Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

نحن نقر بتمويل ARO MURI W911NF-14-1-0403 إلى M.P.M. ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 1R01GM126256 إلى M.P.M. ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) U54 CA209992 ، و NIH RO1 GM126256 ، و NIH U54 CA209992 ، وجامعة ميشيغان / Genentech ، و SUBK00016255 و Human Frontiers Science Program (HFSP) رقم المنحة RGY0073/2018 إلى M.P.M. أي رأي أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر ARO أو NIH أو HFSP. وتقر س. س. بالمناقشات المثمرة مع ف. ياداف و س. موريسان و س. أميري.

1. إعداد المخازن المؤقتة ومحاليل البروتين
<ol><li>قم بإعداد المخزن المؤقت الداخلي المائي غير البلمرة (INP) بحجم إجمالي قدره 5 مل عن طريق خلط 0.1 mM CaCl 2 و 10 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 1 mM DTT و 0.5 mM Dabco و 320 mM sucrose و0.2 mM ATP.</li>
	<li>تحضير مزيج البروتين (PM) عن طريق إضافة البروتينات إلى مخزن INP الع...

تحدد العديد من الخطوات الرئيسية نجاح العائد العالي من الجسيمات الشحمية أثناء عملية التحضير. لإذابة فيلم الدهون تماما في الزيت ، يجب أن تكون العينة صوتية حتى يختفي فيلم الدهون في الجزء السفلي من القارورة الزجاجية تماما. بعد الصوتنة ، يجب تخزين خليط زيت الدهون بين عشية وضحاها في درجة حرارة ?...

يلعب الهيكل الخلوي للأكتين دورا أساسيا في بناء البنية داخل الخلايا للخلية من خلال تنسيق الانقباض على المستوى الجزيئي وتوليد القوة1،2،3. ونتيجة لذلك ، فإنه يتوسط العديد من الأنشطة الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تشوه الخلايا4,5 ، والانقسام6 ، والهجرة 7,8 ، والالتصاق9. اكتسبت إعادة تشكيل شبكات الأكتين في المختبر اهتماما هائلا في السنوات الأخيرة10،11،12،13،14،15،16،17. الهدف من إعادة التشكيل هو بناء نموذج الحد الأدنى من الخلية الخالية من التنظيم الكيميائي الحيوي المعقد الموجود داخل الخلايا الحية. وهذا يوفر بيئة يمكن التحكم فيها للتحقيق في أنشطة محددة داخل الخلايا ويسهل تحديد وتحليل المكونات المختلفة للهيكل الخلوي الأكتين18،19. علاوة على ذلك ، فإن تغليف شبكات الأكتين في المختبر داخل حويصلات أحادية الصفائح العملاقة الفوسفاتية (GUVs ، الجسيمات الشحمية) يوفر مساحة محصورة ولكنها قابلة للتشوه مع حدود شبه منفذة. إنه يحاكي البيئة الفسيولوجية والميكانيكية الدقيقة لآلات الأكتين داخل الخلية9،20،21،22.
من بين الطرق المختلفة لإعداد الجسيمات الشحمية ، تعد طريقة ترطيب فيلم الدهون (المعروفة أيضا باسم طريقة التورم) واحدة من أقدم التقنيات23. يرطب فيلم الدهون الجاف مع إضافة المخازن المؤقتة ، ويشكل فقاعات غشائية تصبح في النهاية حويصلات24. لإنتاج حويصلات أكبر ذات عائد أعلى ، تقوم طريقة محسنة تتقدم من طريقة ترطيب الفيلم ، والمعروفة باسم طريقة التكوين الكهربائي25 ، بتطبيق مجال كهربائي AC لتعزيز عملية الترطيب بكفاءة26. القيود الرئيسية لهذه الطرق القائمة على الترطيب لتغليف الأكتين هي أن لديها كفاءة تغليف منخفضة للبروتينات عالية التركيز ، وهي متوافقة فقط مع تركيبات دهنية محددة24. تقنية المستحلب المقلوب ، في المقابل ، لديها قيود أقل على مكونات الدهون وتركيزات البروتين20،27،28،29. في هذه الطريقة ، يضاف مزيج من البروتينات للتغليف إلى المخزن المؤقت المائي الداخلي ، والذي يتم استحلابه لاحقا في محلول زيت معدني يحتوي على الدهون ، مما يشكل قطرات أحادية الطبقة من الدهون. ثم تعبر قطرات الدهون أحادية الطبقة من خلال واجهة أخرى للدهون / الزيت والماء من خلال الطرد المركزي لتشكيل حويصلات دهنية ثنائية الطبقة (الجسيمات الشحمية). وقد أثبتت هذه التقنية أنها واحدة من أنجح الاستراتيجيات لتغليف الأكتين24,30. بشكل منفصل ، هناك بعض طرق أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك النفث النبضي31,32 ، وطرد الغشاء العابر 33 ، وطريقة cDICE 34. أوجه التشابه بين طريقة المستحلب المقلوب وطريقة الموائع الدقيقة هي مذيب الدهون (الزيت) المستخدم وإدخال واجهة الدهون / الزيت والماء لتشكيل النشرة الخارجية للجسيمات الشحمية. على النقيض من ذلك ، يتطلب توليد الجسيمات الشحمية بطريقة الموائع الدقيقة إعداد أجهزة الموائع الدقيقة ويرافقه زيت محبوس بين منشوري الطبقة الثنائية ، الأمر الذي يتطلب خطوة إضافية لإزالة الزيت35.
في هذه المخطوطة، استخدمنا تقنية المستحلب المقلوب لإعداد الجسيمات الشحمية التي تغلف شبكة F-actin المبلمرة كما كانت تستخدم سابقا22. تم وضع خليط البروتين للتغليف لأول مرة في مخزن مؤقت مع ظروف غير بلمرة للحفاظ على الأكتين في شكله الكروي (G). تم تنفيذ العملية برمتها عند 4 درجات مئوية لمنع بلمرة الأكتين المبكرة ، والتي تم تشغيلها لاحقا عن طريق السماح للعينة بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد الوصول إلى درجة حرارة الغرفة ، يتبلمر الأكتين في شكله الخيطي (F). يمكن إضافة مجموعة متنوعة من البروتينات المرتبطة بالأكتين إلى المحلول العازل المائي الداخلي لدراسة وظائف البروتين وخصائصه ، وبالتالي ، توفير المزيد من الأفكار حول تفاعله مع شبكة الأكتين وسطح الغشاء. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تغليف البروتينات المختلفة ذات الأهمية36 والأشياء الكبيرة (الجسيمات الدقيقة ، السباحين الدقيقين ذاتي الدفع ، إلخ) بالقرب من حجم الجسيمات الشحمية النهائية 28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

