Name: cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells
Uploaded: 2022-06-02T14:40:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

Мы благодарим следующих исследователей из Университета Умео за их помощь с соответствующими линиями раковых клеток и антителами: Л. Карлссон (антитело к фактору фон Виллебранда), Й. Гилторп (U251) и М. Ландстрём (PC-3U). Мы также благодарим Хауке Холтузена в лаборатории Гилторпа за создание стабильной клеточной линии HEK293-TLR-AAVS1. Работа в лаборатории Gunhaga была поддержана Шведским онкологическим фондом (18 0463), биотехнологическим инкубатором Умео, Norrlands Cancerforskningsfond, Шведским исследовательским советом (2017-01430) и медицинским факультетом Университета Умео.

<ol>
	<li>Vasantharajan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+landscape+of+circulating+tumour+cells.">The epigenetic landscape of circulating tumour cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li><li>Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+matrix+metalloproteinases:+their+functions+and+regulations.">Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations.</a> Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).</li><li>Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM+and+ADAMTS+family+proteins+and+their+role+in+the+colorectal+cancer+etiopathogenesis.">ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis.</a> BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).</li><li>Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+alternative+model+for+cancer+studies.">Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies.</a> Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).</li><li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+spread+and+micrometastasis+development:+quantitative+approaches+for+in+vivo+models.">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAM-Delam:+an+in+vivo+approach+to+visualize+and+quantify+the+delamination+and+invasion+capacity+of+human+cancer+cells.">CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).</li><li>Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+von+Willebrand+factor.">Zebrafish von Willebrand factor.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).</li><li>Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+egg+chorioallantoic+membrane+(CAM)+model+as+an+in+vivo+method+for+the+investigation+of+the+invasion+and+metastasis+cascade+of+malignant+tumor+cells.">The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+endostatin+endostar+inhibits+tumor+growth+and+metastasis+in+a+mouse+xenograft+model+of+colon+cancer.">Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer.</a> Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+inhibition+of+presenilin+2+inhibits+glioma+cell+growth+and+invasion+and+is+involved+in+the+regulation+of+Nrg1/ErbB+signaling.">RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling.</a> Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).</li><li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+superfamily+15+promotes+lymphatic+metastasis+via+upregulation+of+vascular+endothelial+growth+factor-C+in+a+mouse+model+of+lung+cancer.">Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer.</a> Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells.">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li><li>Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCzeta+facilitates+lymphatic+metastatic+spread+of+prostate+cancer+cells+in+a+mice+xenograft+model.">PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model.</a> Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Jung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenograft+models+for+preclinical+assessment+of+anticancer+drug+development.">Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development.</a> Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+EZH2+mediates+tumor+progression+on+the+chick+chorioallantoic+membrane+assay,+a+novel+model+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li><li>Steinmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPK1+loss+triggers+tumor+invasion+in+colorectal+tumor+cells.">DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (12), 895 (2019).</li><li>Andrieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP14+is+required+for+delamination+of+chick+neural+crest+cells+independently+of+its+catalytic+activity.">MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity.</a> Development. 147 (7), (2020).</li><li>Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+apoptosis+during+the+formation+of+the+terminal+nerve+ganglion+by+olfactory+placode-derived+cells+with+distinct+molecular+markers.">Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers.</a> Differentiation. 110, 8-16 (2019).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Pineros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+TNM:+a+registry+tool+to+reduce+gaps+in+cancer+staging+information.">Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information.</a> The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).</li><li>Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+response+in+organoids+generated+from+frozen+primary+tumor+tissues.">Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues.</a> Scientific Reports. 6, 18889 (2016).</li></ol>

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

В этой статье описывается анализ CAM-Delam для оценки метастатической агрессивности раковых клеток, определяемой путем оценки базальных ламинных модуляций и потенциальной инвазии клеток в мезенхиму в течение периода от нескольких часов до нескольких дней. Предыдущей технической проблемой для различных анализов CAM была низкая выживаемость эмбрионов цыплят. Этот вопрос был решен путем введения использования внутренней увлажненной камеры во время инкубации эмбриона, что увеличило выживаемость эмбриона с 10%-50% до 80%-90%7. Поэтому использование внутренней увлажненной камеры может быть полезным в CAM-анализах в целом, а также в других экспериментах ex ovo chick.
