Name: cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells
Uploaded: 2022-06-02T14:40:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

نشكر الباحثين التاليين في جامعة أوميا على مساعدتهم في خطوط الخلايا السرطانية ذات الصلة والأجسام المضادة: L. Carlsson (الجسم المضاد لعامل فون ويلبراند) ، J. Gilthorpe (U251) ، و M. Landström (PC-3U). كما نشكر Hauke Holthusen في مختبر Gilthorpe على توليد خط الخلايا المستقرة HEK293-TLR-AAVS1. تم دعم العمل في مختبر Gunhaga من قبل مؤسسة السرطان السويدية (18 0463) ، وحاضنة Umeå Biotech ، و Norrlands Cancerforskningsfond ، ومجلس البحوث السويدي (2017-01430) ، وكلية الطب في جامعة أوميا.

<ol>
	<li>Vasantharajan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+landscape+of+circulating+tumour+cells.">The epigenetic landscape of circulating tumour cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li><li>Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+matrix+metalloproteinases:+their+functions+and+regulations.">Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations.</a> Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).</li><li>Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM+and+ADAMTS+family+proteins+and+their+role+in+the+colorectal+cancer+etiopathogenesis.">ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis.</a> BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).</li><li>Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+alternative+model+for+cancer+studies.">Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies.</a> Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).</li><li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+spread+and+micrometastasis+development:+quantitative+approaches+for+in+vivo+models.">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAM-Delam:+an+in+vivo+approach+to+visualize+and+quantify+the+delamination+and+invasion+capacity+of+human+cancer+cells.">CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).</li><li>Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+von+Willebrand+factor.">Zebrafish von Willebrand factor.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).</li><li>Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+egg+chorioallantoic+membrane+(CAM)+model+as+an+in+vivo+method+for+the+investigation+of+the+invasion+and+metastasis+cascade+of+malignant+tumor+cells.">The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+endostatin+endostar+inhibits+tumor+growth+and+metastasis+in+a+mouse+xenograft+model+of+colon+cancer.">Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer.</a> Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+inhibition+of+presenilin+2+inhibits+glioma+cell+growth+and+invasion+and+is+involved+in+the+regulation+of+Nrg1/ErbB+signaling.">RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling.</a> Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).</li><li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+superfamily+15+promotes+lymphatic+metastasis+via+upregulation+of+vascular+endothelial+growth+factor-C+in+a+mouse+model+of+lung+cancer.">Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer.</a> Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells.">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li><li>Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCzeta+facilitates+lymphatic+metastatic+spread+of+prostate+cancer+cells+in+a+mice+xenograft+model.">PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model.</a> Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Jung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenograft+models+for+preclinical+assessment+of+anticancer+drug+development.">Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development.</a> Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+EZH2+mediates+tumor+progression+on+the+chick+chorioallantoic+membrane+assay,+a+novel+model+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li><li>Steinmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPK1+loss+triggers+tumor+invasion+in+colorectal+tumor+cells.">DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (12), 895 (2019).</li><li>Andrieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP14+is+required+for+delamination+of+chick+neural+crest+cells+independently+of+its+catalytic+activity.">MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity.</a> Development. 147 (7), (2020).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+apoptosis+during+the+formation+of+the+terminal+nerve+ganglion+by+olfactory+placode-derived+cells+with+distinct+molecular+markers.">Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers.</a> Differentiation. 110, 8-16 (2019).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Pineros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+TNM:+a+registry+tool+to+reduce+gaps+in+cancer+staging+information.">Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information.</a> The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).</li><li>Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+response+in+organoids+generated+from+frozen+primary+tumor+tissues.">Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues.</a> Scientific Reports. 6, 18889 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

تصف هذه الورقة فحص CAM-Delam لتقييم العدوانية النقيلية للخلايا السرطانية ، والتي يتم تحديدها من خلال تسجيل تعديلات الصفيحة القاعدية وغزو الخلايا المحتمل في اللحمة المتوسطة في غضون ساعات إلى بضعة أيام. كانت المشكلة التقنية السابقة لمختلف فحوصات الطب التكميلي والبديل هي انخفاض بقاء أجنة الكتاكيت. تم حل هذه المشكلة عن طريق إدخال استخدام غرفة ترطيب داخلية أثناء حضانة الجنين ، مما زاد من بقاء الجنين من 10٪ -50٪ إلى 80٪ -90٪ 7. لذلك ، قد يكون استخدام غرفة رطبة داخلية ذا قيمة في اختبارات CAM بشكل عام ، وكذلك في تجارب الفرخ السابقة الأخرى.
