Name: cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells
Uploaded: 2022-06-02T14:40:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

אנו מודים לחוקרים הבאים באוניברסיטת אומאו על עזרתם בקווים ונוגדנים רלוונטיים של תאי סרטן: ל. קרלסון (נוגדן מפעל פון וילברנד), ג'יי גילת'ורפ (U251) ומ' לנדסטרום (PC-3U). אנו מודים גם להוקה הולתוסן במעבדת גילת'ורפ על יצירת קו התאים היציבים HEK293-TLR-AAVS1. העבודה במעבדת Gunhaga נתמכה על ידי הקרן השוודית לסרטן (18 0463), חממת הביוטק Umeå, Norrlands Cancerforskningsfond, מועצת המחקר השוודית (2017-01430) והפקולטה לרפואה באוניברסיטת אומאו.

בקצרה, איור 1 מסכם את השלבים הכוללים בבדיקת CAM-Delam. הפרוטוקול שלהלן מבוסס על 30 ביצי תרנגולות מופרות בתרבית ושימוש בשני קווי תאים סרטניים שונים שנזרעו בנפרד בשלוש טבעות/ביצה ונותחו בארבע נקודות זמן.
1. דגירה של ביצים
<ol><li>השתמשו בביצים מופרות של אפרוחים מדגרה מקומית, המבטיחות הפריה של יותר מ-90% הערה: הביצים לא היו צריכות להיות מאוחסנות במשך יותר מ -4 ימים בטמפרטורת החדר (RT). בשוודיה, אישור אתי לשימוש ניסיוני בתרנגולות עובריות נדרש רק מהיום העוברי (E) 14 ואילך.</li>
	<li>במידת הצורך, נגבו בזהירות מכנית כל לכלוך או נוצה על הביצים באמצעות מגבת נייר יבשה או רטובים במים.</li>
	<li>נקו ועקרו את אינקובטור הביצים עם 70% אתנול לפני השימוש (בכל פעם).</li>
	<li>הניחו את מספר הביצים הרצוי במגשי ביצים ודגרו את ביצי האפרוח בצורה אופקית באינקובטור ביצים בטמפרטורה של 37.5-38 מעלות צלזיוס עם לחות של 70%. קחו את זה כעל יום הדגירה 0 (איור 1A).</li>
</ol>2. הכנת סירת שקילה, קופסאות פלסטיק ומכשירי דיסקציה
<ol><li>השתמשו ב-70% אתנול כדי לעקר 30 סירות שקילה וב-30 קופסאות פלסטיק קטנות (כ-0.4 ליטר) עם כובעים שקופים.</li>
	<li>מייבשים את סירות השקילה והקופסאות במכסה מנוע למינרי למשך הלילה (ON) ומאחסנים בקופסת פלסטיק סגורה עד לשימוש נוסף ביום הדגירה 3.</li>
	<li>לעקר 2 ליטר של H מזוקק או deionized H2O לכל 30 ביצים דגירה.</li>
	<li>לעקר שני זוגות מספריים ושלושה זוגות מלקחיים על ידי ריסוס 70% אתנול. מייבשים את המכשירים באוויר ואז מאחסנים אותם בקופסה מעוקרת עד ליום הדגירה 3. הערה: פעולות אלה (שלבים 2.1-2.4) יכולות להיעשות בכל יום לפני יום הדגירה 3. השתמש בכפפות כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>3. פותחים את הביצים ומעבירים לתא הלח הפנימי
הערה: השתמש בכפפות ובמסכת פנים כדי למנוע זיהום.
<ol><li>מוסיפים כ-50 מ"ל של H2O מעוקר לקופסאות הפלסטיק המעוקרות. שמור את הקופסאות מלאות המים עם מכסים סגורים, כדי למנוע זיהום, ב- RT עד לשימוש.</li>
	<li>ביום הדגירה 3, לפצח את קליפת הביצה באמצעות החלק החד של המספריים ולחתוך פתח ישר בקליפה.</li>
	<li>לשבור באופן ידני את קליפת הביצה מעל סירת שקילה ולאסוף את חלבון הביצה, החלמון והעובר הבריא המחובר אליו בסירת השקילה (איור 1B). חפשו עובר שלם עם לב פועם, חלמון שלם וכלי דם מפותחים לניסוי (>95% מהביציות המדגרות). השליכו ביציות עם עובר מעוות, עובר ללא לב פועם, חלמון ביצה שבור או כלי דם פגומים של חלמון.</li>
	<li>מעבירים בעדינות את סירת השקילה לחדר לחות פנימי. הערה: עבור שלבים 3.2.-3.4., עבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע זיהום, ואם אפשר, השתמש במכסה מנוע למינרי.</li>
	<li>דגירה של החדר הלח הפנימי באינקובטור הביצים (איור 1C).</li>
	<li>תרבית את הביצים ללא קליפות מהיום ה-3 עד היום ה-10 באינקובטור הביצים לפני השימוש בהן (ראו שלב 3.6),ובעת הצורך, הוסיפו מים לחממה כדי לשמור על לחות של 70%.</li>
	<li>בדקו את התאים הלחים הפנימיים דרך מכסה הפלסטיק השקוף לאיתור עוברים מתים או ביציות מזוהמות ללא קליפה מדי יום, והסירו אותם מהאינקובטור.</li>
</ol>4. הכנת טבעות סיליקון
<ol><li>כדי להכין טבעות סיליקון, חותכים צינור סיליקון בקוטר פנימי וחיצוני של 4 מ"מ ו-5 מ"מ, בהתאמה, בעובי של כ-1 מ"מ, רצוי באמצעות חותך נייר (איור 1D).</li>
	<li>מעבירים את טבעות הסיליקון לבקבוקי זכוכית קטנים (איור 1D), מכסים בנייר כסף מתכת ומעקרים אותן באמצעות אוטוקלאב או דומה. הערה: הימנעו מבדיקות אוטוקלאב חוזרות ונשנות של טבעות סיליקון שאינן בשימוש שעלולות להיות מזוהמות, שכן טיפול כזה מקטין את הקיבולת של טבעות הסיליקון להיצמד לממברנה, עם דליפה נוספת של תמיסת התא הסרטני/קולגן/RPMI מחוץ לטבעות.</li>
	<li>אחסנו את טבעות הסיליקון הסטריליות ב-RT. הערה: ניתן לבצע שלב זה בכל יום לפני יום הדגירה 10.</li>
</ol>5. הכנת תאים סרטניים
הערה: תמיסות כגון מדיום תרבית תאים, טריפסין ו-1x PBS מאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ויש לחמם אותן ל-37 מעלות צלזיוס באמבטיית מים לפני הוספתן לתאים. לאחר החימום יש לשטוף את הבקבוקים ב-70% אתנול ולייבש לפני השימוש.