Представленные точки времени подсчета очков через 14 ч, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня после посева 1 х 106 раковых клеток на КАМ основаны на строгой разработке метода с использованием шести различных линий раковых клеток и достаточны для того, чтобы отличить диапазон от нерасширяющихся до расслоивающихся с инвазией способностей раковых клеточных линий. Предлагается минимальное использование четырех яиц с тремя кольцами в каждой точке времени и на клеточную линию, и это должно быть повторено по крайней мере один раз или в соответствии с экспериментальными проектами и статистическими требованиями. Одним из преимуществ анализа CAM-Delam является получение информативных результатов относительно расслояющей способности раковых клеток в течение нескольких дней для оценки агрессивности раковых клеток и потенциального риска образования метастазов. Быстрой доставке результатов способствует мониторинг деградации базальной пластинки из-за вторжения раковых клеток и последующих микроопухол /опухолевых почек и метастазов в органы. Традиционно модели CAM использовались для анализа образования метастазов в органах, что занимает около 2 недель, чтобы определить9. Используя семь различных линий раковых клеток, мы ранее подтвердили7, что оценка расслоения связана со способностью раковых клеток образовывать метастазы в моделях грызунов 10,11,12,13,14, что подтверждает прогностическую ценность анализа CAM-Delam. Более того, мышиные модели требуют еще более длительного времени, от нескольких недель до месяцев, прежде чем метастазы могут быть исследованы15,16. Короче говоря, этот разработанный анализ CAM-Delam, ориентированный на оценку способности к расслоению, а не на изучение более позднего образования опухоли у эмбриона цыпленка, является, таким образом, хорошим дополнением к существующим моделям кумовской кам-инвазии и опухоли мыши.
Ограничением в анализе CAM-Delam может быть неясная визуализация базальной пластинки, если сами раковые клетки экспрессируют ламинин. Если это так, то можно использовать другие маркеры, указывающие на базальную пластинку, такие как E-кадгерин7. Другие исследования инвазии CAM использовали коллаген IV типа для визуализации CAM и пан-цитокератина и виментина для идентификации вторгающихся раковых клеток и образования микроопухол / опухолевых почек17,18.
Расслоение является нормальным клеточным процессом, как во время развития, так и в более позднем возрасте, что позволяет клеткам покидать эпителий и мигрировать в другие ткани. Примерами расслоения клеток во время развития являются нервный гребень и обонятельные новаторские нейроны19,20; в более позднем возрасте заживление ран зависит от расслоения21. Во время рака этот процесс регулируется в неправильных клетках и / или в неправильное время. Таким образом, метод CAM-Delam может быть полезен для разгадки молекулярных механизмов, регулирующих расслоение, что будет иметь важное значение как для базовых биологических знаний, так и для знаний о болезнях. Такие исследования расслоения будут включать добавление факторов, представляющих интерес для раковых клеток, посеянных на CAM, или изучение генетически модифицированных раковых клеток. Одним из примеров, представленных здесь, является предварительная обработкаCoCl2 неметастатической клеточной линии U251 для индуцирования гипоксии, что приводит к индукции метастатической агрессивной способности, которая может быть подавлена ингибитором MMP широкого спектра действия. Таким образом, нахождение ключевых молекул, контролирующих расслоение, увеличивает возможность разработки ингибиторов для подавления этого процесса. В связи с этим еще одно потенциальное применение протокола CAM-Delam заключается в скрининге лекарств для подавления расслоения и клеточной инвазии. Кроме того, в клинике оценка тяжести рака является критически важным компонентом для диагностики, планирования лечения и ухода. В настоящее время действует система стадий TNM (Т, размер опухоли; N, узел – распространился ли рак на лимфатические узлы; M, отдаленные метастазы) используется для оценки тяжести рака22. Анализ CAM-Delam определяет инновационный подход к оценке агрессивности раковых клеток и потенциального риска образования метастазов и может быть полезным дополнением к системе стадии TNM. Примечательно, что стадия TNM основана на анализе образцов фиксированных тканей, тогда как потенциальный клинический подход CAM-Delam будет исследовать свежую или свежезамороженную ткань в сочетании с методами восстановления замороженных клеток23.