تستند نقاط وقت التسجيل المقدمة عند 14 ساعة و 1.5 يوم و 2.5 يوم و 3.5 أيام بعد بذر 1 × 106 خلايا سرطانية على CAM إلى تطوير طريقة صارمة باستخدام ستة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية وهي كافية لتمييز النطاق من قدرات خطوط الخلايا السرطانية غير المخففة إلى التصويب مع الغزو. يقترح استخدام أربع بيضات كحد أدنى مع ثلاث حلقات في كل نقطة زمنية ولكل خط خلية ، ويجب تكرار ذلك مرة واحدة على الأقل أو وفقا للتصاميم التجريبية والمتطلبات الإحصائية. تتمثل إحدى مزايا فحص CAM-Delam في الحصول على نتائج غنية بالمعلومات فيما يتعلق بقدرة الخلايا السرطانية على التفكيك في غضون أيام قليلة لتقدير عدوانية الخلايا السرطانية والمخاطر المحتملة لتشكيل ورم خبيث. يتم تسهيل التسليم السريع للنتائج من خلال مراقبة تدهور الصفيحة القاعدية بسبب الخلايا السرطانية الغازية والأورام الدقيقة اللاحقة / براعم الورم والنقائل العضوية. تقليديا ، تم استخدام نماذج CAM لتحليل تشكيل النقائل العضوية ، والتي تستغرق حوالي 2 أسابيع ليتم تحديدها9. باستخدام سبعة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية ، قمنا سابقا بالتحقق من7 أن درجة التفكيك مرتبطة بقدرة الخلايا السرطانية على تكوين النقائل في نماذج القوارض10،11،12،13،14 ، والتي تدعم القيمة التنبؤية لفحص CAM-Delam. علاوة على ذلك ، تتطلب نماذج الفئران وقتا أطول ، من عدة أسابيع إلى أشهر ، قبل أن يمكن فحص النقائل15,16. باختصار ، فإن هذا الفحص المطور CAM-Delam ، الذي يركز على تسجيل قدرة التفكيك وليس على فحص تكوين الورم لاحقا في جنين الفرخ ، هو ، بالتالي ، مكمل جيد لغزو CAM الدجاج الحالي ونماذج ورم الفئران.
قد يكون أحد القيود في فحص CAM-Delam هو التصور غير الواضح للصفيحة القاعدية إذا كانت الخلايا السرطانية نفسها تعبر عن اللامينين. إذا كان الأمر كذلك ، يمكن استخدام علامات أخرى تشير إلى الصفيحة القاعدية ، مثل E-cadherin ،7. استخدمت دراسات غزو CAM الأخرى الكولاجين من النوع الرابع لتصور CAM و pan-cytokeratin و vimentin لتحديد الخلايا السرطانية الغازية وتشكيل الأورام الدقيقة / براعم الورم17,18.
التفكيك هو عملية خلوية طبيعية ، سواء أثناء التطور أو في وقت لاحق من الحياة ، مما يجعل من الممكن للخلايا مغادرة ظهارة والهجرة إلى أنسجة أخرى. أمثلة على الخلايا اللامعة أثناء التطور هي القمة العصبية والخلايا العصبية الرائدة الشمية19,20; في وقت لاحق من الحياة ، يعتمد التئام الجروح على التفكيك21. أثناء السرطان ، يتم تنظيم هذه العملية في الخلايا الخاطئة و / أو في الوقت الخطأ. وبالتالي ، يمكن أن تكون طريقة CAM-Delam مفيدة لكشف الآليات الجزيئية التي تنظم التفكيك ، والتي ستكون ذات أهمية لكل من المعرفة البيولوجية والمرضية الأساسية. وتشمل دراسات التفكيك هذه إضافة عوامل ذات أهمية للخلايا السرطانية المزروعة في الطب التكميلي والبديل أو دراسة الخلايا السرطانية المعدلة وراثيا. أحد الأمثلة المعروضة هنا هو المعالجة المسبقة ل CoCl2 لخط الخلايا غير النقيلي U251 للحث على نقص الأكسجة ، مما يؤدي إلى تحريض قدرة عدوانية نقلية يمكن قمعها بواسطة مثبط MMP واسع الطيف. وبالتالي ، فإن العثور على جزيئات رئيسية تتحكم في التفكيك يزيد من إمكانية تصميم مثبطات لقمع هذه العملية. فيما يتعلق بذلك ، هناك استخدام محتمل آخر لبروتوكول CAM-Delam في فحص الأدوية لقمع التفكيك وغزو الخلايا. علاوة على ذلك ، في العيادة ، يعد تقييم شدة السرطان عنصرا حاسما في التشخيص والتخطيط للعلاج والرعاية. حاليا ، نظام التدريج TNM (T ، حجم الورم; N ، العقدة - ما إذا كان السرطان قد انتشر إلى الغدد الليمفاوية ؛ M ، ورم خبيث بعيد) يستخدم لتقييم شدة السرطان22. يحدد فحص CAM-Delam نهجا مبتكرا لتقييم عدوانية الخلايا السرطانية والمخاطر المحتملة لتشكيل النقائل وقد يكون مكملا مفيدا لنظام التدريج TNM. ومن الجدير بالذكر أن تدريج TNM يعتمد على تحليلات عينات الأنسجة الثابتة ، في حين أن نهج CAM-Delam السريري المحتمل من شأنه أن يفحص الأنسجة الطازجة أو المجمدة الطازجة بالاقتران مع تقنيات إحياء الخلايا المجمدة23.