<ol><li>תרבית את קווי העניין של התאים הסרטניים במדיום התרבית הרלוונטי בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% (v/v) CO2. הערה: כאן, U251-GFP גליובלסטומה ותאי סרטן ערמונית PC-3U-GFP עברו תרבית במדיום RPMI בינוני-RPMI שלם בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין (PS).</li>
	<li>תכנן את תרבית התאים הסרטניים כך שכ-50 × 106 תאים סרטניים יהיו מוכנים לקציר ביום הדגירה 10 של בדיקת CAM-Delam.</li>
	<li>שנה את מדיום תרבית התאים כל 2-3 ימים, או כאשר הצבע הבינוני משתנה מוורוד לכתום/צהוב.</li>
	<li>אופציונלי: לגרום להיפוקסיה על ידי טיפול בתאים הסרטניים באמצעות CoCl2 כדי לחקור את ההשפעות המכניסטיות המולקולריות על דלאנציה יום אחד לפני קצירת התאים. אזהרה: ל-CoCl2 יש רעילות מתונה. טפלו בזהירות במכסה אדים, ועקבו אחר הוראות היצרן.<ol>
<li>הכן תמיסת מלאי טרייה של 20 mM CoCl2 על ידי המסת 0.0258 גרם ב-10 מ"ל של H20 מזוקק מעוקר בצינור חרוטי 15 מ"ל עטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.</li>
		<li>בצינור חרוטי של 50 מ"ל, יש לערבב 250 μL של תמיסת המניות CoCl 2 של 20 mM CoCl2 ב-25 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 1% (v/v) PS (אך ללא FBS) לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ. מערבולת בעדינות.</li>
		<li>הסר את מדיום ה-RPMI המלא ממנות תרביות התאים.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם מעוקר 1x PBS 2x.</li>
		<li>הוסף 25 מ"ל של מדיום RPMI עם טריפסיניזציה של 200 μM CoCl2 (ראה שלב 5.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 10 של דגירה של ביצים, הכינו 1 מ"ל של תערובת קולגן/RPMI (יחס של 1:3), המכילה 250 μL של קולגן מסוג I (5 מ"ג/מ"ל) ו-750 μL של מדיום RPMI מתרבית תאים בתוספת 10% FBS ו-1% (v/v) PS. שמרו את תערובת הקולגן/RPMI על הקרח.</li>
	<li>נסה את התאים הסרטניים לבודד את התאים על ידי הסרת מדיום תרביות התאים תחילה ושטיפת 2x עם 1x PBS.</li>
	<li>מוסיפים 3 מ"ל של תמיסת טריפסין (0.05%) לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ ומדגרים במשך 2-3 דקות בחממת תרביות תאים עד שהתאים מתנתקים. השתמש במיקרוסקופ הפוך עם ראש טבלה כדי לראות את התאים המנותקים. במידת הצורך, הקש בעדינות על צד הבקבוקון כדי לנתק תאים שנותרו מקובצים או מחוברים לאשכולות.</li>
	<li>השביתו את הטריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום RPMI שלם לכל צלחת תרבית תאים ואספו את תרחיף התאים מכל מנות תרביות התאים לצינור של 50 מ"ל.</li>
	<li>ספרו את התאים הסרטניים בשיטת ההדרה של Tripan Blue כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים באמצעות מונה תאים. הוסיפו 10 μL של תרחיף התא ל-10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן. מערבבים את הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן טוענים 10 μL של תערובת התאים לכל תא לתוך שקופית הדגימה במונה התא. חזור על ספירת תאים פי 3 כדי לאמת את מספר התא/מ"ל.</li>
	<li>חישוב וצנטריפוגה של תרחיף תרבית התאים בנפח הנכון המכיל 50 x 106 תאים סרטניים חיים בצינור 50 מ"ל ב-500 × גרם למשך 5 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנטנט וערבבו את גלולת התא עם 1 מ"ל של תערובת הקולגן/RPMI. מכיוון שקולגן הוא חומר ג'לטיני, ערבבו את התאים לאט ובזהירות רבה עם פיפטה של 1 מ"ל כדי למנוע אובדן תאים ביצירת בועות.</li>
	<li>שמור את תרחיף התא המוכן על הקרח והביא אותו לאזור העבודה של הביצה. הערה: הימנעו מלהשאיר את התאים הסרטניים המוכנים על הקרח במשך זמן רב מדי. יש להניח את התאים הסרטניים המוכנים על ה- CAM תוך 15-25 דקות.</li>
</ol>6. זריעת התאים הסרטניים על ה-CAM
הערה: השתמש בכפפות ובמסכת פנים כדי למנוע זיהום.
<ol><li>ביום הדגירה ה-10, מוציאים את התאים הלחים הפנימיים עם הביצים נטולות הקליפות המדגרות מהאינקובטור. הערה: ניתן להשתמש בכ-90% מהמספר ההתחלתי של הביצים המדגרות; ראו איור 2.</li>
	<li>פתחו את התא הפנימי והניחו עד שש טבעות סיליקון על ה-CAM באמצעות מלקחיים מעוקרים. הערה: הימנע מהנחת טבעות הסיליקון זו ליד זו או קרוב לכלי דם גדולים יותר.</li>
	<li>ערבבו את תרחיף התא הסרטני על ידי צנרת כדי לקבל חלוקה שווה של תאים סרטניים, והוסיפו 20 μL (1 × 106 תאים) של תרחיף התא הסרטני המוכן בתוך טבעת סיליקון (איור 1E). בעת הוספת התאים, שמור את קצה הפיפטה מעל ה- CAM כדי לוודא שלא תפגע בקרום. הערה: על פי ממצאים קודמים7, ניתן לזרוע תאים סרטניים שונים בטבעות נפרדות על אותה CAM.</li>
	<li>סגור את החדר הלח הפנימי והכניס אותו לחממת הביצים.</li>
</ol>7. בידוד של ה- CAM עם תאים סרטניים הקשורים
<ol><li>לאחר 14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימי דגירה, מוציאים כשבעה תאים פנימיים לחים ופותחים את המכסים בזה אחר זה.</li>
	<li>בעזרת זוג מספריים, נתחו את התאים הסרטניים בתרבית המחוברים ל-CAM (מה שמכונה דגימות CAM-Delam) על ידי חיתוך מחוץ לטבעת הסיליקון (איור 1F).</li>
	<li>מעבירים באופן מיידי את דגימת CAM-Delam המבודדת באמצעות מלקחיים ל-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.1 M מאגר פוספט (PB) בצלחת פטרי לקיבוע הרקמה. יש לשמור על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הערה: אחסן פתרון PFA של 4% בטמפרטורה של 4 °C (75 °F) למשך 5 ימים לכל היותר. אזהרה: PFA הוא רעיל. כשאתם מטפלים באבקת PFA ובפתרונות PFA, השתמשו במכסה אדים ועטו מסכת פנים וכפפות. הימנעו משאיפת אבקה או אדי תמיסה. בצע את הוראות היצרן.</li>
	<li>ערפו את עוברי התרנגולות והשליכו כפסולת ביולוגית בפחים ספציפיים.</li>
	<li>הסר את פתרון ה- PFA של 4% והוסף 30% סוכרוז ב- 0.1 M PB לדגימות CAM-Delam ושיווי משקל ב- 4 ° C למשך שעה אחת.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את טבעת הסיליקון באמצעות מלקחיים. בעזרת זוג מספריים, חתכו את דגימת CAM-Delam בצורה מלבנית עם התאים הסרטניים באמצע (איור 1G).</li>
	<li>בעזרת זוג מלקחיים, העבירו את דגימות ה-CAM-Delam למדיום חתך קפוא בצלחת פטרי כדי להסיר עודפי סוכרוז ולאחר מכן להטמעת תבניות במדיום חתך קפוא.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את דגימת CAM-Delam בצורת U בכיוון אנכי בתבניות ההטבעה באמצעות כל מכשיר דמוי מחט (איור 1G).</li>
	<li>הקפיאו ואחסנו את הדוגמאות של CAM-Delam בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>8. חלוקת דוגמאות CAM-Delam
<ol><li>חלקו את דגימות CAM-Delam הקפואות ב-10 מיקרומטר ב-5-6 שקופיות עוקבות באמצעות cryosectioning.</li>
	<li>אחסן את השקופיות עם מקטעים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס או השתמש ישירות לצביעת אימונוהיסטוכימיה.</li>
</ol>9. צביעת אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>הביאו את השקופיות מ-−80 מעלות צלזיוס ל-RT למשך 5 דקות לפני שתתחילו את האימונופרוטוקול.</li>
	<li>צור קו עם סמן הידרופובי על השקופיות שבהן מסתיימים המקטעים. תנו להם להתייבש במשך כמה דקות.</li>
	<li>מניחים את השקופיות בתא לח (H2O) ומכסים את החלקים בכ-200-500 μL של תמיסת חסימה (10% סרום עגל עוברי ו-0.1% נתרן אזיד במי מלח עם 0.1% Triton X-100 [TBST]) ודגירה למשך 15-30 דקות. הערה: משלב זה ואילך, אל תתנו לשקופיות להתייבש בכל עת.</li>
	<li>שפכו את תמיסת החסימה והחליפו אותה ב-100-150 μL של הנוגדן העיקרי בעל העניין המדולל בתמיסה החוסמת ודגירה ON בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. רצוי להשתמש בנוגדן ארנב נגד למינין-111 כדי להגדיר את הלמינה הבסיסית יחד עם סמן תאי סרטן, אם לא באמצעות GFP או קווי תאים סרטניים אחרים המתויגים בפלואורסצנט. הערה: כאן, ארנב אנטי פון וילברנד פקטור שימש גם כדי לזהות כלי דם ב- CAM.</li>