Примерно 90% смертности у больных раком вызвано последствиями метастазирования рака, которое представляет собой образование вторичных опухолей в других частях тела, откуда рак изначально возник1. Поэтому важно выявить механизмы, связанные с метастазами, чтобы найти потенциальные мишени для подавления образования метастазов опухоли. Впоследствии возникает потребность в модельных системах, в которых можно оценить метастатический процесс. 
Во время метастазирования раковые клетки подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМТ), нормальному клеточному процессу, в котором эпителиальные клетки теряют свои свойства адгезии и полярности и вместо этого приобретают инвазивный мезенхимальный характер2. Расслоение является частью процесса ЭМТ и включает деградацию ламинина в базальной мембране, что является предпосылкой для того, чтобы раковые клетки покинули первичную опухоль и вторглись в другие ткани. Основными факторами, которые регулируются при образовании метастазов, являются матричные металлопротеиназы (MMP), ADAM (дезинтергин и металлопротеиназа), ADAMTS (ADAM с тромбоспондиновыми мотивами) и MMP мембранного типа (MT-MMP)3,4. Эти факторы разрушают молекулы, такие как ламинин, который экспрессируется во всех базальных мембранах, чтобы облегчить миграцию и инвазию клеток.
Хориоаллантоическая мембрана (CAM) оплодотворенной яйцеклетки цыпленка является типом базальной мембраны. Оплодотворенные яйца цыплят были использованы в качестве метастатических моделей, в которых раковые клетки были посеяны на внеэмбриональный CAM и более позднее образование метастазов, наблюдаемое в эмбрионах цыплят5. Кроме того, часто используются мышиные метастатические модели in vivo , в которых раковые клетки имплантируются мышам и анализируются метастазы в различных органах6. Такой подход отнимает много времени, дорог и может вызвать дискомфорт у животных. Чтобы решить эту проблему, мы разработали анализ CAM-Delam, более быструю и дешевую модель для оценки метастатической агрессивности раковых клеток. В этой модели способность раковых клеток разлагать CAM цыпленка (например, способность к расслоению) сочетается с потенциальной инвазией раковых клеток в мезенхиму и используется в качестве измерения метастатической агрессивности. 
Настоящая статья, основанная на предыдущей публикации7, подробно описывает анализ CAM-Delam, от обработки оплодотворенных яйцеклеток цыплят, культуры раковых клеток и посева, вскрытия и анализа образцов CAM до оценки расслояющей способности раковых клеток на четыре категории: неповрежденные, измененные, поврежденные и инвазия. Мы также приводим примеры того, как этот анализ может быть использован для определения молекулярных механизмов, регулирующих процесс расслоения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>HM 505 E, Microm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon DS-Ri1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica M10</td>
			<td></td>
			<td>For CAM-sample dissection and positioning in molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td>Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse, E800</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8600 Series</td>
			<td>Model 817CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (small)</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>Must be sterilized before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Laminin-111</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Primary anti-rabbit antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Secondary antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0226</td>
			<td>Primary antibody (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Cobalt(II) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>232696-5G</td>
			<td>CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs</td>
			<td>Str&#246;mb&#228;cks &#196;gg, V&#228;nn&#228;s, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Any local egg supplyer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence mounting medium</td>
			<td>Allent Technologie</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass chambers for silicon rings</td>
			<td>Many sources are available</td>
			<td></td>
			<td>We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001 MMP Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides for immunohistochemistry</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEG-50 frozen medium</td>
			<td>Cellab</td>
