Name: a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00
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Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo de Becas de China [CSC No. 201808440394]. W.C. fue financiado por CSC.

El protocolo fue revisado y aprobado por el comité de ética local (número de aprobación 287/2020B02).
1. Preparación de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio
<ol><li>Preparación de solución madre de calcio (25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O en tampón Tris)<ol>
<li>Prepare el tampón Tris de 1.0 M y ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl.</li>
		<li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio e...

<ol>
	<li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin,+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts.">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li><li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption.">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li><li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis.">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li><li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection.">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li><li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma:+proposal+for+a+novel+prognostic+index.">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li><li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis.">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li><li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopetrosis:+genetics,+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function.">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li><li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks.">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8 (2018).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption:+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border.">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li><li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump.">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases.">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).</li><li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization.">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li><li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB.">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li><li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation.">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li><li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14++monocytes+isolated+from+peripheral+blood.">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB/MAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis.">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578 (2021).</li><li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood.">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li><li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity:+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay.">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li><li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study:+Phenotype+and+stimuli.">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice.">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis.">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors.">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li></ol>

Aquí describimos un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica utilizando AO derivados y expandidos in vitro de PBMC. Las placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizadas se pueden preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. Además de los PBMC no clasificados adoptados en este protocolo, los AO generados a partir de células monocíticas murinas21 y células macrófagos de médula ósea17</...

This corrects the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Los osteoclastos (AO) son macrófagos específicos del tejido derivados de células madre hematopoyéticas (HSC), que desempeñan un papel fundamental en la remodelación ósea junto con los osteoblastos1. Los trastornos óseos inducidos por hormonas sexuales, inmunológicos y malignos que destruyen el hueso sistémica o localmente se deben al exceso de actividad osteoclástica, incluida la osteoporosis relacionada con la menopausia2, la artritis reumatoide3, la enfermedad periodontal4, la enfermedad ósea mieloma5 y la metástasis ósea osteolítica6. Por el contrario, los defectos en la formación y función de LA OC también pueden causar osteopetrosis7. Las HSC se diferencian en progenitores de OC bajo la estimulación del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). En presencia tanto de M-CSF como del activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL, símbolo del gen TNFSF11), los progenitores de OC se diferencian aún más en AO mononucleares y posteriormente se fusionan para convertirse en AO multinucleados 8,9,10. Ambas citoquinas M-CSF y RANKL son indispensables y suficientes para la inducción de marcadores osteoclásticos como el receptor de calcitonina (CT), el activador del receptor del factor nuclear κ B (RANK), la bomba de protones V-ATPasa, la subunidad alfa del canal de cloruro 7 (CIC-7), la integrina β3, la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, símbolo de gen ACP5), la cisteína lisosomal proteasa catepsina K (CTSK) y la metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9). Los AO activados forman una zona de sellado en la superficie ósea a través de la formación de un anillo de actina con un borde erizado11,12. Dentro de la zona de sellado, los AO median la reabsorción a través de la secreción de protones a través de la bomba de protones V-ATPasa 12,13, MMP914 y CTSK15, lo que lleva a la formación de lagunas.
Para experimentos in vitro, los progenitores de OC se pueden obtener mediante la expansión de macrófagos de médula ósea del fémur y la tibia de ratones 16,17, así como mediante el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de muestras de sangre y capas buffy 18,19,20, o por diferenciación de las células monocíticas murinas inmortalizadas RAW 264.7 21,22.
En el presente protocolo, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica en placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizando AO derivados de PBMC primarios. El método de placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizado aquí se adopta y refina a partir del método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 y Maria et al.21. Para obtener precursores de OC, los PBMC se aíslan por centrifugación por gradiente de densidad y se expanden como se describió anteriormente20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>35110</td>
			<td>Silver nitrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32561-029</td>
			<td>MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin B</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>03-028-1B</td>
			<td>Amphotericin B Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21097-50G</td>
			<td>Calcium chloride Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td>Calcein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td>Paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td>Hydrochloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>PK-CA707-40046</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2943,0250</td>
			<td>di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merk</td>
			<td>K15322429</td>
			<td>Bicarbonate of Soda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Recombinant cell-dissociation enzymes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple pit assay protocol to visualize and quantify osteoclastic resorption in vitro

Los osteoclastos maduros son células multinucleadas que pueden degradar el hueso a través de la secreción de ácidos y enzimas. Desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades (por ejemplo, osteoporosis y cáncer de hueso) y, por lo tanto, son importantes objetos de investigación. In vitro, su actividad puede ser analizada por la formación de pozos de reabsorción. En este protocolo, describimos un método simple de ensayo de fosa utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio (CaP), que se pueden visualizar y cuantificar fácilmente. Los precursores de osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron en las placas recubiertas en presencia de estímulos osteoclastogénicos. Después de 9 días de incubación, los osteoclastos se fijaron y teñeron para obtener imágenes de fluorescencia, mientras que el recubrimiento de CaP se contrateñió con calceína. Para cuantificar el área reabsorbida, el recubrimiento de CaP en las placas se tiñó con 5% de AgNO3 y se visualizó mediante imágenes de campo brillante. El área del pozo de reabsorción se cuantificó utilizando ImageJ.

El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de cultivo celular se realizó en dos pasos de recubrimiento que comprenden una precalcificación de 3 días y una etapa de calcificación de 1 día. Como se muestra en la Figura 1, se obtuvo fosfato de calcio distribuido uniformemente en la parte inferior de las placas de 96 pocillos. El recubrimiento se adhirió muy bien al fondo después de los pasos de lavado realizados.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep...