	<li>הכינו שלוש קוביות זכוכית מלאות במאגר TBST.</li>
	<li>יוצקים את תמיסת הנוגדנים העיקרית, מעבירים את המגלשות לקובטות הזכוכית, ושוטפים לפחות 3x למשך 5 דקות כל אחת ב-TBST.</li>
	<li>הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה.</li>
	<li>כסו את המגלשה ב-100-150 μL של נוגדן פלואורסצנטי משני מתאים המדולל בתמיסת חסימה בשילוב עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI) ודגירה בחושך ב-RT למשך שעה אחת.</li>
	<li>יוצקים את תמיסת הנוגדנים המשנית, מעבירים את השקופיות לקובטות הזכוכית, ושוטפים לפחות 3x למשך 5 דקות כל אחת ב-TBST.</li>
	<li>הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה.</li>
	<li>הרכיבו את המגלשות על ידי הצבת 1-2 טיפות של מדיום הרכבה פלואורסצנטית על המגלשה, והניחו בעדינות מכסה זכוכית, תוך הימנעות מבועות אוויר.</li>
	<li>תן לשקופיות להתייבש במשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח, ואחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C (6 °F).</li>
</ol>10. הדמיה מיקרוסקופית וניקוד דלמינציה
<ol><li>צלמו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית, רצוי בהגדלה של פי 10 (איור 1H).</li>
	<li>נתחו את המקטעים באמצעות קטגוריות הניקוד הבאות של CAM-Delam (איור 3):<ol>
<li>חפשו למינה בסיסית שלמה ללא שינויים נראים לעין.</li>
		<li>חפשו את הלמינה הבסיסית המשתנה אך לא פגומה.</li>
		<li>חפשו את הלמינה הבסיסית הפגומה ללא פלישת תאים.</li>
		<li>חפשו למינה בסיסית פגומה עם פלישת תאים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vasantharajan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+landscape+of+circulating+tumour+cells.">The epigenetic landscape of circulating tumour cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li><li>Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+matrix+metalloproteinases:+their+functions+and+regulations.">Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations.</a> Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).</li><li>Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM+and+ADAMTS+family+proteins+and+their+role+in+the+colorectal+cancer+etiopathogenesis.">ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis.</a> BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).</li><li>Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+alternative+model+for+cancer+studies.">Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies.</a> Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).</li><li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+spread+and+micrometastasis+development:+quantitative+approaches+for+in+vivo+models.">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAM-Delam:+an+in+vivo+approach+to+visualize+and+quantify+the+delamination+and+invasion+capacity+of+human+cancer+cells.">CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).</li><li>Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+von+Willebrand+factor.">Zebrafish von Willebrand factor.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).</li><li>Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+egg+chorioallantoic+membrane+(CAM)+model+as+an+in+vivo+method+for+the+investigation+of+the+invasion+and+metastasis+cascade+of+malignant+tumor+cells.">The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+endostatin+endostar+inhibits+tumor+growth+and+metastasis+in+a+mouse+xenograft+model+of+colon+cancer.">Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer.</a> Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+inhibition+of+presenilin+2+inhibits+glioma+cell+growth+and+invasion+and+is+involved+in+the+regulation+of+Nrg1/ErbB+signaling.">RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling.</a> Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).</li><li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+superfamily+15+promotes+lymphatic+metastasis+via+upregulation+of+vascular+endothelial+growth+factor-C+in+a+mouse+model+of+lung+cancer.">Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer.</a> Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells.">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li><li>Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCzeta+facilitates+lymphatic+metastatic+spread+of+prostate+cancer+cells+in+a+mice+xenograft+model.">PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model.</a> Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Jung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenograft+models+for+preclinical+assessment+of+anticancer+drug+development.">Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development.</a> Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+EZH2+mediates+tumor+progression+on+the+chick+chorioallantoic+membrane+assay,+a+novel+model+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li><li>Steinmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPK1+loss+triggers+tumor+invasion+in+colorectal+tumor+cells.">DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (12), 895 (2019).</li><li>Andrieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP14+is+required+for+delamination+of+chick+neural+crest+cells+independently+of+its+catalytic+activity.">MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity.</a> Development. 147 (7), (2020).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+apoptosis+during+the+formation+of+the+terminal+nerve+ganglion+by+olfactory+placode-derived+cells+with+distinct+molecular+markers.">Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers.</a> Differentiation. 110, 8-16 (2019).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Pineros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+TNM:+a+registry+tool+to+reduce+gaps+in+cancer+staging+information.">Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information.</a> The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).</li><li>Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+response+in+organoids+generated+from+frozen+primary+tumor+tissues.">Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues.</a> Scientific Reports. 6, 18889 (2016).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

מאמר זה מתאר את מבחן CAM-Delam כדי להעריך את האגרסיביות הגרורתית של תאים סרטניים, שנקבעה על ידי ניקוד אפנון למינה בסיסית ופלישה פוטנציאלית של תאים לתוך המזנכים תוך פרק זמן של שעות עד כמה ימים. בעיה טכנית קודמת עבור מבחני CAM שונים הייתה ההישרדות הנמוכה של עוברי אפרוחים. בעיה זו נפתרה על ידי הכנסת השימוש בתא לחות פנימי במהלך הדגירה של העובר, מה שהגדיל את הישרדות העוברים מ-10%-50% ל-80%-90%7. השימוש בתא לחות פנימי עשוי, אם כן, להיות בעל ערך במבחני CAM באופן כללי, כמו גם בניסויים אחרים של אפרוחי אובו לשעבר.