يتوسط الهيكل الخلوي للأكتين ، وهو الآلية الميكانيكية الرئيسية في الخلية ، العديد من الأنشطة الخلوية الفيزيائية الأساسية ، بما في ذلك تشوه الخلية والانقسام والهجرة والالتصاق. ومع ذلك ، فإن دراسة ديناميكيات وبنية شبكة الأكتين في الجسم الحي معقدة بسبب التنظيم الكيميائي الحيوي والجيني داخل الخلايا الحية. لبناء نموذج الحد الأدنى الخالي من التنظيم الكيميائي الحيوي داخل الخلايا ، يتم تغليف الأكتين داخل حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs ، وتسمى أيضا الجسيمات الشحمية). الجسيمات الشحمية المحاكاة الحيوية بحجم الخلية وتسهل نظرة كمية على الخصائص الميكانيكية والديناميكية لشبكة الهيكل الخلوي ، مما يفتح طريقا قابلا للتطبيق للبيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى. لتوليد الجسيمات الشحمية للتغليف ، يتم استخدام طريقة المستحلب المقلوب (يشار إليها أيضا باسم طريقة نقل المستحلب) ، والتي تعد واحدة من أنجح التقنيات لتغليف المحاليل المعقدة في الجسيمات الشحمية لإعداد أنظمة محاكاة الخلايا المختلفة. باستخدام هذه الطريقة ، يضاف مزيج من البروتينات ذات الأهمية إلى المخزن المؤقت الداخلي ، والذي يتم استحلابه لاحقا في محلول زيت معدني يحتوي على الدهون الفوسفاتية لتشكيل قطرات دهنية أحادية الطبقة. يتم إنشاء الجسيمات الشحمية المطلوبة من قطرات الدهون أحادية الطبقة التي تعبر واجهة الدهون / الزيت والماء. تمكن هذه الطريقة من تغليف بوليمرات الأكتين المركزة في الجسيمات الشحمية مع مكونات الدهون المطلوبة ، مما يمهد الطريق لإعادة تكوين شبكة الهيكل الخلوي التي تحاكي بيولوجيا في المختبر .

يتم توضيح إعداد الجسيمات الشحمية على أساس تقنية المستحلب المقلوب بيانيا وتخطيطيا في الشكل 1.
أولا ، تم إعداد الجسيمات الشحمية الفارغة (العارية) (قطرها ~ 5-50 ميكرومتر) التي كانت تتكون من الدهون الفوسفاتية (EPC) والدهون الفلورية (DHPE). تم تغليف صبغة فلورسنت ساطعة حم?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

في هذه المخطوطة، نوضح التقنيات التجريبية لتغليف الهيكل الخلوي F-actin في حويصلات دهنية عملاقة أحادية الصفيحة (وتسمى أيضا الجسيمات الشحمية)، وطريقة تشكيل طبقة F-actin تحاكي القشرة الحيوية في النشرة الداخلية للغشاء الشحمي.