			<td>6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Peel-A-Way Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>15 cm in diameter for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td>Esclain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen</td>
			<td>Cellsystems</td>
			<td>5074-35ML</td>
			<td>5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rings</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>228-1580</td>
			<td>Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologi</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing boats</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>611-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTIONS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-RPMI media mixture (1 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compelete RPMI Media 
			750 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>PureCol EZ Gel Collagen 
			250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Mix and use immediately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI Media 
			445 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>FBS 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin 
			5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PB (0.2 M; 1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4 (MW 141.76) 
			21.9 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>NaH2PO4 (MW 137.99) 
			6.4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add deionized water up to final volume of 1000ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store in RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Deionized water 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 M PB 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) 
			4g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>heat to 60 &#176;C in water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>add 5 M NaOH 
			25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Stir to dissolve the PFA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST (1 000 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50mM Tris pH 7,4 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>150mM NaCI 
			30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0,1% Triton X-100 
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>H2O (MQ) 
			900 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %; 10 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS 
			9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10x Trypsin (0.5 %) 
			1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>10 mL in total, Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cam-delam assay to score metastatic properties by quantifying delamination and invasion capacity of cancer cells

Основной причиной смертей, связанных с раком, является образование метастазов (то есть когда раковые клетки распространяются от первичной опухоли к отдаленным органам и образуют вторичные опухоли). Расслоение, определяемое как деградация базальной пластинки и базальной мембраны, является начальным процессом, который облегчает трансмиграцию и распространение раковых клеток в другие ткани и органы. Оценка расслояющей способности раковых клеток будет указывать на метастатический потенциал этих клеток.
Мы разработали стандартизированный метод, ex ovo CAM-Delam assay, для визуализации и количественной оценки способности раковых клеток расслаиваться и вторгаться, тем самым имея возможность оценивать метастатическую агрессивность. Вкратце, метод CAM-Delam включает посев раковых клеток в силиконовые кольца на хориоаллантоидной мембране цыпленка (CAM) на эмбриональный день 10 с последующей инкубацией от нескольких часов до нескольких дней. Анализ CAM-Delam включает использование внутренней увлажненной камеры во время инкубации эмбриона цыпленка. Этот новый подход увеличил выживаемость эмбрионов с 10%-50% до 80%-90%, что решило предыдущие технические проблемы с низкими показателями выживаемости эмбрионов в различных анализах CAM.
Затем образцы CAM с ассоциированными кластерами раковых клеток были выделены, зафиксированы и заморожены. Наконец, криостатные образцы были визуализированы и проанализированы на предмет повреждения базальной мембраны и инвазии раковых клеток с использованием иммуногистохимии. Оценивая различные известные метастатические и неметастатические линии раковых клеток, предназначенные для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), количественные результаты CAM-Delam показали, что паттерны расслоения отражают метастатическую агрессивность и могут быть оценены в четыре категории. Будущее использование этого анализа, помимо количественной оценки способности к расслоению как признака метастатической агрессивности, заключается в разгадке молекулярных механизмов, которые контролируют расслоение, инвазию, образование микрометастазов и изменения в микроокружении опухоли.