נקודות זמן הניקוד המוצגות ב-14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימים לאחר זריעה של 1 x 106 תאים סרטניים ב-CAM מבוססות על פיתוח שיטה קפדנית באמצעות שישה קווי תאים סרטניים שונים, והן מספיקות כדי להבחין בטווח שבין אי-הפחתה ליכולות של אי-הפחתה ליכולות של תאי סרטן. מוצע שימוש מינימלי בארבע ביצים עם שלוש טבעות בכל נקודת זמן ובכל קו תא, ויש לחזור על כך לפחות פעם אחת או על פי תכנוני הניסוי והדרישות הסטטיסטיות. אחד היתרונות של בדיקת CAM-Delam הוא השגת תוצאות אינפורמטיביות לגבי יכולת ההפחתה של תאים סרטניים תוך מספר ימים כדי להעריך את האגרסיביות של תאים סרטניים ואת הסיכון הפוטנציאלי להיווצרות גרורות. המסירה המהירה של התוצאות מתאפשרת על ידי ניטור ההשפלה של הלמינה הבסיסית עקב תאי הסרטן הפולשים והמיקרוטומורים / ניצני הגידול וגרורות האיברים הבאים. באופן מסורתי, מודלים CAM שימשו כדי לנתח את היווצרות של גרורות איברים, אשר לוקח כ 2 שבועות כדי להיקבע9. על ידי שימוש בשבעה קווי תאים סרטניים שונים, אימתנו בעבר7 כי ניקוד ההדלאה קשור ליכולתם של תאים סרטניים ליצור גרורות במודלים של מכרסמים 10,11,12,13,14, מה שתומך בערך הניבוי של מבחן CAM-Delam. יתר על כן, מודלים של עכברים דורשים זמן ארוך עוד יותר, מספר שבועות עד חודשים, לפני שניתן יהיה לבחון גרורות 15,16. בקצרה, בדיקת CAM-Delam מפותחת זו, המתמקדת בניקוד יכולת ההדלציה ולא בבחינת היווצרות גידול מאוחרת יותר בעובר האפרוח, היא, אם כן, השלמה טובה למודלים קיימים של פלישת עוף CAM וגידולי עכברים.
מגבלה בבדיקת CAM-Delam עשויה להיות הדמיה לא ברורה של הלמינה הבסיסית אם התאים הסרטניים עצמם מבטאים למינין. אם כן, סמנים אחרים המציינים את הלמינה הבסיסית, כגון E-cadherin, יכולים לשמש7. מחקרי פלישת CAM אחרים השתמשו בקולגן מסוג IV כדי לדמיין את CAM ואת הפאן-ציטוקראטין והווימנטין כדי לזהות תאים סרטניים פולשים ואת היווצרותם של מיקרוטומורים/ניצני גידול17,18.
דלמינציה היא תהליך תאי תקין, הן במהלך ההתפתחות והן בשלב מאוחר יותר בחיים, מה שמאפשר לתאים לעזוב אפיתל ולנדוד לרקמות אחרות. דוגמאות לתאים מתכלים במהלך ההתפתחות הן תאי עצב עצביים וחוש הריח החלוציים19,20; מאוחר יותר בחיים, ריפוי פצעים תלוי בהדלאה21. במהלך הסרטן, תהליך זה מווסת בתאים הלא נכונים ו/או בזמן הלא נכון. לפיכך, שיטת CAM-Delam יכולה לשמש כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההדחה, אשר תהיה בעלת חשיבות הן לידע ביולוגי בסיסי והן לידע במחלות. מחקרי דלמינציה כאלה יכללו הוספת גורמים בעלי עניין לתאים הסרטניים שנזרעו על ה-CAM או חקר תאים סרטניים מהונדסים גנטית. דוגמה אחת המוצגת כאן היא טיפול מקדים של CoCl2 של קו התאים הלא גרורתיים U251 כדי לגרום להיפוקסיה, מה שמוביל להשראת יכולת אגרסיבית גרורתית שיכולה להיות מדוכאת על ידי מעכב MMP רחב טווח. לפיכך, מציאת מולקולות מפתח השולטות בהתפרקות מגדילה את האפשרות לתכנן מעכבים כדי לדכא את התהליך הזה. בהקשר זה, שימוש פוטנציאלי נוסף בפרוטוקול CAM-Delam הוא בבדיקת סמים לדיכוי ההזיה והפלישה לתאים. יתר על כן, במרפאה, הערכת חומרת הסרטן היא מרכיב קריטי לאבחון, תכנון טיפול וטיפול. נכון לעכשיו, מערכת ההיערכות TNM (T, גודל הגידול; N, צומת-האם הסרטן התפשט לבלוטות הלימפה; M, גרורות מרוחקות) משמש להערכת חומרת הסרטן22. בדיקת CAM-Delam מגדירה גישה חדשנית להערכת האגרסיביות של תאים סרטניים והסיכון הפוטנציאלי להיווצרות גרורות ועשויה להוות השלמה שימושית למערכת ההיערכות TNM. ראויה לציון העובדה שהיערכות TNM מבוססת על ניתוחים של דגימות רקמות קבועות, בעוד שגישת CAM-Delam קלינית פוטנציאלית תבחן רקמה טרייה או טרייה-קפואה בשילוב עם טכניקות להחייאת תאים קפואים23.

