Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho de Bolsas da China [CSC No. 201808440394]. W.C. foi financiado pelo CSC.

O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local (aprovação nº 287/2020B02).
1. Preparação de placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio
<ol><li>Preparação de solução de estoque de cálcio (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O no buffer Tris)<ol>
<li>Prepare o buffer tris de 1,0 M e ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl.</li>
		<li>Configure um béquer de vidro em um agitador mag...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas21 e células macrófagos de medula óssea17 também...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos1. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa2, artrite reumatoide3, doença periodontal4, doença óssea de mieloma5 e metástaseóssea osteolítica 6. Em contraste, defeitos na formação e função de OC também podem causar osteopetrose7. Os HSCs sofrem diferenciação em progenitores oC sob fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). Na presença tanto do M-CSF quanto do ativador receptor de ligante NF-κB (RANKL, símbolo genético TNFSF11), os progenitores OC se diferenciam ainda mais em OCs mononucleares e, posteriormente, fundem-se para se tornarem OCs multinucleados 8,9,10. Ambas as citocinas M-CSF e RANKL são indispensáveis e suficientes para a indução de marcadores osteoclásticos como receptor de calcitonina (TC), ativador receptor do fator nuclear κ B (RANK), bomba de prótons V-ATPase, subunidade alfa do canal 7 cloreto (CIC-7), integrin β3, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, símbolo genético ACP5), catarsina de cissinosa lysomal protease K (CTSK) e matriz metallopeptidase 9 (MMP9). Os OCs ativados formam uma zona de vedação na superfície óssea através da formação de um anel de actina com uma borda de babados11,12. Dentro da zona de vedação, os OCs mediam a resorção através de prótons secretando através da bomba de prótons V-ATPase12,13, MMP914 e CTSK15, levando à formação de lacunas.
Para experimentos in vitro, progenitores oC podem ser obtidos pela expansão de macrófagos de medula óssea do fêmur e tíbia16,17, bem como pelo isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) a partir de amostras de sangue e casacos buffy 18,19,20, ou pela diferenciação das células monocíticas murinas imortalizadas RAW 264,7 21,22.
No presente protocolo, descrevemos um ensaio de ressorção osteoclástica em placas de cultura celular revestidas de CaP usando OCs derivados de PBMCs primários. O método de placas de cultura celular revestida de CaP utilizado aqui são adotados e refinados a partir do método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Para obter precursores de OC, os PBMCs são isolados por centrifugação gradiente de densidade e expandidos como descrito anteriormente20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO3 e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.

