en tetningssone på beinoverflaten gjennom dannelsen av en aktinring med en ruffled grense11,12. Innenfor tetningssonen formidler OCs resorpsjon gjennom utskillelse av protoner via protonpumpen V-ATPase12,13, MMP914 og CTSK15, noe som fører til dannelse av lacunae.
For in vitro-eksperimenter, OC-forfedre kan oppnås ved utvidelse av benmargsmakrofager fra musenes lårben og tibia16,17, samt ved isolering av humane perifere blodmonykleære celler (PBMCer) fra blodprøver og buffy strøk 18,19,20, eller ved differensiering av de udødelige murinmonytiske cellene RAW 264.7 21,22.
I den nåværende protokollen beskriver vi en osteoklastisk resorpsjonsanalyse i CaP-belagte cellekulturplater ved hjelp av OCer avledet fra primære PBMCer. CaP-belagte cellekulturplater metoden som brukes her er vedtatt og raffinert fra metoden beskrevet tidligere av Patntirapong et al.17 og Maria et al.21. For å oppnå OC-forløpere isoleres PBMCer av tetthetsgraderingssentrifugering og utvides som beskrevet tidligere20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Eldre osteoklaster er multinukleerte celler som kan forringe bein gjennom sekresjon av syrer og enzymer. De spiller en avgjørende rolle i ulike sykdommer (f.eks. osteoporose og beinkreft) og er derfor viktige forskningsobjekter. In vitro, deres aktivitet kan analyseres ved dannelsen av resorpsjonsgraver. I denne protokollen beskriver vi en enkel pitanalysemetode ved hjelp av kalsiumfosfat (CaP) belagte cellekulturplater, som lett kan visualiseres og kvantifiseres. Osteoklastforløpere avledet fra humane perifere blodmonykleære celler (PBMCer) ble dyrket på de belagte platene i nærvær av osteoklastogene stimuli. Etter 9 dager med inkubasjon ble osteoklaster festet og farget for fluorescensavbildning mens CaP-belegget ble motvirket av calcein. For å kvantifisere det resorberte området ble CaP-belegget på plater farget med 5% AgNO3 og visualisert av brightfield imaging. Resorpsjonsgropområdet ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ.

Kalsiumfosfatbelegget på bunnen av cellekulturplater ble utført i to beleggtrinn som består av en 3-dagers forkalkning og et 1-dagers forkalkningstrinn. Som vist i figur 1 ble det oppnådd ensartet fordelt kalsiumfosfat på bunnen av 96-brønnsplatene. Belegget festet seg veldig godt til bunnen etter de utførte vasketrinnene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64016/64016fig01.jpg"> <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Her presenterer vi en enkel og effektiv analyseprosedyre for resorpsjonsgropanalyser ved hjelp av kalsiumfosfatbelagte cellekulturplater.