כ -90% מהתמותה בחולי סרטן נגרמת על ידי ההשלכות של גרורות סרטן, שהיא היווצרות של גידולים משניים בחלקים אחרים של הגוף שממנו הסרטן במקור מקורו1. לכן, חשוב לזהות מנגנונים הקשורים לגרורות כדי למצוא מטרות פוטנציאליות לדיכוי היווצרות גרורות סרטניות. לאחר מכן, יש צורך במערכות מודל שבהן ניתן להעריך את התהליך הגרורתי. 
במהלך גרורות, תאים סרטניים עוברים מעבר אפיתל-למזנכימלי (EMT), תהליך תאי תקין שבו תאי אפיתל מאבדים את דבקותם ואת תכונות הקוטביות שלהם ובמקום זאת רוכשים אופי מזנכימלי פולשני2. דלמינציה היא חלק מתהליך ה-EMT וכרוכה בהתפרקות של למינין בקרום המרתף, המהווה תנאי מוקדם לתאים סרטניים לעזוב את הגידול הראשוני ולפלוש לרקמות אחרות. הגורמים העיקריים המווסתים במהלך היווצרות גרורות כוללים מטלופרוטינזות מטריצה (MMPs), ADAM (דיסינטרגין ומטאלופרוטינאז), ADAMTS (ADAM עם מוטיבים של טרומבוספונדין) ו-MMPs מסוג ממברנה (MT-MMPs)3,4. גורמים אלה מפרקים מולקולות כגון למינין, המתבטא בכל ממברנות המרתף, כדי להקל על נדידת תאים ופלישה.
קרום chorioallantoic (CAM) של ביצית אפרוח מופרה הוא סוג של קרום מרתף. ביצי אפרוח מופרות שימשו כמודלים גרורתיים, שבהם תאים סרטניים נזרעו על CAM החוץ-אמבריוני ומאוחר יותר היווצרות גרורות שנצפתה בעוברי האפרוח5. יתר על כן, מודלים גרורתיים של עכברים in vivo משמשים לעתים קרובות, שבהם תאים סרטניים מושתלים בעכברים וגרורות באיברים שונים מנותחים6. גישה זו גוזלת זמן רב, יקרה, ועלולה לגרום לאי נוחות עבור בעלי החיים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו את מבחן CAM-Delam, מודל מהיר וזול יותר להערכת האגרסיביות הגרורתית של תאים סרטניים. במודל זה, היכולת של תאים סרטניים לפרק את ה-CAM של האפרוח (למשל, יכולת ההפחתה) משולבת עם פלישה פוטנציאלית של תאים סרטניים לתוך המזנכים ומשמשת כמדידה של אגרסיביות גרורתית. 
המאמר הנוכחי, המבוסס על פרסום קודם7, מתאר את בדיקת CAM-Delam בפירוט, החל מטיפול בביצי אפרוח מופרות, תרבית תאים סרטניים וזריעה, כריתה וניתוח של דגימות CAM, וכלה בניקוד יכולת ההפחתה של תאים סרטניים לארבע קטגוריות: שלמים, משתנים, פגומים ופלישה. אנו גם נותנים דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך ההפחתה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>HM 505 E, Microm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon DS-Ri1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica M10</td>
			<td></td>
			<td>For CAM-sample dissection and positioning in molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td>Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse, E800</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8600 Series</td>
			<td>Model 817CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (small)</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Laminin-111</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Primary anti-rabbit antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Secondary antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0226</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Cobalt(II) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>232696-5G</td>
			<td>CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs</td>
			<td>Str&#246;mb&#228;cks &#196;gg, V&#228;nn&#228;s, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Any local egg supplyer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence mounting medium</td>
			<td>Allent Technologie</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass chambers for silicon rings</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001 MMP Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides for immunohistochemistry</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEG-50 frozen medium</td>
			<td>Cellab</td>
			<td>6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Peel-A-Way Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>15 cm in diameter for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td>Esclain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen</td>
			<td>Cellsystems</td>
			<td>5074-35ML</td>
			<td>5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rings</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>228-1580</td>
			<td>Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologi</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing boats</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>611-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTIONS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-RPMI media mixture (1 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compelete RPMI Media 
			750 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen 
			250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Mix and use immediately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI Media 
			445 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>FBS 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin 
			5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PB (0.2 M; 1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4 (MW 141.76) 
			21.9 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>NaH2PO4 (MW 137.99) 
			6.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add deionized water up to final volume of 1000ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store in RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Deionized water 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 M PB 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) 
			4g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>heat to 60 &#176;C in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add 5 M NaOH 
			25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Stir to dissolve the PFA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST (1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50mM Tris pH 7,4 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>150mM NaCI 
			30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0,1% Triton X-100 
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>H2O (MQ) 
			900 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %; 10 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS 
			9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10x Trypsin (0.5 %) 
			1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10 mL in total, Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells

הגורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן הוא היווצרות גרורות (כלומר, כאשר תאים סרטניים מתפשטים מהגידול הראשוני לאיברים מרוחקים ויוצרים גידולים משניים). דלמינציה, המוגדרת כהתפרקות של הלמינה הבסיסית וקרום המרתף, היא התהליך הראשוני המאפשר את ההעברה וההתפשטות של תאים סרטניים לרקמות ואיברים אחרים. ניקוד יכולת ההזיה של תאים סרטניים יצביע על הפוטנציאל הגרורתי של תאים אלה.
פיתחנו שיטה סטנדרטית, הבדיקה ex ovo CAM-Delam, כדי לדמיין ולכמת את היכולת של תאים סרטניים לדה-אמין ולפלוש, ובכך להיות מסוגלים להעריך אגרסיביות גרורתית. בקצרה, שיטת CAM-Delam כוללת זריעת תאים סרטניים בטבעות סיליקון על קרום האפרוחכוריאלנטואי (CAM) ביום העוברי 10, ולאחר מכן דגירה משעות עד כמה ימים. בדיקת CAM-Delam כוללת שימוש בתא לחות פנימי במהלך דגירה של עובר אפרוח. גישה חדשנית זו הגדילה את הישרדות העוברים מ-10%-50% ל-80%-90%, מה שפתר בעיות טכניות קודמות עם שיעורי הישרדות נמוכים של עוברים במבחני CAM שונים.
לאחר מכן, דגימות CAM עם אשכולות תאים סרטניים קשורים בודדו, תוקנו והוקפאו. לבסוף, דגימות שעברו חתך קריוסטאט צולמו ונותחו לצורך פגיעה בקרום המרתף ופלישה לתאים סרטניים באמצעות אימונוהיסטוכימיה. על-ידי הערכת קווי תאים סרטניים גרורתיים ולא גרורתיים ידועים שונים שנועדו לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), התוצאות הכמותיות של CAM-Delam הראו כי דפוסי יכולת ההפחתה משקפים אגרסיביות גרורתית וניתן לדרג אותם לארבע קטגוריות. שימוש עתידי במבחן זה, מלבד כימות יכולת ההפלה כאינדיקציה לאגרסיביות גרורתית, הוא לפענח את המנגנונים המולקולריים השולטים ב-delamination, בפלישה, ביצירת מיקרו-מטסטזות ובשינויים במיקרו-סביבה של הגידול.