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A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.

Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Nuestro protocolo describe un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica. El uso de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio se puede preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. A diferencia de las rodajas opacas de hueso o dentina, el recubrimiento de fosfato de calcio permite la visualización de las fosas de reabsorción y las células al mismo tiempo.En este protocolo, utilizamos PBMC para la diferenciación de osteoclastos. Sin embargo, también se puede aplicar a otros tipos de células como los monocitos derivados de la médula ósea o las células Raw 264.7. Primero tome una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos y pipetee 300 microlitros de solución de fosfato de calcio previamente preparada en cada pozo.Luego, cubra el plato con la tapa e incube el plato a 37 grados centígrados durante tres días. Después de tres días, aspire la solución de precalcificación de las placas de cultivo celular de 96 pocillos precalcificadas y agregue 300 microlitros de solución de fosfato de calcio a cada pocillo. Cubra las placas con una tapa e incube a 37 grados centígrados durante un día.Luego invierta la placa para verter la solución y lave bien la placa tres veces con agua desionizada. Seque inmediatamente la placa con un secador de pelo o dióxido de carbono comprimido o gas nitrógeno para mantener una superficie uniforme. Ahora, irradia la placa recubierta en un banco limpio con rayos ultravioleta durante una hora.Use la placa recubierta inmediatamente o selle la placa con Parafilm y guárdela a temperatura ambiente. Diluya 15 mililitros de sangre fresca con un volumen igual de PBS y mézclelos invirtiendo o pipeteando varias veces. Luego tome 15 mililitros de solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mililitros, incline el tubo y coloque cuidadosamente 30 mililitros de muestra de sangre diluida en los 15 mililitros de solución de gradiente de densidad.Más tarde, centrifugue el tubo en un rotor de cucharón oscilante sin romperse a 810 veces G durante 20 minutos a 20 grados centígrados. Luego aspire la capa superior dejando la capa de células mononucleares sin perturbar en la interfaz. Transfiera cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Llene el tubo con PBS, mezcle y centrífique a 300 veces G durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Vuelva a suspender PBMC en un alfa-MEM completo que contenga 20 nanogramos por mililitros de factor estimulante de colonias de macrófagos, y siembre de 2,5 veces 10 a la quinta célula por centímetro cuadrado de PBMC en un matraz. Incubar las placas recubiertas de fosfato de calcio con 50 microlitros de suero fetal bovino a 37 grados centígrados durante una hora.A continuación, lave el matraz dos veces con PBS para separar los precursores de osteoclastos de las células muertas o no adherentes, luego agregue cuatro mililitros de tripsina por matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 30 minutos, detenga la digestión agregando cuatro mililitros de alfa-MEM completo, luego separe cuidadosamente las células con un raspador celular. Transfiera las células a un tubo de 50 mililitros y cuente el número total de células utilizando una cámara de conteo.Centrifugar el tubo a 350 veces G durante siete minutos para granular las células y volver a gastar el gránulo y completar alfa MEM que contiene M-CSF y RANKL para obtener una vez 10 a las seis células por mililitro. Aspirar el suero fetal bovino a partir de la placa recubierta de fosfato de calcio, y pipetear 200 microlitros de suspensión celular por pozo. Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS.Fije las células con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos y lave de nuevo con PBS. Para la tinción, agregue un tampón de permeabilización a las células fijas e incube durante cinco minutos. Para teñir los filamentos de actina, incube las células con 100 microlitros de solución de faloidina marcada con Alexa Fluor 546 en PBS durante 30 minutos, luego aspire la solución de tinción y manche los núcleos usando 100 microlitros de Hoechst durante 10 minutos.Tiñe el recubrimiento de fosfato de calcio con 100 microlitros de 10 calceína micromolar y PBS durante 10 minutos. Después de lavar tres veces con PBS, capture imágenes. Para la tinción Von Kossa del recubrimiento de fosfato de calcio, agregue 50 microlitros de nitrato de plata al 5% y agua desionizada a cada pozo, e incube la placa bajo radiación ultravioleta durante una hora hasta que el recubrimiento en el fondo de los pozos se haya vuelto marrón.El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de 96 pozos parecía ser uniforme y bien adherido. Después de nueve días de cultivo en M-CSF y RANKL en las placas recubiertas de fosfato de calcio, los precursores de osteoclastos formaron fosas de reabsorción y osteoclastos grandes. Los osteoclastos multinucleados ubicados en los pozos expresaron altos niveles de TRAP.Los osteoclastos maduros mostraron la presencia de tres o más núcleos y el anillo de actina distinto. El recubrimiento de fosfato de calcio verde mostró la presencia de fosas de reabsorción negras. Las imágenes de fluorescencia del área del pozo se midieron utilizando la herramienta de umbral de la imagen J.El número y el tamaño de los osteoclastos se calcularon utilizando el gestor de ROI y la herramienta de selección de polígonos de la imagen J.Los precursores de los osteoclastos cultivados en ausencia de RANKL no pudieron formar pozos de reabsorción, sin embargo, M-CSF y RANKL facilitaron la formación de hoyos osteoclastogénicos.Y el área del pozo se cuantificó utilizando la imagen J.El secado inmediato de la placa recubierta con flujo de aire ayuda a hacer un recubrimiento uniforme de fosfato de calcio. De lo contrario, es propenso a formar una capa más gruesa en el medio del pozo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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