Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

Эта работа была частично профинансирована Китайским стипендиальным советом [CSC No 201808440394]. W.C. финансировался CSC.

Протокол был рассмотрен и одобрен местным комитетом по этике (номер одобрения 287/2020B02).
1. Приготовление пластин для культивирования клеток, покрытых фосфатом кальция
<ol><li>Приготовление раствора кальция (25 мМ CaCl2·2H2O, 1,37 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2·6H2O в б?...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Здесь мы описываем простой и надежный метод анализа остеокластической резорбции с использованием OC, полученных и расширенных in vitro из PBMCs. Используемые пластины для культивирования клеток с покрытием CaP могут быть легко подготовлены и визуализированы с использованием лабораторны...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Остеокласты (OC) представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из гемопоэтических стволовых клеток (HSC), играющие ключевую роль в ремоделировании кости вместе с остеобластами1. Вызванные половыми гормонами, иммунологические и злокачественные заболевания костей, которые разрушают кости системно или локально, обусловлены избыточной остеокластической активностью, включая остеопороз, связанный с менопаузой2, ревматоидный артрит3, пародонтоз4, заболевание кости миеломы5 и остеолитическое метастазирование в кости6. Напротив, дефекты образования и функции OC также могут вызывать остеопетроз7. ГСК подвергаются дифференцировке в предшественники OC при стимуляции макрофагов колониестимулирующим фактором (M-CSF, символ гена ACP5). В присутствии как M-CSF, так и рецепторного активатора лиганда NF-κB (RANKL, символ гена TNFSF11), предшественники OC дифференцируются далее в мононуклеарные OC и впоследствии сливаются, чтобы стать многоядернымиOC 8,9,10. Оба цитокина M-CSF и RANKL незаменимы и достаточны для индукции остеокластических маркеров, таких как рецептор кальцитонина (CT), активатор рецептора ядерного фактора κ B (RANK), протонная помпа V-АТФазы, альфа-субъединица хлоридного канала 7 (CIC-7), интегрин β3, тартраторезистентная кислая фосфатаза (TRAP, символ гена ACP5), лизосомальный цистеинпротеазный катепсин K (CTSK) и матрикс металлопептидаза 9 (MMP9). Активированные ОС образуют зону уплотнения на поверхности кости путем образования актинового кольца с взъерошенной границей11,12. В пределах зоны уплотнения ОС опосредуют резорбцию путем секреции протонов через протонный насос V-АТФазы 12,13, MMP914 и CTSK15, что приводит к образованию лакун.
Для экспериментов in vitro предшественники OC могут быть получены путем расширения макрофагов костного мозга из бедренной и большеберцовойкостей мышей 16,17, а также путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs) из образцов крови и пышных покрытий 18,19,20 или путем дифференцировки увековеченных мышиных моноцитарных клеток RAW 264,7 21,22.
В настоящем протоколе мы описываем остеокластический резорбционный анализ в пластинах клеточных культур, покрытых CaP, с использованием OC, полученных из первичных PBMCs. Используемый здесь метод клеточных культуральных пластин с покрытием CaP принят и усовершенствован из метода, описанного ранее Patntirapong et al.17 и Maria et al.21. Для получения предшественников OC PBMC выделяют центрифугированием градиента плотности и расширяют, как описано ранее20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Зрелые остеокласты представляют собой многоядерные клетки, которые могут разлагать кости за счет секреции кислот и ферментов. Они играют решающую роль при различных заболеваниях (например, остеопорозе и раке костей) и поэтому являются важными объектами исследований. In vitro их активность может быть проанализирована путем образования резорбционных ямок. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция (CaP), которые можно легко визуализировать и количественно оценить. Предшественники остеокластов, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs), культивировали на покрытых пластинах в присутствии остеокластогенных стимулов. После 9 дней инкубации остеокласты были зафиксированы и окрашены для флуоресцентной визуализации, в то время как покрытие CaP было противопоставлено кальцеину. Для количественной оценки рассасываемой области покрытие CaP на пластинах окрашивали 5% AgNO3 и визуализировали с помощью визуализации brightfield. Площадь резорбционной ямы была количественно определена с помощью ImageJ.

Покрытие фосфатом кальция на дне пластин клеточной культуры выполняли в два этапа покрытия, включающих 3-дневную предварительную кальцификацию и 1-дневную стадию кальцификации. Как показано на фиг.1, равномерно распределенный фосфат кальция получали на дне 96-луночных п?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro at JoVE.com

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Здесь мы представляем простую и эффективную процедуру анализа резорбционных ям с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция.