На рисунке 1 представлены ключевые этапы анализа CAM-Delam7. Использование внутренних увлажненных камер (Рисунок 1С) значительно улучшало выживаемость эмбрионов цыплят от <50% до 90% на 10-м инкубационном дне и от ~15% до 80% на 13-м инкубационном дне (Рисунок 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Ключевые этапы анализа CAM-Delam. (A) Инкубировать оплодотворенные куриные яйца горизонтально без ротации. (В,С) На 3-й день инкубации разбейте яйца и поместите их в стерильные весовые лодки (B), а лодки поместите во внутреннюю увлажненную камеру для дальнейшей инкубации (C). (D) Подготовьте силиконовые кольца. (E) На 10-й день инкубации поместите силиконовые кольца на CAM и посейте 1 x 106 раковых клеток внутри колец с помощью пипетки. (Ф,Г) В разные моменты времени (от часов до нескольких дней) рассекайте CAM с прикрепленными раковыми клетками, (F) фиксируйте в PFA, обрабатывайте сахарозой, позиционируйте в замороженной среде сечения (G) и замораживайте при -80 ° C. (H) Пример секционированного CAM с ассоциированными раковыми клетками GFP + (зеленый) и окрашиванием иммуногистохимии ламинина (красный). Шкала стержней = 2 мм (E,F), 1 мм (G) и 100 мкм (H). Эта цифра взята из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; PFA = параформальдегид; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Выживаемость куриного эмбриона по отношению к методу инкубации. (A,B) На 10-й день инкубации выживаемость куриного эмбриона во внутренних ГК удвоилась (среднее значение 89,33; N = 105) по сравнению с инкубацией в чашках Петри (А; среднее значение 40; N = 64) и неувлажненные камеры (B; среднее значение 48,67; N = 46). (С,Г) На 13-й день инкубации по-прежнему наблюдалась высокая выживаемость при использовании HC (среднее значение 81,67; N = 105), тогда как значительное снижение выживаемости эмбрионов было отмечено с помощью БП (C; среднее значение 11,33; N = 64) и N-HC (D; среднее значение 18,33; N = 46). Статистическая значимость проверялась с помощью непарного двуххвостого т-теста. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: HC = увлажненная камера; PD = чашки Петри; N-HC = неувлажненная камера; E X = Инкубационный день X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Анализы различных линий раковых клеток, экспрессирующих GFP (U251 глиобластома, простата PC-3U, толстая кишка SW620 и легкие A549), с использованием этого протокола были ранее сообщены Palaniappan et al.7. Результаты анализа CAM-Delam включают различия в морфологии базальной пластинки, обнаруженной ламинином, и инвазию раковых клеток, определяемую как клетки, которые пересекли слой базальной пластинки цыпленка в мезодермальный слой цыпленка (рисунок 3). Эти результаты показывают, что способность раковых клеток к деградации базальной пластинки и вторжению в мезенхиму может быть оценена в одну из четырех категорий: 1) интактная базальная пластинка без видимых изменений (рисунок 3B), 2) измененная, но неповрежденная базальная пластина (рисунок 3C), 3) поврежденная базальная пластина без клеточной инвазии (рисунок 3D) и 4) поврежденная базальная пластинка с клеточной инвазией (рисунок 3E). ). Другое наблюдение заключалось в том, что, когда раковые клетки вызывали измененную или поврежденную базальную пластинку, CAM также утолщался с увеличением образования кровеносных сосудов, определяемым окрашиванием антител против фактора фон Виллебранда, который синтезируется в кровеносных сосудах8 (рисунок 4C-H). Эти два фенотипа, утолщенный CAM и повышенное образование кровеносных сосудов, не наблюдались, когда CAM был неповрежден (рисунок 4A, B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig03.jpg"> Рисунок 3: Оценка CAM-Delam. (A-E) Пример оценки CAM-Delam, основанный на целостности базальной пластинки CAM, визуализированной антиламинином (красный), и потенциальной инвазии GFP-экспрессирующих раковых клеток (зеленый). (A) Контроль CAM без раковых клеток. (Б-Е) В ответах на раковые клетки можно оценить четыре категории, описывающие морфологию базальной пластинки: (B) интактный