ما يقرب من 90 ٪ من الوفيات في مرضى السرطان ناتجة عن عواقب ورم خبيث للسرطان ، وهو تكوين أورام ثانوية في أجزاء أخرى من الجسم من حيث نشأ السرطان في الأصل1. لذلك ، من المهم تحديد الآليات المتعلقة بالنقائل للعثور على أهداف محتملة لقمع تكوين النقائل السرطانية. في وقت لاحق ، هناك حاجة إلى أنظمة نموذجية يمكن من خلالها تقييم العملية النقيلية. 
أثناء الانبثاث ، تخضع الخلايا السرطانية للانتقال الظهاري إلى الوسيط (EMT) ، وهي عملية خلوية طبيعية تفقد فيها الخلايا الظهارية خصائص الالتصاق والقطبية وبدلا من ذلك تكتسب طابعا وسيطا غازيا2. التفكيك هو جزء من عملية EMT وينطوي على تدهور اللامينين في الغشاء السفلي ، وهو شرط أساسي للخلايا السرطانية لمغادرة الورم الأساسي وغزو الأنسجة الأخرى. تشمل العوامل الرئيسية التي يتم تنظيمها أثناء تكوين ورم خبيث مصفوفة ميتالوبروتيناز (MMPs) ، و ADAM (ثنائي intergin و metalloproteinase) ، و ADAMTS (ADAM مع زخارف ثرومبوسبوندين) ، و MMPs من نوع الغشاء (MT-MMPs) 3,4. هذه العوامل تتحلل جزيئات مثل اللامينين ، والتي يتم التعبير عنها في جميع الأغشية السفلية ، لتسهيل هجرة الخلايا والغزو.
الغشاء المشيمي (CAM) لبيضة الفرخ المخصبة هو نوع من الغشاء السفلي. تم استخدام بيض الفرخ المخصب كنماذج نقيلية ، حيث تم زرع الخلايا السرطانية على CAM خارج الجنين وتشكيل ورم خبيث لاحق لوحظ في أجنة الفرخ5. علاوة على ذلك ، كثيرا ما تستخدم النماذج النقيلية للفئران في الجسم الحي ، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية في الفئران ويتم تحليل النقائل في مختلف الأعضاء6. هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومكلفا وقد يسبب إزعاجا للحيوانات. لمعالجة هذا ، قمنا بتطوير فحص CAM-Delam ، وهو نموذج أسرع وأرخص لتقييم العدوانية النقيلية للخلايا السرطانية. في هذا النموذج ، يتم الجمع بين قدرة الخلايا السرطانية على تحلل CAM الفرخ (على سبيل المثال ، قدرة التفكيك) مع غزو الخلايا السرطانية المحتمل في اللحمة المتوسطة وتستخدم كمقياس للعدوانية النقيلية. 
تصف هذه المقالة ، استنادا إلى منشور سابق7 ، فحص CAM-Delam بالتفصيل ، من التعامل مع بيض الفرخ المخصب ، وزراعة الخلايا السرطانية والبذر ، والتشريح ، وتحليل عينات CAM ، إلى تسجيل قدرة التفكيك للخلايا السرطانية إلى أربع فئات: سليمة ، معدلة ، تالفة ، وغزو. كما نعطي أمثلة على كيفية استخدام هذا الفحص لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم عملية التفكيك.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>HM 505 E, Microm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon DS-Ri1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica M10</td>
			<td></td>
			<td>For CAM-sample dissection and positioning in molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td>Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse, E800</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8600 Series</td>
			<td>Model 817CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (small)</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Laminin-111</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Primary anti-rabbit antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Secondary antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0226</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Cobalt(II) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>232696-5G</td>
			<td>CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs</td>
			<td>Str&#246;mb&#228;cks &#196;gg, V&#228;nn&#228;s, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Any local egg supplyer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence mounting medium</td>
			<td>Allent Technologie</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass chambers for silicon rings</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001 MMP Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides for immunohistochemistry</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEG-50 frozen medium</td>
			<td>Cellab</td>
			<td>6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Peel-A-Way Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>15 cm in diameter for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td>Esclain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen</td>
			<td>Cellsystems</td>
			<td>5074-35ML</td>
			<td>5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rings</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>228-1580</td>
			<td>Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologi</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing boats</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>611-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTIONS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-RPMI media mixture (1 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compelete RPMI Media 
			750 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen 
			250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Mix and use immediately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI Media 
			445 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>FBS 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin 
			5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PB (0.2 M; 1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4 (MW 141.76) 
			21.9 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>NaH2PO4 (MW 137.99) 
			6.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add deionized water up to final volume of 1000ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store in RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Deionized water 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 M PB 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) 
			4g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>heat to 60 &#176;C in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add 5 M NaOH 
			25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Stir to dissolve the PFA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST (1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50mM Tris pH 7,4 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>150mM NaCI 
			30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0,1% Triton X-100 
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>H2O (MQ) 
			900 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %; 10 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS 
			9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10x Trypsin (0.5 %) 
			1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10 mL in total, Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells

السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان هو تكوين ورم خبيث (أي عندما تنتشر الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى الأعضاء البعيدة وتشكل أوراما ثانوية). التفكيك ، الذي يعرف بأنه تدهور الصفيحة القاعدية والغشاء السفلي ، هو العملية الأولية التي تسهل انتقال الخلايا السرطانية وانتشارها إلى الأنسجة والأعضاء الأخرى. إن تسجيل قدرة الخلايا السرطانية على التفكيك يشير إلى الإمكانات النقيلية لهذه الخلايا.