في المختبر إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

يبني هذا الإجراء نموذجا أدنى للخلية الخالية من اللوائح الكيميائية الحيوية المعقدة. يمكن للتقنية المستخدمة توليد إنتاجية عالية من الجسيمات الشحمية ولها كفاءة تغليف عالية لبروتينات الهيكل الخلوي. يمكن تطبيق هذا الإجراء على تغليف مجموعة متنوعة من البروتينات والأشياء الكبيرة مثل الجسيمات الدقيقة والسباحين الصغار الذين يستعدون ذاتيا.يكافح الفرد لزيادة العائد الشحمي للمحاولات العديدة الأولى. يوصى بمناقشة قسم المخطوطة بانتظام لمزيد من التفاصيل لزيادة العائد. للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت الداخلي المائي غير البلمرة بحجم إجمالي قدره خمسة ملليلتر عن طريق خلط 0.1 ملليمولار CACL اثنين ، و 10 ملليمولار HEPES ، و DTT واحد مللي مولا ، و 0.5 ملليمول DAPCO ، و 320 مللي مولا سكروز ، و 0.2 ملليمولار ATP.تحضير مزيج البروتين عن طريق إضافة البروتينات إلى المخزن المؤقت الداخلي غير البلمرة عند أربع درجات مئوية. لتشكيل طبقة الأكتين ، أضف 100 نانومولار جيلكالين ، وأربعة سعال ميكرومولار ، و 2.2 ميكرومولار VCA HEZ إلى مزيج البروتين. كتجربة تحكم ، استبدل مزيج البروتين ب 100 ميكروغرام لكل صبغة فلورسنت ملليلتر.تحضير مخزن البلمرة الداخلي المائي في حجم إجمالي قدره خمسة ملليلترات عن طريق خلط 100 ملليمول كلوريد البوتاسيوم. أربعة ملليمولار كلوريد المغنيسيوم ، 10 ملليمولار هيبس ، واحد ملليمولار DTT ، 0.5 ملليمولار DABCO ، 10 ملليمولار ATP و 80 مللي مولا السكروز. قم بإعداد المخزن المؤقت النهائي عن طريق خلط المخزن المؤقت الداخلي غير البلمرة والمخزن المؤقت الداخلي للبلمرة بنسبة حجم واحد إلى واحد ، لإنتاج المحلول المائي الداخلي بحجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر سيتم تغليفه داخل الجسيمات الشحمية.تحضير المخزن الخارجي المائي في حجم إجمالي قدره 150 ميكرولتر عن طريق خلط 10 ملليمولار HEPES ، 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم ، اثنين من كلوريد المغنيسيوم ملليمولار ، 0.2 ملليمولار كلوريد الكالسيوم ، اثنين من ملليمولار ATP ، واحد ملليمولار DTT ، 0.5 ملليمولار DAPCO ، 212 ملليمولار الجلوكوز و 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر غلاف بيتا. لتحضير خليط زيت الدهون ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من 25 ملليغرام لكل ملليلتر EGGPC إلى قارورة زجاجية. تبخر الكلوروفورم بغاز الأرجون تاركا طبقة دهنية صلبة جافة في أسفل القارورة.لتشكيل طبقة أكتين ، أضف دهون النيكل بنسبة 10 إلى واحدة من EGGPC إلى دهون النيكل واخلطها ، قبل تبخر الكلوروفورم. أضف ملليلترين من الزيوت المعدنية. تبخر الكلوروفورم وسونيك خليط زيت الدهون في درجة حرارة الغرفة في الحمام لمدة ساعة واحدة ، لإعادة تعليق الدهون.قم بإعداد مخزن مؤقت نهائي في مستحلب الزيت لإعداد قطرات دهنية أحادية الطبقة تحتوي على البروتين محل الاهتمام. ابدأ بأخذ 100 ميكرولتر من خليط زيت الدهون في أنبوب بلاستيكي وأضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت النهائي إلى خليط زيت الدهون. تأكد من أن المخزن المؤقت النهائي في قطرة واحدة.باستخدام حقنة زجاجية ، اسحب كمية صغيرة من خليط زيت الدهون أولا ثم القطيرة العازلة النهائية عن طريق وضع طرف المحقنة في محيط القطيرة لتقسيمها إلى قطرات صغيرة. قم بالشفط بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات حتى يتم تشكيل مستحلب غائم. ضع 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخارجي في أنبوب بلاستيكي منفصل.