ламинин, (C) измененный, но неповрежденный ламинин (обозначенный звездочкой), (D) поврежденный ламинин, но без инвазии раковых клеток (стрелки), поврежденный ламинин с клеточной инвазией (наконечники стрел). Шкала стержня = 100 мкм (A-E). Эта цифра взята из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig04.jpg"> Рисунок 4: Оценка утолщения CAM и образования кровеносных сосудов. (А-Н) Пример визуализации утолщения CAM и образования кровеносных сосудов, обнаруженных анти-фактором Виллебранда (красный), в ответ на пластинку различных типов раковых клеток. (А,Б) Контроль CAM без раковых клеток. (С,Г) В ответ на неметастатическую линию раковых клеток (оцененную как Intact) не было обнаружено явного утолщения мезенхимы или увеличения образования кровеносных сосудов. (Э-Н) В ответ на метастатические раковые клетки, приводящие к изменению или повреждению ламинина, мезенхима утолщалась (об этом указывали двойные наконечники стрел) и наблюдалось увеличение образования кровеносных сосудов (обозначено стрелками). Шкала шкалы = 100 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Клетки рака предстательной железы U251 и PC-3U являются двумя примерами линий раковых клеток с совершенно разными расслоенными способностями (рисунок 5). Клетки PC-3U индуцировали поврежденный ламинин через 1,5 дня, с явной инвазией через 2,5 дня (рисунок 5A). Напротив, клетки U251 индуцировали незначительные изменения ламинина только через 1,5-3,5 дня, но никогда не вызывали видимого повреждения ламинина (рисунок 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig05.jpg"> Рисунок 5: Визуализация расслояющей способности раковых клеток предстательной железы (PC-3U) и глиобластомы (U251). (A) клетки PC-3U индуцировали незначительное изменение ламинина через 14 ч, повреждение ламинина через 1,5 дня (стрелка) и начало инвазии через 2,5 дня, которая была увеличена через 3,5 дня (наконечники стрел). (B) Клетки U251 вызывали незначительное изменение ламинина через 1,5-3,5 дня. На правых панелях показаны графики, представляющие оценку CAM-Delam. Ось Y указывает количество выборок, а ось X указывает временные точки культуры. Шкала = 100 мкм (A,B). Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Анализ CAM-Delam может быть использован для определения молекулярных механизмов, которые регулируют процесс расслоения. Одним из примеров является использование лечения CoCl2 для индуцирования гипоксии с или без комбинации ингибирующих матриксных металлопротеиназ (MMP) с использованием широкого ингибитора MMP GM6001 (рисунок 6). После лечения CoCl2 неметастатические раковые клетки U251 приобрели способность индуцировать расслоение и инвазивные клетки, которая подавлялась, когда лечение CoCl2 сочетали с ингибитором MMP GM6001 (рисунок 6). Таким образом, анализ CAM-Delam может быть полезен при определении молекул и молекулярных путей, которые влияют на процесс расслоения.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64025/64025fig06.jpg"> Рисунок 6: Паттерны расслоения в ответ на клетки U251, подвергшиеся воздействию CoCl2 отдельно или вместе с ингибитором MMP. (А-С) Клетки U251 культивируют в течение 3,5 дней на CAM в различных условиях. (А) Клетки U251, культивируемые в одиночку, не вызывали никакого повреждения ламинина. (B) Культивируемые клетки U251, предварительно подвергшиеся воздействию CoCl2 (24 ч) перед промывкой и посевом клеток на CAM-индуцированное повреждение ламинина и клеточную инвазию. (C) Предварительная обработка ингибитором MMP широкого спектра действия GM6001 (в течение 1 ч) с последующим воздействиемCoCl2 (24 ч) перед промывкой и посевом клеток U251 на CAM подавляла эффект леченияCoCl2, и не было обнаружено явного повреждения ламинина или инвазии раковых клеток. Шкала шкалы = 100 мкм (A-C). Панели (B) и (C) взяты из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок; CoCl2 = хлорид кобальта; MMP = матричная металлопротеиназа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64025/64025fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells at JoVE.com

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Анализ CAM-Delam для оценки метастатической способности раковых клеток относительно быстрый, простой и дешевый. Метод может быть использован для разгадки молекулярных механизмов, регулирующих образование метастазов, и для скрининга лекарственных средств. Оптимизированный анализ для анализа образцов опухолей человека может быть клиническим методом персонализированного лечения рака.