لقد طورنا طريقة موحدة ، وهي فحص CAM-Delam السابق ، لتصور وتحديد قدرة الخلايا السرطانية على التطهير والغزو ، وبالتالي القدرة على تقييم العدوانية النقيلية. باختصار ، تتضمن طريقة CAM-Delam بذر الخلايا السرطانية في حلقات السيليكون على الغشاء المشيمي (CAM) في اليوم الجنيني 10 ، تليها الحضانة من ساعات إلى بضعة أيام. يتضمن فحص CAM-Delam استخدام غرفة رطبة داخلية أثناء حضانة جنين الفرخ. أدى هذا النهج الجديد إلى زيادة بقاء الجنين من 10٪ -50٪ إلى 80٪ -90٪ ، مما أدى إلى حل المشكلات التقنية السابقة مع انخفاض معدلات بقاء الجنين في اختبارات CAM المختلفة.
بعد ذلك ، تم عزل عينات CAM مع مجموعات الخلايا السرطانية المرتبطة بها وإصلاحها وتجميدها. وأخيرا، تم تصور العينات المجزأة بالتبريد وتحليلها بحثا عن تلف الغشاء السفلي وغزو الخلايا السرطانية باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية. من خلال تقييم مختلف خطوط الخلايا السرطانية النقيلية وغير النقيلية المعروفة المصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، أظهرت النتائج الكمية ل CAM-Delam أن أنماط قدرة التفكيك تعكس العدوانية النقيلية ويمكن تسجيلها في أربع فئات. الاستخدام المستقبلي لهذا الفحص ، بصرف النظر عن تحديد قدرة التفكيك كميا كمؤشر على العدوانية النقيلية ، هو الكشف عن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التفكيك ، والغزو ، وتشكيل النقائل الدقيقة ، والتغيرات في البيئة الدقيقة للورم.

يعرض الشكل 1 الخطوات الرئيسية في فحص CAM-Delam7. أدى استخدام الغرف الرطبة الداخلية (الشكل 1C) إلى تحسين معدل بقاء أجنة الفرخ بشكل كبير من <50٪ إلى 90٪ في يوم الحضانة 10 ومن ~ 15٪ إلى 80٪ في يوم الحضانة 13 (الشكل 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig1v2.jpg"> الشكل 1: الخطوات الرئيسية لفحص CAM-Delam . (أ) احتضان بيض الدجاج المخصب أفقيا دون دوران. (ب، ج) في اليوم 3 من الحضانة ، قم بتكسير البيض ووضعه في قوارب وزن معقمة (B) ، ووضع القوارب في غرفة رطبة داخلية لمزيد من الحضانة (C). (د) تحضير حلقات السيليكون. (ه) في اليوم 10 من الحضانة ، ضع حلقات السيليكون على CAM ، وزرع 1 × 106 خلايا سرطانية داخل الحلقات باستخدام ماصة. (F,G) في نقاط زمنية مختلفة (ساعات إلى أيام) ، تشريح CAM مع الخلايا السرطانية المرفقة ، (F) إصلاح في PFA ، وعلاج مع السكروز ، ووضعها في وسط القسم المجمد ، (G) وتجميدها في -80 درجة مئوية (H) مثال على CAM مقسم مع الخلايا السرطانية GFP + المرتبطة (الأخضر) و laminin تلطيخ الكيمياء المناعية (الأحمر). قضبان المقياس = 2 مم (E ، F) ، 1 مم (G) ، و 100 ميكرومتر (H). وهذا الرقم مأخوذ من Palaniappan et al.7. الاختصارات: CAM = غشاء chorioallantoic ؛ PFA = بارافورمالديهايد; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig2v2.jpg"> الشكل 2: بقاء جنين الدجاج على قيد الحياة فيما يتعلق بطريقة الحضانة. (A,B) في يوم الحضانة 10، تضاعف بقاء جنين الدجاج في HCs الداخلية (متوسط القيمة 89.33; N = 105) مقارنة بالحضانة في أطباق بتري (A؛ القيمة المتوسطة 40; N = 64) والغرف غير الرطبة (B؛ القيمة المتوسطة 48.67; N = 46). (ج، د) وفي يوم الحضانة 13، لوحظ ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة باستخدام HC (متوسط القيمة 81.67; N = 105)، في حين لوحظ انخفاض كبير في بقاء الجنين باستخدام PD (C؛ القيمة المتوسطة 11.33; N = 64)، وN-HC (D؛ القيمة المتوسطة 18.33; N = 46). تم اختبار الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذيل غير مقترن. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. * ص < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، *** ع < 0.001. وقد عدل هذا الرقم من Palaniappan et al.7. الاختصارات: HC = غرفة رطبة. PD = أطباق بتري. N-HC = غرفة غير رطبة ؛ E X = يوم الحضانة X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم الإبلاغ سابقا عن تحليلات خطوط الخلايا السرطانية المختلفة التي تعبر عن GFP (الورم الأرومي الدبقي U251 ، البروستاتا PC-3U ، القولون SW620 ، والرئة A549) باستخدام هذا البروتوكول من قبل Palaniappan et al.7. تشمل نتائج فحص CAM-Delam اختلافات في مورفولوجيا الصفيحة القاعدية ، التي اكتشفها اللامينين ، وغزو الخلايا السرطانية ، التي تعرف بأنها الخلايا التي عبرت طبقة الصفيحة القاعدية للكتكوت إلى طبقة الجلد المتوسط للكتكوت (الشكل 3). تظهر هذه النتائج أن قدرة الخلايا السرطانية على تحلل الصفيحة القاعدية وغزو اللحمة المتوسطة يمكن تسجيلها في واحدة من أربع فئات: 1) الصفيحة القاعدية السليمة دون تغيرات مرئية (الشكل 3B) ، 2) الصفيحة القاعدية المعدلة ولكن غير التالفة (الشكل 3C) ، 3) الصفيحة القاعدية التالفة دون غزو الخلايا (الشكل 3D) ، و 4) الصفيحة القاعدية التالفة مع غزو الخلايا (الشكل 3E) ). كانت الملاحظة الأخرى هي أنه عندما تسببت الخلايا السرطانية في صفيحة قاعدية متغيرة أو تالفة ، كان CAM سميكا أيضا مع زيادة تكوين الأوعية الدموية ، والتي تم تعريفها بواسطة تلطيخ الأجسام المضادة ضد عامل فون ويلبراند ، والذي يتم تصنيعه في الأوعية الدموية8 (الشكل 4C-H). لم يلاحظ هذان النمطان الظاهريان ، وهما CAM سميك وزيادة تكوين الأوعية الدموية ، عندما كان CAM سليما (الشكل 4A ، B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig03.jpg"> الشكل 3: تسجيل CAM-Delam. (A-E) مثال على تسجيل CAM-Delam استنادا إلى سلامة الصفيحة القاعدية CAM ، التي تصورها مضادات اللامينين (الحمراء) ، والغزو المحتمل للخلايا السرطانية المعبرة عن GFP (الأخضر). (أ) السيطرة على الطب التكميلي والبديل بدون خلايا سرطانية. (ب-هاء) في الاستجابات للخلايا السرطانية ، يمكن تسجيل أربع فئات تصف مورفولوجيا الصفيحة القاعدية: (B) laminin سليم ، (C) laminin متغير ولكن غير تالف (يشار إليه بعلامة نجمية) ، (D) laminin التالف ولكن بدون غزو الخلايا السرطانية (الأسهم) ، laminin التالف مع غزو الخلايا (رؤوس السهام). شريط المقياس = 100 ميكرومتر (A-E). وهذا الرقم مأخوذ من Palaniappan et al.7. الاختصارات: CAM = غشاء chorioallantoic ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig04.jpg"> الشكل 4: تقييم سماكة الطب التكميلي والبديل وتكوين الأوعية الدموية. (أ-ح) مثال على تصور سماكة CAM وتكوين الأوعية الدموية ، التي تم اكتشافها بواسطة عامل مضاد لفون ويلبراند (أحمر) ، استجابة لصفيحة أنواع الخلايا السرطانية المختلفة. (أ، ب) السيطرة على الطب التكميلي والبديل بدون خلايا سرطانية. (ج، د) استجابة لخط الخلايا السرطانية غير النقيلي (سجل على أنه سليم) ، لم يتم الكشف عن سماكة واضحة للحمة المتوسطة أو زيادة تكوين الأوعية الدموية. (ه-ح) استجابة للخلايا السرطانية النقيلية التي تؤدي إلى تغيير أو تلف Laminin ، تم تكثيف اللحمة المتوسطة (المشار إليها برؤوس الأسهم المزدوجة) ولوحظ زيادة تكوين الأوعية الدموية (المشار إليها بالأسهم). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من Palaniappan et al.7. الاختصارات: CAM = غشاء chorioallantoic ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الورم الأرومي الدبقي U251 وخلايا سرطان البروستاتا PC-3U هما مثالان على خطوط الخلايا السرطانية ذات قدرات إزالة مختلفة تماما (الشكل 5). استحدثت خلايا PC-3U اللامينين التالف بعد 1.5 يوم ، مع غزو واضح بعد 2.5 يوم (الشكل 5A). وعلى النقيض من ذلك، فإن خلايا U251 لم تتسبب إلا في حدوث تغييرات طفيفة في اللامينين بعد 1.5-3.5 أيام ولكنها لم تسبب أبدا أي ضرر مرئي للأمينين (الشكل 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig05.jpg"> الشكل 5: تصور قدرة التفكيك للخلايا السرطانية للبروستاتا (PC-3U) والورم الأرومي الدبقي (U251). (A) تسببت خلايا PC-3U في تغيير طفيف في اللامينين بعد 14 ساعة ، وتلف اللامينين بعد 1.5 يوم (السهم) ، وبدء الغزو بعد 2.5 يوم ، والذي زاد بعد 3.5 أيام (رؤوس السهام). (ب) تسببت خلايا U251 في تغيير طفيف في اللامينين بعد 1.5-3.5 يوم. تعرض اللوحات اليمنى رسوما بيانية تمثل تسجيل CAM-Delam. يشير المحور y إلى عدد العينات ، ويشير المحور x إلى النقاط الزمنية للثقافة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (A,B). وقد عدل هذا الرقم من Palaniappan et al.7. الاختصارات: CAM = غشاء chorioallantoic ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يمكن استخدام اختبار CAM-Delam لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم عملية التفكيك. أحد الأمثلة على ذلك هو استخدام علاج CoCl2 للحث على نقص الأكسجة مع أو بدون مزيج من تثبيط ميتالوبروتيناز المصفوفة (MMP) باستخدام مثبط MMP العريض GM6001 (الشكل 6). بعد علاج CoCl 2 ، اكتسبت الخلايا السرطانية غير النقيلية U251 القدرة على تحفيز إزالة الصفائح والخلايا الغازية ، والتي تم قمعها عندما تم دمج علاج CoCl2 مع مثبط MMP GM6001 (الشكل 6). وبالتالي ، يمكن أن يكون فحص CAM-Delam مفيدا عند تحديد الجزيئات والمسارات الجزيئية التي تؤثر على عملية التفكيك.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig06.jpg"> الشكل 6: أنماط التحلل استجابة لخلايا U251 المعرضة ل CoCl2 بمفردها أو مع مثبط MMP. (أ-ج) خلايا U251 المستزرعة لمدة 3.5 أيام على CAM خلال ظروف مختلفة. (أ) خلايا U251 المستزرعة وحدها لم تحفز أي ضرر للأمينين. (ب) خلايا U251 المستزرعة المعرضة مسبقا ل CoCl2 (24 ساعة) قبل الغسيل وبذر الخلايا على تلف اللامينين الناجم عن CAM وغزو الخلايا. (ج) المعالجة المسبقة بمثبط MMP واسع الطيف GM6001 (لمدة 1 ساعة) ، تليها التعرض ل CoCl 2 (24 ساعة) قبل غسل وبذر خلايا U251 على CAM ، قمعت تأثير علاج CoCl2 ، ولم يتم الكشف عن أي تلف واضح في الصفيحة أو غزو الخلايا السرطانية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (A-C). واللجنتان (باء) و (جيم) مأخوذتان من Palaniappan et al.7. الاختصارات: CAM = غشاء chorioallantoic ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; CoCl2 = كلوريد الكوبالت; MMP = مصفوفة ميتالوبروتيناز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

إن اختبار CAM-Delam لتقييم القدرة النقيلية للخلايا السرطانية سريع نسبيا وسهل ورخيص. يمكن استخدام هذه الطريقة لكشف الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين ورم خبيث ولفحص الأدوية. يمكن أن يكون الفحص الأمثل لتحليل عينات الورم البشري طريقة سريرية لعلاج السرطان الشخصي.