En enkel pitanalyseprotokoll for å visualisere og kvantifisere osteoklastisk resorpsjon i Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Vår protokoll beskriver en enkel og pålitelig metode for en osteoklastisk resorpsjonsanalyse. Bruken av kalsiumfosfatbelagte cellekulturplater kan enkelt tilberedes og visualiseres ved hjelp av laboratorie tilgjengelige materialer. I motsetning til ugjennomsiktige ben- eller dentinskiver, tillater kalsiumfosfatbelegget visualisering av resorpsjonsgraver og celler samtidig.I denne protokollen bruker vi PBMCer for osteoklastdifferensiering. Imidlertid kan den også brukes på andre celletyper som benmargavledede monocytter eller Raw 264.7-celler. Ta først en flat bunn 96 brønncellekulturplate og pipette 300 mikroliter tidligere tilberedt kalsiumfosfatoppløsning i hver brønn.Dekk deretter platen med lokket og inkuber platen ved 37 grader Celsius i tre dager. Etter tre dager aspirerer du forkalkningsløsningen fra de forhåndskalkede 96 brønncellekulturplatene og tilsetter 300 mikroliter kalsiumfosfatoppløsning til hver brønn. Dekk platene med et lokk og inkuber ved 37 grader Celsius i en dag.Snu deretter platen for å helle ut løsningen og vask platen tre ganger grundig med deionisert vann. Tørk platen umiddelbart med en hårføner eller komprimert karbondioksid eller nitrogengass for å opprettholde en jevn overflate. Bestråle den belagte platen på en ren benk med ultrafiolette stråler i en time.Bruk den belagte platen umiddelbart eller forsegle platen med Parafilm og oppbevar den ved romtemperatur. Fortynn 15 milliliter friskt blod med like mye PBS og bland dem ved å invertere eller pipettere flere ganger. Ta deretter 15 milliliter tetthetsgradientløsning i et 50 milliliter konisk rør, vipp røret og legg forsiktig 30 milliliter fortynnet blodprøve på 15 milliliter tetthetsgradientløsning.Senere sentrifugerer røret i en svingende bøtterotor uten pause ved 810 ganger G i 20 minutter ved 20 grader Celsius. Aspirer deretter det øvre laget slik at det mononukleære cellelaget blir uforstyrret ved grensesnittet. Overfør forsiktig det mononukleære cellelaget til et nytt konisk rør på 50 milliliter.Fyll røret med PBS, bland og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter ved 20 grader Celsius. Re-suspendere PBMCs i en komplett alfa-MEM som inneholder 20 nanogram per milliliter makrofag koloni stimulerende faktor, og frø 2,5 ganger 10 til femte celler per centimeter kvadratiske PBMCer i en kolbe. Inkuber kalsiumfosfatbelagte plater med 50 mikroliter føtal bovin serum ved 37 grader Celsius i en time.Deretter vasker du kolben to ganger med PBS for å løsne osteoklastforløperne fra døde eller ikke-tilhengerceller, og tilsett deretter fire milliliter trypsin per 75 kvadratcentimeter kolbe. Etter 30 minutter, stopp fordøyelsen ved å legge til fire milliliter komplett alfa-MEM, og koble deretter forsiktig fra cellene ved hjelp av en celleskraper. Overfør cellene til et 50 milliliterrør og tell det totale antall celler ved hjelp av et tellekammer.Sentrifuger røret ved 350 ganger G i syv minutter for å pellet cellene og resusspender pellet og komplett alfa MEM som inneholder M-CSF og RANKL for å få en ganger 10 til de seks cellene per milliliter. Aspirer fosterets bovinserum fra kalsiumfosfatbelagt plate, og pipette 200 mikroliter celleoppheng per brønn. Etter inkubasjonen, vask cellene to ganger med PBS.Fest cellene med 4% paraformaldehyd i 10 minutter og vask igjen med PBS. For farging, legg til permeabiliseringsbuffer til de faste cellene og inkuber dem i fem minutter. For å flekke aktinfilamentene, inkuber cellene med 100 mikrolitere av Alexa Fluor 546 merket falloidinoppløsning i PBS i 30 minutter, aspirer deretter fargeløsningen og flekk nukleiene ved hjelp av 100 mikroliter Hoechst i 10 minutter.Flekk kalsiumfosfatbelegg med 100 mikroliter 10 mikromolar calcein og PBS i 10 minutter. Etter å ha vasket tre ganger med PBS, ta bilder. For Von Kossa farging av kalsiumfosfatbelegg tilsett 50 mikroliter 5% sølvnitrat og deionisert vann til hver brønn, og inkuber platen under ultrafiolett stråling i en time til belegget på bunnen av brønnene har blitt brunt.Kalsiumfosfatbelegget på bunnen av de 96 brønnplatene så ut til å være ensartede og godt festet. Etter ni dager med kultur i M-CSF og RANKL på kalsiumfosfatbelagte plater dannet osteoklastforløpere resorpsjonsgraver og store osteoklaster. De multi-nukleerte osteoklastene som ligger i gropene uttrykte høye TRAP nivåer.De modne osteoklastene viste tilstedeværelsen av tre eller flere kjerner og den distinkte aktinringen. Det grønne kalsiumfosfatbelegget viste tilstedeværelsen av svarte resorpsjonsgraver. Pitområdet fluorescens bilder ble målt ved hjelp av thresholding verktøyet av bilde J.Antall og størrelse på osteoklaster ble beregnet ved hjelp av ROI manager og polygon utvalg verktøyet av bilde J.Osteoclasts'forløpere vokst i fravær av RANKL kunne ikke danne resorpsjon groper, men M-CSF og RANKL forenklet dannelsen av osteoklastogene groper.Og pitområdet ble kvantifisert ved hjelp av bilde J.Umiddelbart tørking av den belagte platen med luftstrøm bidrar til å lage et jevnt kalsiumfosfatbelegg. Ellers er det tilbøyelig til å danne et tykkere belegg midt i brønnen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metode for Mouse Lung Intubasjon

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

En følsom metode for å kvantifisere senescent kreftceller

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis i Mus: En detaljert protokoll

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Cell-baserte analyseprotokollen for den prognostiske Prediksjon av idiopatisk skoliose Bruke Cellular Dielektrisk spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

En enkel Kritisk store Femoral Defect Model i Mus

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

En enkel enhet å raskt Forbered Hele Mounts av Mouse Tarm

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En høy gjennomstrømning, multiplekset og målrettet proteomikk CSF-analyse for å kvantifisere nevrodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E-isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...