Анализ CAM-Delam для оценки метастатических свойств путем количественной оценки расслоения и инвазионной способности раковых клеток

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Метод визуализирует и количественно оценивает способность раковых клеток расслаиваться и вторгаться, тем самым имея возможность оценить их метастатическую агрессивность до образования действия или метастазирования. Что оценка основана на процессе расслоения как предпосылке для образования метастазов, тем самым получая информацию о метастатической агрессивности клеток относительно быстрым, легким и дешевым способом. Сначала потренируйтесь с различными индивидуальными шагами, прежде чем начинать фактический эксперимент.Анализ CAM-Delam включает в себя несколько технических шагов, которые трудно объяснить в письменной форме и гораздо легче оценить и изучить с помощью визуальной демонстрации. Для начала поместите нужное количество яиц в лотки для яиц и высиживайте яйца цыплят горизонтально в инкубаторе для яиц. Затем стерилизуйте 30 весовых лодок и 30 небольших пластиковых коробок с прозрачными колпачками, распыляя 70% этанола.Затем высушите весовые лодки и коробки в ламинарной вытяжке на ночь и храните в закрытой пластиковой коробке до дальнейшего использования на третий день инкубации. Стерилизуйте два литра дистиллированной или деионизированной воды на 30 инкубированных яиц, две пары ножниц и три пары щипцов. Сначала добавьте примерно 50 миллилитров стерилизованной воды в стерилизованные пластиковые коробки и закройте крышки.На третий день инкубации разбейте яичную скорлупу острой частью ножниц и вырежьте прямое отверстие в скорлупе. Открыв яичную скорлупу вручную над весовой лодкой, соберите яичный белок, желток, и к нему прикрепят здоровый эмбрион в весовую лодку. Затем ищите неповрежденный эмбрион с бьющимся сердцем, неповрежденным желтком и развитыми кровеносными сосудами для эксперимента.Затем аккуратно перенесите весовую лодку во внутреннюю увлажненную камеру и инкубируйте внутреннюю увлажненную камеру в инкубаторе яиц. Для приготовления силиконовых колец вырежьте силиконовую трубку с внутренним и внешним диаметром четыре миллиметра и пять миллиметров соответственно толщиной примерно в один миллиметр, предпочтительно с помощью бумагореза. Затем переложите силиконовые кольца на небольшие стеклянные бутылки.Накройте их металлической фольгой и стерилизуйте с помощью автоклава или аналогичного. Храните стерильные силиконовые кольца при комнатной температуре. Культивируйте интересующие линии раковых клеток в соответствующей культуральной среде в клеточной культуре.Затем приготовьте один миллилитр коллагена RPMI mix и держите его на льду. Затем попробуйте раковые клетки, чтобы изолировать клетки, сначала удалив питательную среду клеток и промыв. Затем добавляют три миллилитра раствора трипсина на чашку для культивирования клеток диаметром 15 сантиметров и инкубируют в течение двух-трех минут в инкубаторе клеточной культуры до тех пор, пока клетки не отсоединятся.С помощью настольного инвертированного микроскопа можно увидеть отсоединенные клетки. Затем инактивируют трипсин, добавляя пять миллилитров полной среды RPMI в каждую чашку для клеточной культуры и собирают клеточную суспензию из всех тарелок для клеточных культур в 50-миллилитровую трубку. Чтобы подсчитать раковые клетки, добавьте 10 микролитров клеточной суспензии к 10 микролитрам 0,4% трипан синего пятна.После смешивания образца путем пипетирования вверх и вниз несколько раз загрузите 10 микролитров клеточной смеси на камеру в слайд образца в счетчике ячеек. Затем центрифугируйте правильную объемную суспензию клеточной культуры в 50-миллилитровой трубке в 500 раз G в течение пяти минут. После выброса супернатанта смешайте клеточную гранулу с одним миллилитром коллагеновой смеси RPMI.После того, как клетки смешиваются с пипеткой в один миллилитр, держите подготовленную клеточную суспензию на льду. На 10-й день инкубации выньте из инкубатора внутренние увлажненные камеры с инкубированными яйцами без скорлупы. После открытия внутренней увлажненной камеры поместите до шести силиконовых колец на CAM с помощью стерилизованных щипцов.После того, как суспензия раковых клеток смешана путем пипетирования, чтобы получить равномерное распределение раковых клеток, добавьте 20 микролитров подготовленной суспензии раковых клеток внутри силиконового кольца. Закрыв внутреннюю увлажненную камеру, поместите ее в инкубатор для яиц. Через 14 часов, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня инкубации выньте примерно семь внутренних увлажненных камер, открывая их крышки по одной.