فحص CAM-Delam لتسجيل الخصائص النقيلية عن طريق تحديد قدرة التحلل والغزو للخلايا السرطانية

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

تقوم هذه الطريقة بتصور وتحديد قدرة الخلايا السرطانية على التطهير والغزو ، وبالتالي القدرة على تقييم عدوانيتها النقيلية قبل تكوين العمل أو الانبثاث. أن يعتمد التسجيل على عملية التفكيك كشرط أساسي لتشكيل ورم خبيث ، وبالتالي تحقيق المعلومات المتعلقة بالعدوانية النقيلية للخلايا بطريقة سريعة وسهلة ورخيصة نسبيا. تدرب على الخطوات الفردية المختلفة أولا قبل بدء التجربة الفعلية.يتضمن فحص CAM-Delam العديد من الخطوات الفنية التي يصعب شرحها كتابيا وأسهل بكثير في التقدير والتعلم من خلال العرض المرئي. لبدء وضع العدد المطلوب من البيض في صواني البيض واحتضان بيض الفرخ أفقيا في حاضنة البيض. ثم قم بتعقيم 30 قاربا يزن و 30 صندوقا بلاستيكيا صغيرا بأغطية شفافة عن طريق رش 70٪ من الإيثانول.بعد ذلك ، قم بتجفيف قوارب الوزن والصناديق في غطاء ورققي طوال الليل وتخزينها في صندوق بلاستيكي مغلق حتى يتم استخدامها مرة أخرى في يوم الحضانة الثالث. قم بتعقيم لترين من الماء المقطر أو منزوع الأيونات لكل 30 بيضة محتضنة ، وزوجين من المقص ، وثلاثة أزواج من الملقط. أولا ، أضف ما يقرب من 50 ملليلتر من الماء المعقم إلى الصناديق البلاستيكية المعقمة وأغلق الأغطية.في يوم الحضانة الثالث ، قم بتكسير قشرة البيضة باستخدام الجزء الحاد من المقص وقطع فتحة مستقيمة في القشرة. بعد فتح قشرة البيضة يدويا فوق قارب الوزن ، اجمع بياض البيض وصفار البيض وربطه بجنين سليم في قارب الوزن. ثم ابحث عن جنين سليم بقلب نابض وصفار سليم وأوعية دموية متطورة للتجربة.بعد ذلك ، انقل قارب الوزن بلطف إلى غرفة داخلية مرطبة واحتضن الغرفة الداخلية المرطبة في حاضنة البيض. لإعداد حلقات السيليكون ، قم بقطع أنبوب سيليكون بقطر داخلي وخارجي يبلغ أربعة ملليمترات وخمسة ملليمترات على التوالي بسماكة ملليمتر واحد تقريبا ، ويفضل استخدام قاطع ورق. ثم انقل حلقات السيليكون إلى زجاجات زجاجية صغيرة.قم بتغطيتها بورق معدني وتعقيمها باستخدام الأوتوكلاف أو ما شابه ذلك. تخزين حلقات السيليكون المعقمة في درجة حرارة الغرفة. استزرع خطوط الخلايا السرطانية ذات الاهتمام في وسط الثقافة ذي الصلة في زراعة الخلايا.ثم تحضير ملليلتر واحد من مزيج RPMI الكولاجين والحفاظ عليه على الجليد. بعد ذلك ، قم بالتريبسين الخلايا السرطانية لعزل الخلايا عن طريق إزالة وسط زراعة الخلايا أولا وغسلها. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التربسين لكل طبق زراعة خلية قطره 15 سم واحتضنه لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في حاضنة زراعة الخلايا حتى تنفصل الخلايا.باستخدام مجهر مقلوب على الطاولة ، انظر الخلايا المنفصلة. ثم قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة خمسة ملليلترات من وسط RPMI الكامل إلى كل طبق من أطباق زراعة الخلايا وجمع تعليق الخلية من جميع أطباق زراعة الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر. لحساب الخلايا السرطانية ، أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى 10 ميكرولترات من 0.4٪ من بقع التربان الزرقاء.بعد خلط العينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من خليط الخلية لكل غرفة في شريحة العينة في عداد الخلية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق زراعة الخلايا ذات الحجم الصحيح في أنبوب 50 ملليلتر عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من السوبرناتانت ، امزج حبيبة الخلية مع ملليلتر واحد من مزيج الكولاجين RPMI.بمجرد خلط الخلايا مع ماصة ملليلتر واحدة ، حافظ على تعليق الخلية المحضر على الجليد. في يوم الحضانة 10 ، أخرج الغرف الداخلية المرطبة مع البيض المحتضن بدون قشرة من الحاضنة. بعد فتح الغرفة الداخلية المرطبة ، ضع ما يصل إلى ست حلقات سيليكون على CAM باستخدام ملقط معقم.بمجرد خلط تعليق الخلايا السرطانية عن طريق السحب للحصول على توزيع متساو للخلايا السرطانية ، أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية المحضر داخل حلقة سيليكون. بعد إغلاق الغرفة الرطبة الداخلية ، ضعها في حاضنة البيض. بعد 14 ساعة و 1.5 يوم و 2.5 يوم و 3.5 يوم من الحضانة ، أخرج ما يقرب من سبع غرف داخلية مرطبة أثناء فتح أغطيتها واحدة تلو الأخرى.