ضع 30 ميكرولتر من خليط زيت الدهون فوق المخزن الخارجي واتركه لمدة 10 دقائق تقريبا لتطوير طبقة أحادية الدهون على الواجهة. لإعداد الجسيمات الشحمية ، أضف بعناية 50 ميكرولتر من مستحلب الزيت العازل النهائي ، إلى المرحلة العليا من الزيت في الأنبوب. الطرد المركزي للأنبوب البلاستيكي في 100 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.تغيير الوقت وسرعة الطرد المركزي ، لتحسين تكوين الجسيمات الشحمية. قم بإزالة مرحلة الزيت بعناية عن طريق ماصة تستنشق حجما إضافيا إذا لزم الأمر. تأكد من عدم وضع طرف الماصة على جانب الأنبوب لتجنب إنشاء غضروف مفصلي من الزيت فوق مرحلة الجسيمات الشحمية.باستخدام ماصة جديدة ، اقطع طرف الماصة. قم بلصق الماصة ببطء في المرحلة السفلية المتبقية وقم بشفط الحجم المائي لجمع الجسيمات الشحمية. صب 100 ميكرولتر من العازل الخارجي في بئر غرفة الحضانة.قم بإيداع الجسيمات الشحمية المجمعة بلطف في المخزن المؤقت الخارجي ثم ضع غطاء آخر أعلى الغرفة. راقب الجسيمات الشحمية باستخدام مجهر متحد البؤرة باستخدام هدف غمر الزيت 63 ×. استخدم خطوط الليزر 488 و 647 و 561 نانومتر.لمراقبة الدهون الموسومة بالفلورسنت ، صبغة الفلورسنت المغلفة والأكتين المغلف المسمى بالفلورسنت على التوالي. التقط الإطارات المثيرة للاهتمام واحفظ الصور بتنسيق TIF. معالجة وتحليل الصور في الصورة J.Start عن طريق فتح ملف TIF، وذلك باستخدام برنامج الصورة J.انتقل إلى الصورة، ثم انقر على ضبط. متبوعا بتباين السطوع، اضبط سطوع الصورة وتباينها على المقياس المطلوب عن طريق ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للإعدادات ومنزلقات السطوع والتباين. انقر على أداة تحديد المستطيل في شريط الأدوات وحدد المنطقة محل الاهتمام.انتقل إلى الصورة، ثم انقر على اقتصاص لاقتصاص عائد الاستثمار. انتقل إلى التحليل، ثم انقر على تعيين المقياس. في النافذة المنبثقة، أدخل 1.0 في حقل نسبة أبعاد البكسل واضبط الميكرومتر كوحدة طول.في حقل المسافة بالبكسل، أدخل عرض الصورة بالبكسل. في حقل المسافة المعروفة، أدخل عرض الصورة الحقيقي بالميكرون. لقياس حجم الجسيم الشحمي ، باستخدام أداة التحديد البيضاوي في شريط الأدوات ، ارسم دائرة على طول حافة الجسيم الشحمي.انتقل إلى التحليل ، ثم انقر فوق قياس ، لقياس مساحة الدائرة ، والتي يمكن من خلالها حساب قطر الجسيمات الشحمية. يتم التحقق من نجاح توليد الجسيمات الشحمية من خلال تصور الحلقة الدائرية الرقيقة التي هي الطبقة الثنائية من الدهون الفلورية الخضراء. تحت ليزر 488 نانومتر باستخدام المجهر البؤري لتأكيد تغليف صبغة الفلورسنت.يجب أن تكون البيئة الداخلية للجسيمات الشحمية فلورية بشكل موحد تحت ليزر 647 نانومتر. يمكن تصور تكوين الجسيمات الشحمية بواسطة الحلقات الدائرية الخضراء الرقيقة. التأثير المعاد تشكيله في الشبكات داخل الجسيمات الشحمية غير متجانس ، ويظهر على شكل هياكل شبكة متفرعة من خيوط الأكتين.تم تشغيل بنية الفرع من خلال إدخال ARP اثنين من ثلاثة مجمعات ، والتي تتحكم في وقت واحد في نواة وتفرع خيوط الأكتين ، جنبا إلى جنب مع VCA HEZ. يتم إنشاء طبقة أكتين رقيقة ، ولكن متفرعة بكثافة في النشرة الداخلية للطبقة الثنائية من الجسيمات الشحمية التي يمكن تصورها على أنها فلورسنت. يجب ضخ خليط المخزن المؤقت النهائي للصوت الدهني بشكل عام ذهابا وإيابا من خلال حقنة زجاجية ، لتجنب إدخال فقاعات الهواء.يجب أن يكون الخليط أبيض بعد العملية. مهدت هذه التقنية الطريق لبناء نموذج الحد الأدنى من الخلية ، خال من اللوائح الكيميائية الحيوية المعقدة. باستخدام نظام محاكاة الخلية هذا ، يمكن للباحثين استكشاف الخصائص الميكانيكية والديناميكية لبروتينات الهيكل الخلوي والنواة والمحرك الجزيئي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...