С помощью ножниц рассекните культивируемые раковые клетки, прикрепленные к CAM, разрезав за пределами силиконового кольца. Затем немедленно перенесите изолированный образец CAM-Delam с помощью щипцов на 4%-ный параформальдегид в 0,1-молярный фосфатный буфер в чашку Петри для фиксации ткани и держите на льду или при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Затем удалите 4% раствор параформальдегида и добавьте 30% сахарозы в 0,1 молярный фосфатный буфер в образцы CAM-Delam и уравновесьте при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.Под рассеченным микроскопом аккуратно снимите силиконовое кольцо с помощью щипцов. Затем вырежьте образец CAM-Delam в прямоугольной форме с раковыми клетками посередине с помощью ножниц. Затем переложите образцы CAM-Delam в замороженную среду в чашке Петри, чтобы удалить избыток сахарозы, а затем во встраиваемые формы в замороженную среду с парой щипцов.Под рассеченным микроскопом поместите образец CAM-Delam в U-образной форме в вертикальной реакции во встраиваемых формах с помощью любого игольчатого инструмента и храните образцы CAM-Delam при 80 градусах Цельсия. Затем разделите замороженные образцы CAM-Delam на 10 микрометров на пяти-шести последовательных слайдах с помощью криосекции. Сначала сделайте линию гидрофобным маркером на горках, где заканчиваются участки, и дайте им высохнуть в течение нескольких минут.Затем поместите слайды в увлажненную камеру и накройте секции примерно 200-500 микролитрами блокирующего раствора и инкубируйте в течение 15-30 минут. После выливания блокирующего раствора замените его 100-150 микролитрами первичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Аналогично, после выливания раствора первичного антитела перенесите слайды в стеклянные кюветы и промывайте не менее трех раз в течение пяти минут каждый в TBST.Затем удалите избыток TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области мягкой бумажной салфеткой и накройте слайд 100-150 микролитрами подходящего вторичного флуоресцентного антитела, разбавленного в блокирующем растворе в сочетании с DAPI. Высиживать горку в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. После выливания раствора вторичных антител переложите слайды на стеклянные кюветы и промывайте не менее трех раз в течение пяти минут каждый в TBST.Затем удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области мягкой бумажной салфеткой. Затем установите слайды, положив одну-две капли флуоресцентной монтажной среды на слайд, и осторожно поместите стеклянную крышку, избегая пузырьков воздуха. Сфотографируйте участки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, предпочтительно с увеличением 10 X, и проанализируйте участки, используя следующие категории оценки CAM-Delam, как описано в рукописи.Использование внутренних увлажненных камер значительно улучшило выживаемость эмбрионов цыплят с менее чем 50% до 90% на 10-й день инкубации и примерно с 15% до 80% на 13-й день инкубации. Результаты показывают, что способность раковых клеток разлагать базальную пластинку и вторгаться в мезенхиму может быть разделена на четыре категории, включая неповрежденную базальную пластинку без видимых изменений, измененную, но неповрежденную базальную пластинку, поврежденную базальную пластину без клеточной инвазии и поврежденную базальную пластинку с клеточной инвазией. Окрашивание антител против фактора фон Виллебранда показывает, что CAM также утолщался с увеличением образования кровеносных сосудов, когда раковые клетки вызывали измененную или поврежденную базальную пластинку.Однако ни один из этих двух фенотипов не наблюдался, когда CAM был неповрежден. Клетки PC-3U индуцировали поврежденный ламинин через 1,5 дня с прозрачной инвазией через 2,5 дня. Напротив, клетки U251 индуцировали незначительные изменения ламинина только через 1,5-3,5 дня, но никогда не вызывали видимого повреждения ламинина.После лечения хлоридом кобальта неметастатические раковые клетки U251 приобрели способность индуцировать расслоение и инвазивные клетки, которые подавлялись при сочетании с ингибитором MMP GM6001. Не повреждать КАМ кончиком пипетки при посеве раковых клеток, так как такое повреждение мембраны уничтожит показания анализа. Будущая возможность заключается в оптимизации метода CAM-Delam для определения метастатических свойств в клинических образцах опухолей, которые могут в будущем дополнить используемую сегодня стадию метастазирования опухолевого узла.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Оценка дифференциации потенциала мыши простаты эпителиальных клеток с использованием органоидной культуры

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...