Простой протокол анализа ям для визуализации и количественной оценки остеокластической резорбции in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Наш протокол описывает простой и надежный метод остеокластического резорбционного анализа. Использование пластин для культивирования клеток, покрытых фосфатом кальция, может быть легко подготовлено и визуализировано с использованием доступных в лаборатории материалов. В отличие от непрозрачных костных или дентиновых срезов, покрытие из фосфата кальция позволяет одновременно визуализировать резорбционные ямки и клетки.В этом протоколе мы используем BBMC для дифференцировки остеокластов. Тем не менее, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как моноциты, полученные из костного мозга, или сырые клетки 264,7. Сначала берут плоское дно 96 клеточной культуральной пластины и пипетку 300 микролитров предварительно приготовленного раствора фосфата кальция в каждую скважину.Затем накройте тарелку крышкой и высиживайте пластину при 37 градусах Цельсия в течение трех дней. Через три дня аспирируют раствор предварительной кальцификации из предварительно кальцинированных пластин для культивирования 96 лунок и добавляют 300 микролитров раствора фосфата кальция в каждую лунку. Накройте тарелки крышкой и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение одного дня.Затем переверните тарелку, чтобы вылить раствор и трижды тщательно промыть тарелку деионизированной водой. Немедленно высушите пластину с помощью фена или сжатого углекислого газа или газообразного азота для поддержания однородной поверхности. Теперь облучите покрытую пластину на чистой скамейке ультрафиолетовыми лучами в течение одного часа.Немедленно используйте пластину с покрытием или запечатайте пластину парапленкой и храните ее при комнатной температуре. Развести 15 миллилитров свежей крови равным объемом PBS и перемешать их путем инвертирования или пипетирования несколько раз. Затем берут 15 миллилитров раствора градиента плотности в конической трубке объемом 50 миллилитров, наклоняют трубку и аккуратно наслаивают 30 миллилитров разбавленного образца крови на 15 миллилитров раствора градиента плотности.Позже центрифугируют трубку в качающийся ротор ковша без разрыва в 810 раз G в течение 20 минут при 20 градусах Цельсия. Затем аспирируйте верхний слой, оставляя слой мононуклеарных клеток нетронутым на границе раздела. Аккуратно переложите слой мононуклеарной ячейки на новую коническую трубку объемом 50 миллилитров.Наполните трубку PBS, перемешайте и центрифугируйте в 300 раз G в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Повторно суспендировать PBMC в полном альфа-MEM, содержащем 20 нанограммов на миллилитры макрофагального колониестимулирующего фактора, и засеять 2,5 раза 10 до пятых клеток на сантиметр квадратных PBMC в колбе. Инкубируйте пластины, покрытые фосфатом кальция, 50 микролитрами фетальной бычьей сыворотки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.Затем дважды промыть колбу PBS, чтобы отделить предшественники остеокластов от мертвых или неадгезивных клеток, затем добавить четыре миллилитра трипсина на колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Через 30 минут остановите пищеварение, добавив четыре миллилитра полного альфа-MEM, затем аккуратно отсоедините клетки с помощью клеточного скребка. Переместите ячейки в 50-миллилитровую трубку и подсчитайте общее количество ячеек с помощью счетной камеры.Центрифугируйте трубку в 350 раз G в течение семи минут, чтобы гранулировать клетки и повторно отраспределить гранулу и полный альфа-MEM, содержащий M-CSF и RANKL, чтобы получить от одного раза 10 до шести ячеек на миллилитр. Аспирируйте фетальную бычью сыворотку из пластины, покрытой фосфатом кальция, и пипетку 200 микролитров клеточной суспензии на лунку. После инкубации дважды промыть клетки PBS.Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в течение 10 минут и снова промыть PBS. Для окрашивания добавьте буфер пермеабилизации к неподвижным клеткам и инкубируйте их в течение пяти минут. Чтобы окрасить актиновые нити, инкубируют клетки 100 микролитрами меченого раствора фаллоидина Alexa Fluor 546 в PBS в течение 30 минут, затем аспирируют окрашивающий раствор и окрашивают ядра, используя 100 микролитров Hoechst в течение 10 минут.Окрашивайте покрытие фосфатом кальция 100 микролитрами 10 микромолярного кальция и PBS в течение 10 минут. После трехкратного мытья PBS, делайте снимки. Для окрашивания покрытия фосфатом кальция фон Косса добавляют в каждую скважину 50 микролитров 5% нитрата серебра и деионизированной воды и инкубируют пластину под ультрафиолетовым излучением в течение одного часа, пока покрытие на дне скважин не станет коричневым.Покрытие фосфата кальция на дне 96 плит скважин оказалось однородным и хорошо приклеенным. После девяти дней культивирования в M-CSF и RANKL на пластинах, покрытых фосфатом кальция, предшественники остеокластов образовали ямки резорбции и крупные остеокласты. Многоядерные остеокласты, расположенные в ямах, экспрессировали высокие уровни TRAP.Зрелые остеокласты показали наличие трех или более ядер и отчетливого актинового кольца. Зеленое покрытие из фосфата кальция показало наличие черных ямок резорбции. Количество и размер остеокластов рассчитывались с помощью менеджера ROI и инструмента выбора полигонов изображения J.Предшественники J.Osteoclasts, выращенные в отсутствие RANKL, не могли образовывать резорбционные ямы, однако M-CSF и RANKL способствовали образованию остеокластогенных ямок.А площадь карьера была количественно определена с помощью изображения J.Немедленное высыхание покрытой пластины воздушным потоком помогает сделать равномерное покрытие из фосфата кальция. В противном случае он склонен к образованию более толстого покрытия в середине скважины.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Роговицы конфокальной микроскопии: Роман неинвазивной техники количественно Малый Fibre патологии периферической нервной системы

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Точные и простые измерения провоспалительных цитокинов IL-1β использованием Всего Пробирная стимуляция крови

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

В пробирке мезотелиальной Анализ просвет, что модели ранних стадиях рака яичников Метастазы

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Простой метод мышь интубации легких

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Чувствительным методом для количественной стареющие клетки рака

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Парабиозе у мышей: подробный протокол

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Клеточная Протокол анализа для прогностического Прогнозирование идиопатический сколиоз с помощью сотового диэлектрической спектроскопии

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Простое устройство быстро подготовить тотальных мыши кишечника

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Высокая пропускная способность, Multiplexed и Targeted Протеомный CSF Анализ на Количественно нейродегенеративных биомаркеров и аполипопротеина Е изоформы Статус

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...