איור 1 מציג שלבים מרכזיים במבחן CAM-Delam7. השימוש בתאי לחות פנימיים (איור 1C) שיפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של עוברי האפרוחים מ-<50% עד 90% ביום הדגירה 10 ומ-15% עד 80% ביום הדגירה ה-13 (איור 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig1v2.jpg"> איור 1: שלבים מרכזיים של בדיקת CAM-Delam. (A) דגירה של ביצי תרנגולות מופרות אופקית ללא סיבוב. (ב,ג) ביום השלישי לדגירה, פצחו את הביצים והניחו אותן בסירות שקילה סטריליות (B), והניחו את הסירות בתא לחות פנימי לצורך דגירה נוספת (C). (D) להכין טבעות סיליקון. (E) ביום 10 של הדגירה, מניחים את טבעות הסיליקון על ה-CAM, וזורעים 1 x 106 תאים סרטניים בתוך הטבעות באמצעות פיפטה. (ו,ז) בנקודות זמן שונות (שעות עד ימים), לנתח את ה- CAM עם תאים סרטניים מחוברים, (F) לתקן ב- PFA, לטפל בסוכרוז, למקם במדיום חתך קפוא, (G) ולהקפיא ב - 80 ° C. (H) דוגמה של CAM חתך עם תאים סרטניים GFP + הקשורים (ירוק) ו צביעת אימונוהיסטוכימיה למינין (אדום). סרגלי קנה מידה = 2 מ"מ (E, F), 1 מ"מ (G) ו- 100 מיקרומטר (H). נתון זה לקוח מתוך Palaniappan et al.7. קיצורים: CAM = קרום chorioallantoic; PFA = paraformaldehyde; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig2v2.jpg"> איור 2: הישרדות עוברי עוף ביחס לשיטת הדגירה. (A,B) ביום הדגירה 10, הישרדות עוברי עוף ב-HCs פנימיים הוכפלה (הערך הממוצע 89.33; N = 105) בהשוואה לדגירה בצלחות פטרי (A; ערך ממוצע 40; N = 64) ותאים לא לחים (B; ערך ממוצע 48.67; N = 46). (ג,ד) ביום הדגירה ה-13, שיעור הישרדות גבוה עדיין נצפה באמצעות HC (ערך ממוצע 81.67; N = 105), ואילו ירידה משמעותית בהישרדות העוברים נצפתה באמצעות PD (C; ערך ממוצע 11.33; N = 64), ו- N-HC (D; ערך ממוצע 18.33; N = 46). המובהקות הסטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t דו-זנב לא מזווג. פסי השגיאה מציינים את סטיית התקן. *עמ' < 0.05, **עמ' < 0.01, ***עמ' < 0.001. נתון זה שונה מ-Palaniappan et al.7. קיצורים: HC = תא לח; PD = צלחות פטרי; N-HC = תא לא לח; E X = יום הדגירה X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ניתוחים של קווי תאים סרטניים שונים המבטאים GFP (גליובלסטומה U251, ערמונית PC-3U, מעי גס SW620 וריאה A549) באמצעות פרוטוקול זה דווחו בעבר על ידי Palaniappan et al.7. התוצאות מבדיקת CAM-Delam כוללות הבדלים במורפולוגיה של הלמינה הבסיסית, שזוהתה על ידי למינין, ופלישה של תאים סרטניים, המוגדרים כתאים שחצו את שכבת הלמינה הבסיסית של האפרוח לתוך השכבה המזודרמלית של האפרוח (איור 3). התוצאות האלה מראות שהיכולת של תאים סרטניים לפרק את הלמינה הבסיסית ולפלוש למזנכים יכולה להיות מדורגת לאחת מארבע קטגוריות: 1) למינה בסיסית שלמה ללא שינויים נראים לעין (איור 3B), 2) למינינה בסיסית שעברה שינוי אך לא פגומה (איור 3C), 3) למינה בסיסית פגומה ללא פלישת תאים (איור 3D), ו-4) למינינה בסיסית פגומה עם פלישה תאית (איור 3E) ). תצפית נוספת הייתה שכאשר תאים סרטניים גרמו ללמינה בסיסית שהשתנתה או ניזוקה, גם ה-CAM התעבה עם עלייה בהיווצרות כלי הדם, המוגדרת על ידי צביעת נוגדנים כנגד פקטור פון וילברנד, המסונתז בכלי הדם8 (איור 4C-H). שני הפנוטיפים האלה, CAM מעובה והיווצרות מוגברת של כלי דם, לא נצפו כאשר ה-CAM היה שלם (איור 4A,B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig03.jpg"> איור 3: ניקוד CAM-Delam. (A-E) דוגמה לניקוד CAM-Delam המבוססת על שלמות הלמינה הבסיסית של CAM, שהומחשה על ידי אנטי-למינין (אדום), ופלישה פוטנציאלית של תאים סרטניים המבטאים GFP (ירוק). (A) שליטה ב-CAM ללא תאים סרטניים. (ב-ה) בתגובות לתאים סרטניים ניתן להבקיע ארבע קטגוריות המתארות את המורפולוגיה של הלמינה הבסיסית: (B) למינין שלם, (C) למינין שונה אך לא פגום (מסומן על ידי כוכבית), (D) למינין פגום אך ללא פלישת תאים סרטניים (חצים), למינין פגום עם פלישת תאים (ראשי חץ). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-E). נתון זה לקוח מתוך Palaniappan et al.7. קיצורים: CAM = קרום chorioallantoic; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig04.jpg"> איור 4: הערכה של עיבוי CAM ויצירת כלי דם. (א-ח) דוגמה להדמיה של עיבוי CAM ויצירת כלי דם, שזוהתה על ידי אנטי-פון וילברנד פקטור (אדום), בתגובה ללמינה של סוגי תאים סרטניים שונים. (א,ב) בקרת CAM ללא תאים סרטניים. (ג,ד) בתגובה לקו תאים סרטניים שאינו גרורתי (שנודע כ-Intact), לא זוהתה עיבוי ניכר של המזנכים או היווצרות מוגברת של כלי הדם. (ה-ה) בתגובה לתאים סרטניים גרורתיים וכתוצאה מכך שונה או ניזוק למינין, המזנכים התעבובו (מסומנים על ידי ראשי חץ כפולים) ונצפתה היווצרות מוגברת של כלי דם (מסומנת על ידי חצים). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ-Palaniappan et al.7. קיצורים: CAM = קרום chorioallantoic; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