باستخدام زوج من المقصات ، قم بتشريح الخلايا السرطانية المستزرعة المرتبطة ب CAM عن طريق القطع خارج حلقة السيليكون. ثم انقل على الفور عينة CAM-Delam المعزولة باستخدام ملقط إلى 4٪ paraformaldehyde في 0.1 مخزن مؤقت للفوسفات المولي في طبق بتري لتثبيت الأنسجة واحتفظ بها على الجليد أو عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد 4٪ وأضف 30٪ من السكروز في مخزن مؤقت للفوسفات المولي 0.1 إلى عينات CAM-Delam وتوازن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة حلقة السيليكون بعناية باستخدام الملقط. بعد ذلك ، قم بقطع عينة CAM-Delam في شكل مستطيل مع الخلايا السرطانية في الوسط باستخدام زوج من المقص. ثم انقل عينات CAM-Delam إلى وسط مقطع مجمد في طبق بتري لإزالة السكروز الزائد ثم إلى تضمين القوالب في وسط المقطع المجمد بزوج من الملقط.تحت مجهر التشريح ، ضع عينة CAM-Delam على شكل حرف U في تفاعل رأسي في قوالب التضمين باستخدام أي أداة تشبه الإبرة وقم بتخزين عينات CAM-Delam عند 80 درجة مئوية. ثم قسم عينات CAM-Delam المجمدة عند 10 ميكرومتر على خمس إلى ست شرائح متتالية باستخدام التقسيم بالتبريد. أولا ، قم بعمل خط بعلامة مسعورة على الشرائح حيث تنتهي الأقسام واتركها تجف لبضع دقائق.ثم ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بتغطية الأقسام بحوالي 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول الحجب واحتضنها لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد سكب محلول الحجب ، استبدله ب 100 إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية المخفف في محلول الحجب واحتضنه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. وبالمثل ، بعد صب محلول الأجسام المضادة الأساسي ، انقل الشرائح إلى الكوفيت الزجاجي واغسلها ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.بعد ذلك ، قم بإزالة TBST الزائد من الشريحة ومن منطقة الحاجز الكارهة للماء بمنديل ورقي ناعم وقم بتغطية الشريحة ب 100 إلى 150 ميكرولتر من جسم مضاد فلورسنت ثانوي مناسب مخفف في محلول مانع مع DAPI. احتضان الشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد سكب محلول الأجسام المضادة الثانوي ، انقل الشرائح إلى الكوفيت الزجاجي واغسلها ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.ثم قم بإزالة TBST الزائد من الشريحة ومن منطقة الحاجز الكارهة للماء باستخدام منديل ورقي ناعم. بعد ذلك ، قم بتركيب الشرائح عن طريق وضع قطرة إلى قطرتين من وسط تركيب الفلورسنت على الشريحة ووضع انزلاق غطاء زجاجي برفق مع تجنب فقاعات الهواء. قم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر epifluorescence المجهز بكاميرا رقمية ، ويفضل أن يكون ذلك في تكبير 10 X وتحليل الأقسام باستخدام فئات تسجيل CAM-Delam التالية كما هو موضح في المخطوطة.أدى استخدام الغرف الرطبة الداخلية إلى تحسين معدل بقاء أجنة الكتاكيت بشكل كبير من أقل من 50٪ إلى 90٪ في يوم الحضانة 10 ومن حوالي 15٪ إلى 80٪ في يوم الحضانة 13. تظهر النتائج أن قدرة الخلايا السرطانية على تحلل الصفيحة القاعدية وغزو اللحمة المتوسطة يمكن تسجيلها في أربع فئات بما في ذلك الصفيحة القاعدية السليمة دون تغييرات مرئية ، والصفيحة القاعدية المعدلة ولكن غير التالفة ، والصفيحة القاعدية التالفة دون غزو الخلايا ، والصفيحة القاعدية التالفة مع غزو الخلايا. يظهر تلطيخ الأجسام المضادة ضد عامل فون ويلبراند أن الطب التكميلي والبديل كان سميكا أيضا مع زيادة في تكوين الأوعية الدموية عندما تسببت الخلايا السرطانية في تغيير أو تلف الصفيحة القاعدية.ومع ذلك ، لم يلاحظ أي من هذين النمطين الظاهريين عندما كان CAM سليما. استحدثت خلايا PC-3U اللامينين التالف بعد 1.5 يوم مع غزو واضح بعد 2.5 يوم. في المقابل ، تسببت خلايا U251 فقط في حدوث تغييرات طفيفة في اللامينين بعد 1.5 إلى 3.5 أيام ، ولكنها لم تسبب أي ضرر مرئي للأمينين.بعد علاج كلوريد الكوبالت ، اكتسبت الخلايا السرطانية غير النقيلية U251 القدرة على تحفيز التفكيك والخلايا الغازية ، والتي تم قمعها عند دمجها مع مثبط MMP ، GM6001. عدم إتلاف CAM بطرف الماصة عند بذر الخلايا السرطانية لأن مثل هذا الضرر للغشاء سيدمر قراءات الفحص. الاحتمال المستقبلي هو تحسين طريقة CAM-Delam لتحديد الخصائص النقيلية في عينات الورم السريرية ، والتي يمكن أن تكمل في المستقبل مرحلة ورم خبيث عقدة الورم المستخدمة اليوم.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

تحليل لغزو خلايا السرطان والمنتشر لمكافحة المخدرات فحص استخدام صفيف المائية الصغيرة-الدائرة (همكا)-على أساس لوحات

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...