O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das placas de cultura celular foi realizado em duas etapas de revestimento que compreendem uma pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. Como mostrado na Figura 1, o fosfato de cálcio distribuído uniformemente foi obtido na parte inferior das placas de 96 poços. O revestimento aderiu muito bem ao fundo após as etapas de lavagem realizadas.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-page=...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Nosso protocolo descreve um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica. O uso de placas de cultura celular revestida de fosfato de cálcio pode ser facilmente preparado e visualizado usando materiais disponíveis em laboratório. Em contraste com as fatias opacas de osso ou dentina, o revestimento de fosfato de cálcio permite a visualização de poços de ressorção e células ao mesmo tempo.Neste protocolo, usamos PBMCs para diferenciação osteoclasta. No entanto, também pode ser aplicado a outros tipos de células, como monócitos derivados da medula óssea ou células Raw 264.7. Primeiro pegue uma placa de cultura de células de fundo plano 96 e pipeta 300 microliters de solução de fosfato de cálcio previamente preparada em cada poço.Em seguida, cubra a placa com a tampa e incubar a placa a 37 graus Celsius por três dias. Após três dias, aspire a solução de pré-calcificação a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicione 300 microliters de solução de fosfato de cálcio a cada poço. Cubra as placas com uma tampa e incubar a 37 graus Celsius por um dia.Em seguida, inverta a placa para derramar a solução e lave bem a placa três vezes com água desionizada. Seque imediatamente a placa usando um secador de cabelo ou dióxido de carbono comprimido ou gás nitrogênio para manter uma superfície uniforme. Agora, irradie a placa revestida em um banco limpo com raios ultravioletas por uma hora.Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com Parafilm e armazene-a em temperatura ambiente. Diluir 15 mililitros de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturá-los invertendo ou pipetando várias vezes. Em seguida, pegue 15 mililitros de solução gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mililitros, incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mililitros de amostra de sangue diluído nos 15 mililitros da solução de gradiente de densidade.Mais tarde, centrifufique o tubo em um rotor de balde balançando sem quebrar a 810 vezes G por 20 minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, aspire a camada superior deixando a camada de célula mononuclear intacta na interface. Transfira cuidadosamente a camada da célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Suspenda os PBMS em um ALFA-MEM completo contendo 20 nanogramas por fator estimulante da colônia de macrófagos mililitros, e sementes 2,5 vezes 10 às quintas células por centímetro quadrado PBMCs em um frasco. Incubar as placas revestidas de fosfato de cálcio com 50 microliters de soro bovino fetal a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, lave o frasco duas vezes com PBS para separar os precursores osteoclantes de células mortas ou não aderentes, em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina por frasco de 75 centímetros quadrados. Após 30 minutos, pare a digestão adicionando quatro mililitros de alfa-MEM completo, em seguida, desprende cuidadosamente as células usando um raspador de células. Transfira as células para um tubo de 50 mililitros e conte o número total de células usando uma câmara de contagem.Centrifugar o tubo a 350 vezes G durante sete minutos para pelotar as células e reutilizar a pelota e mem alfa completo contendo M-CSF e RANKL para obter uma vezes 10 para as seis células por mililitro. Aspire o soro bovino fetal da placa revestida de fosfato de cálcio, e pipeta 200 microliters de suspensão celular por poço. Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS.Fixar as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lavar novamente com PBS. Para coloração, adicione o tampão de permeabilização às células fixas e incuba-as por cinco minutos. Para manchar os filamentos de actina, incubar as células com 100 microliters de Alexa Fluor 546 rotulada solução de faloideina na PBS por 30 minutos, em seguida, aspirar a solução de coloração e manchar os núcleos usando 100 microliters de Hoechst por 10 minutos.Colorir o revestimento de fosfato de cálcio com 100 microliters de 10 micromolars de calceína e PBS por 10 minutos. Depois de lavar três vezes com PBS, capture imagens. Para Von Kossa, a coloração do revestimento de fosfato de cálcio adiciona 50 microliters de 5% de nitrato de prata e água desionizada a cada poço, e incuba a placa sob radiação ultravioleta por uma hora até que o revestimento na parte inferior dos poços fique marrom.O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das 96 placas pareciam ser uniformes e bem aderidos. Após nove dias de cultura em M-CSF e RANKL nas placas revestidas de fosfato de cálcio, precursores de osteoclato formaram poços de resorção e grandes osteoclartos. Os osteoclastas multinucleados localizados nos poços expressaram altos níveis de TRAP.Os osteoclastos maduros mostraram a presença de três ou mais núcleos e o anel de actina distinto. O revestimento de fosfato de cálcio verde mostrou a presença de poços de resorção preto. As imagens de fluorescência da área do poço foram medidas utilizando-se a ferramenta de limiar de imagem J.O número e o tamanho dos osteoclatos foram calculados utilizando-se o gerente do ROI e a ferramenta de seleção de polígonos dos precursores da imagem J.Osteoclasts cultivadas na ausência de RANKL não conseguiam formar poços de resorção, porém M-CSF e RANKL facilitaram a formação de poços osteoclastogênicos.E a área do poço foi quantificada usando imagem J.Imediatamente secando a placa revestida com fluxo de ar ajuda a fazer um revestimento uniforme de fosfato de cálcio. Caso contrário, é propenso a formar um revestimento mais grosso no meio do poço.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Medicina

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

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Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

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