תאי סרטן הערמונית U251 גליובלסטומה ו-PC-3U הם שתי דוגמאות לקווי תאים סרטניים עם יכולות דלמינציה שונות לחלוטין (איור 5). תאי PC-3U גרמו ללמינין פגום לאחר יום וחצי, עם פלישה ברורה לאחר 2.5 ימים (איור 5A). לעומת זאת, תאי U251 גרמו לשינויים קלים רק בלמינין לאחר 1.5-3.5 ימים, אך מעולם לא גרמו לנזק נראה לעין ללאמינין (איור 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig05.jpg"> איור 5: הדמיה של יכולת ההזיה של תאי סרטן הערמונית (PC-3U) והגליובלסטומה (U251). (A) תאי PC-3U גרמו לשינוי קל של למינין לאחר 14 שעות, נזק של למינין לאחר 1.5 ימים (חץ), ותחילת הפלישה לאחר 2.5 ימים, אשר הוגברה לאחר 3.5 ימים (ראשי חץ). (B) תאי U251 גרמו לשינוי קל של למינין לאחר 1.5-3.5 ימים. הלוחות הימניים מציגים גרפים המייצגים את ניקוד CAM-Delam. ציר ה-y מציין את מספר הדגימות, וציר ה-x מציין את נקודות הזמן של התרבית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,B). נתון זה שונה מ-Palaniappan et al.7. קיצורים: CAM = קרום chorioallantoic; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ניתן להשתמש בבדיקת CAM-Delam כדי להגדיר מנגנונים מולקולריים המווסתים את תהליך ההדחה. דוגמה אחת היא השימוש בטיפול CoCl2 כדי לגרום להיפוקסיה עם או בלי שילוב של מטאלופרוטינזות מטריצה מעכבות (MMP) באמצעות מעכב MMP רחב GM6001 (איור 6). לאחר טיפול ב-CoCl2 , תאים סרטניים לא גרורתיים מסוג U251 רכשו את היכולת לגרום לדלקה ולתאים פולשניים, אשר דוכאו כאשר הטיפול ב-CoCl2 שולב עם מעכב ה-MMP GM6001 (איור 6). לפיכך, בדיקת CAM-Delam יכולה להיות שימושית בעת הגדרת מולקולות ומסלולים מולקולריים המשפיעים על תהליך ההפחתה.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig06.jpg"> איור 6: דפוסי דלות בתגובה לתאי U251 שנחשפו ל-CoCl2 בלבד או יחד עם מעכב MMP. (א-ג) תאי U251 תרבית במשך 3.5 ימים ב-CAM בתנאים שונים. (א) תאי U251 שעברו תרבית לבדם לא גרמו נזק ללמינין. (B) תאי U251 בתרבית שנחשפו מראש ל-CoCl2 (24 שעות) לפני שטיפה וזריעת תאים ב-CAM גרמו לנזק למינין ולפלישה לתאים. (C) טיפול מקדים עם מעכב MMP רחב טווח GM6001 (במשך שעה אחת), ואחריו חשיפה ל-CoCl2 (24 שעות) לפני שטיפה וזריעה של תאי U251 על ה-CAM, דיכאו את ההשפעה של הטיפול ב-CoCl2, ולא זוהה נזק ברור ללאמינין או פלישה לתאים סרטניים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-C). לוחות (B) ו- (C) הם מ- Palaniappan et al.7. קיצורים: CAM = קרום chorioallantoic; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; CoCl2 = קובלט כלוריד; MMP = מטריצה מטאלופרוטינאז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

בדיקת CAM-Delam להערכת היכולת הגרורתית של תאים סרטניים היא מהירה יחסית, קלה וזולה. השיטה יכולה לשמש לחשיפת המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרות הגרורות ולבדיקת תרופות. בדיקה אופטימלית לניתוח דגימות גידול אנושיות יכולה להיות שיטה קלינית לטיפול מותאם אישית בסרטן.

בדיקת CAM-Delam לציון תכונות גרורתיות על ידי כימות דלמינציה ויכולת פלישה של תאים סרטניים

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

השיטה מדמיינת ומכמתת את יכולתם של תאים סרטניים לדה-אמין ולפלוש, ובכך להיות מסוגלת להעריך את האגרסיביות הגרורתית שלהם לפני היווצרות הפעולה או גרורות. שהניקוד מבוסס על תהליך ההפחתה כתנאי מוקדם להיווצרות גרורות, ובכך משיג מידע על האגרסיביות הגרורתית של התאים בצורה מהירה יחסית, קלה וזולה. תרגלו תחילה את הצעדים האינדיבידואליים השונים לפני תחילת הניסוי עצמו.מבחן CAM-Delam כולל מספר שלבים טכניים שקשה להסבירם בכתב והרבה יותר קל להעריך וללמוד על ידי הדגמה חזותית. כדי להתחיל להניח את מספר הביצים הרצוי במגשי ביצים ולדגום את ביצי האפרוחים אופקית באינקובטור ביצים. לאחר מכן מעקרים 30 סירות שקילה ו -30 קופסאות פלסטיק קטנות עם כובעים שקופים על ידי ריסוס 70% אתנול.לאחר מכן, יש לייבש את סירות השקילה והקופסאות במכסה מנוע למינרי למשך הלילה ולאחסן בקופסת פלסטיק סגורה עד לשימוש נוסף ביום הדגירה השלישי. לעקר שני ליטרים של מים מזוקקים או שעברו דה-יוניזציה לכל 30 ביצים דגירה, שני זוגות מספריים ושלושה זוגות מלקחיים. ראשית, מוסיפים כ-50 מיליליטרים של מים מעוקרים לקופסאות הפלסטיק המעוקרות וסוגרים את המכסים.ביום הדגירה השלישי, לפצח את קליפת הביצה באמצעות החלק החד של המספריים ולחתוך פתח ישר בקליפה. לאחר פתיחת קליפת הביצה באופן ידני מעל סירת שקילה, אספו את חלבון הביצה, החלמון, והוא מחובר לעובר בריא בסירת השקילה. לאחר מכן חפשו עובר שלם עם לב פועם, חלמון שלם וכלי דם מפותחים לניסוי.לאחר מכן, מעבירים בעדינות את סירת השקילה לתא לח פנימי ומדגרים את החדר הלח הפנימי באינקובטור הביצים. כדי להכין טבעות סיליקון, חותכים צינור סיליקון בקוטר פנימי וחיצוני של ארבעה מילימטרים וחמישה מילימטרים בהתאמה בעובי של כמילימטר אחד, רצוי באמצעות חותך נייר. לאחר מכן העבירו את טבעות הסיליקון לבקבוקי זכוכית קטנים.מכסים אותם בנייר כסף מתכת ומעקרים באמצעות אוטוקלאב או דומה. אחסנו את טבעות הסיליקון הסטריליות בטמפרטורת החדר. תרבית את קווי העניין של התאים הסרטניים במדיום התרבית הרלוונטי בתרבית התאים.לאחר מכן להכין מיליליטר אחד של תערובת RPMI קולגן ולשמור אותו על הקרח. לאחר מכן, נסה את התאים הסרטניים לבודד את התאים על ידי הסרת מדיום תרביות התאים תחילה ושטיפתם. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיליליטרים של תמיסת טריפסין לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ ומדגרים במשך שתיים עד שלוש דקות בחממת תרביות תאים עד שהתאים מתנתקים.באמצעות מיקרוסקופ הפוך שולחני, ראו את התאים המנותקים. לאחר מכן השביתו את הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של מדיום RPMI שלם לכל צלחת תרבית תאים ואספו את תרחיף התאים מכל מנות תרביות התאים לצינור של 50 מיליליטר. כדי לספור את התאים הסרטניים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תרחיף התא ל-10 מיקרוליטרים של כתם כחול טריפאן של 0.4%.לאחר ערבוב הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים, טענו 10 מיקרוליטרים של תערובת התאים לכל תא לתוך שקופית הדגימה במונה התא. לאחר מכן, צנטריפוגה תרחיף תרבית תאים בנפח הנכון בצינור 50 מיליליטר ב-500 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, ערבבו את גלולת התא עם מיליליטר אחד של תערובת הקולגן RPMI.לאחר שהתאים מעורבבים עם פיפטה של מיליליטר אחד, שמרו על תרחיף התא המוכן על הקרח. ביום הדגירה 10, מוציאים את התאים הלחים הפנימיים עם הביצים נטולות הקליפות המדגרות מהאינקובטור. לאחר פתיחת התא הלח הפנימי, הניחו עד שש טבעות סיליקון על ה-CAM באמצעות מלקחיים מעוקרים.לאחר שהתרחיף של התא הסרטני מעורבב על ידי צנרת כדי לקבל חלוקה שווה של תאים סרטניים, הוסף 20 מיקרוליטרים של תרחיף התא הסרטני המוכן בתוך טבעת סיליקון. לאחר סגירת החדר הלח הפנימי, לשים אותו בחממת הביצים. לאחר 14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימים של דגירה, מוציאים כשבעה תאים פנימיים לחים תוך פתיחת המכסים בזה אחר זה.בעזרת זוג מספריים, נתחו את התאים הסרטניים בתרבית המחוברים ל-CAM על ידי חיתוך מחוץ לטבעת הסיליקון. לאחר מכן העבירו מיד את דגימת CAM-Delam המבודדת באמצעות מלקחיים ל-4% פרפורמלדהיד ב-0.1 חיץ פוספט טוחן בצלחת פטרי לקיבוע הרקמה ולשמור על קרח או בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, הסר את תמיסת 4% paraformaldehyde והוסף 30% סוכרוז ב- 0.1 חיץ פוספט טוחן לדגימות CAM-Delam ושיווי משקל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את טבעת הסיליקון באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, חתכו את דגימת CAM-Delam בצורה מלבנית עם התאים הסרטניים באמצע באמצעות זוג מספריים. לאחר מכן העבר את דגימות ה- CAM-Delam למדיום חתך קפוא בצלחת פטרי כדי להסיר עודף סוכרוז ולאחר מכן להטמעת תבניות במדיום חתך קפוא עם זוג מלקחיים.תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את דגימת CAM-Delam בצורת U בתגובה אנכית בתבניות ההטבעה באמצעות כל מכשיר דמוי מחט ואחסן את דגימות CAM-Delam ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן חתכו את דגימות ה-CAM-Delam הקפואות ב-10 מיקרומטרים בחמש עד שש שקופיות רצופות באמצעות cryosectioning. ראשית, צרו קו עם סמן הידרופובי על השקופיות שבהן מסתיימים החלקים ותנו להם להתייבש במשך כמה דקות.לאחר מכן מניחים את המגלשות בתא לח ומכסה את החלקים בכ-200 עד 500 מיקרוליטרים של תמיסת חסימה ודגירה למשך 15 עד 30 דקות. לאחר ששפכו את התמיסה החוסמת, החליפו אותה ב-100 עד 150 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי בעל העניין המדולל בתמיסה החוסמת והדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. באופן דומה, לאחר שמזגנו את תמיסת הנוגדנים העיקרית, העבירו את המגלשות לקובטות הזכוכית ושטפו לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת ב-TBST.לאחר מכן, הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה וכסה את המגלשה ב-100 עד 150 מיקרוליטרים של נוגדן פלואורסצנטי משני מתאים המדולל בתמיסת חסימה בשילוב עם DAPI. דגירה של המגלשה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שמזגנו את תמיסת הנוגדנים המשנית, העבירו את המגלשות לקובטות הזכוכית ושטפו לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת ב-TBST.לאחר מכן הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה. לאחר מכן, הרכיבו את המגלשות על ידי הצבת טיפות אחת עד שתיים של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על המגלשה והניחו בעדינות החלקת כיסוי זכוכית תוך הימנעות מבועות אוויר. צלמו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית, רצוי בהגדלה של פי 10 וניתחו את הקטעים באמצעות קטגוריות הניקוד הבאות של CAM-Delam כמתואר בכתב היד.השימוש בתאי לחות פנימיים שיפר משמעותית את שיעור ההישרדות של עוברי האפרוחים מפחות מ-50% עד 90% ביום הדגירה 10 וכ-15% עד 80% ביום הדגירה ה-13. התוצאות מראות כי ניתן להבקיע את יכולתם של תאים סרטניים לפרק את הלמינה הבסיסית ולפלוש למזנכים לארבע קטגוריות, כולל למינה בסיסית שלמה ללא שינויים נראים לעין, למינה בסיסית שונה אך לא פגומה, למינה בסיסית פגומה ללא פלישת תאים, ולמינה בסיסית פגומה עם פלישה לתאים. צביעת נוגדנים כנגד הגורם של פון וילברנד מראה כי ה-CAM היה מעובה גם עם עלייה בהיווצרות כלי הדם כאשר תאים סרטניים גרמו ללמינה בסיסית שונה או פגומה.עם זאת, אף אחד משני הפנוטיפים הללו לא נצפה כאשר ה-CAM היה שלם. תאי PC-3U גרמו ללמינין פגום לאחר 1.5 ימים עם פלישה ברורה לאחר 2.5 ימים. לעומת זאת, תאי U251 גרמו לשינויים קלים של למינין רק לאחר 1.5 עד 3.5 ימים, אך מעולם לא גרמו לנזק נראה לעין ללאמינין.לאחר טיפול בקובלט כלוריד, תאים סרטניים לא גרורתיים U251 רכשו את היכולת לגרום לדליה ותאים פולשניים, אשר דוכאו בשילוב עם מעכב MMP, GM6001. לא לפגוע ב- CAM עם קצה הפיפטה בעת זריעת התאים הסרטניים מכיוון שנזק כזה של הממברנה יהרוס את הקריאות של הבדיקה. אפשרות עתידית היא לייעל את שיטת CAM-Delam כדי לקבוע תכונות גרורתיות בדגימות גידול קליניות, אשר עשויות להשלים בעתיד את ההיערכות של גרורות צומת הגידול המשמשות כיום.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...