Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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我们感谢向美国国立卫生研究院（NIH）提供 ARO MURI W911NF-1-0403 至 M.P.M.、美国国立卫生研究院 （NIH） R01 1R01GM126256、美国国立卫生研究院 （NIH） U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、密歇根大学/基因工程学院、SUBK00016255 和人类前沿科学计划 （HFSP） 拨款编号 RGY0073/2018 至 M.P.M.本材料中表达的任何意见，发现，结论或建议均为作者的观点，并不一定反映ARO，NIH或HFSP的观点。S.C.承认与V.亚达夫，C.穆雷桑和S.阿米里进行了富有成效的讨论。

1. 缓冲液和蛋白质溶液的制备
<ol><li>通过混合0.1 mM氯化钙2，10 mM HEPES（pH 7.5），1mM DTT，0.5mM达布科，320mM蔗糖和0.2mM ATP，制备总体积为5mL的水性内部非聚合（INP）缓冲液。</li>
	<li>通过在4°C下向INP缓冲液中加入蛋白质来制备蛋白质混合物（PM），浓度如下：11.2μM非荧光G-肌动蛋白，2.8μM荧光标记肌动蛋白和0.24μM Arp2/3（材料表）。为了形成F-肌动蛋白层，向PM中加?...

几个关键步骤决定了在制备过程中高产量脂质体的成功。为了将脂质膜完全溶解在油中，必须对样品进行超声处理，直到玻璃瓶底部的脂质膜完全消失。超声处理后，脂质油混合物必须在室温下在黑暗条件下储存过夜，以使脂质分子进一步分散29。混合物可以在4°C下储存长达一周。当使用含有目标蛋白质的单层脂质液滴制备FB / 油乳液时，必须通过玻璃注射器轻轻地来回泵送脂?...

肌动蛋白细胞骨架通过协调分子水平的收缩性和力产生1，2，3在构建细胞的细胞内结构中起着重要作用。因此，它介导了许多基本的细胞活动，包括细胞变形4，5，分裂6，迁移7，8和粘附9。肌动蛋白网络的体外重建近年来获得了极大的关注10，11，12，13，14，15，16，17。重建的目标是建立一个细胞的最小模型，没有活细胞中存在的复杂生化调节。这为探测特定的细胞内活动提供了可控的环境，并有助于识别和分析肌动蛋白细胞骨架18，19的不同组分。此外，体外肌动蛋白网络在磷脂巨型单层囊泡（GUV，脂质体）内的包封提供了具有半渗透边界的受限但可变形的空间。它模仿细胞内肌动蛋白机制的生理和机械微环境9，20，21，22。
在制备脂质体的各种方法中，脂膜水合法（又称溶胀法）是最早的技术之一，23.干燥的脂质膜通过添加缓冲液进行水合，形成膜状气泡，最终变成囊泡24。为了产生具有较高产量的较大囊泡，从薄膜水合法推进的改进方法，称为电铸法25，施加交流电场以有效地促进水化过程26。这些基于水合的肌动蛋白包封方法的主要局限性在于它对高浓度蛋白质的包封效率低，并且仅与特定的脂质组合物24相容。相比之下，倒置乳液技术对脂质组分的限制较少，蛋白质浓度为20，27，28，29。在该方法中，将用于包封的蛋白质混合物加入到内部水缓冲液中，该缓冲液随后在含脂矿物油溶液中乳化，形成脂质单层液滴。然后，单层脂质液滴通过离心穿过另一个脂质/油水界面，形成双层脂质囊泡（脂质体）。该技术已被证明是肌动蛋白包封24，30的最成功的策略之一。另外，还有一些微流体装置方法，包括脉冲喷射31、32、瞬态膜喷射33和cDICE方法34。倒乳剂法与微流体法之间的相似之处在于所使用的脂质溶剂（油）和脂质/油 - 水界面的引入以形成脂质体的外小叶。相比之下，通过微流体方法产生脂质体需要设置微流体装置，并且伴随着在双层的两个小叶之间捕获的油，这需要额外的步骤来除油35。
在这份手稿中，我们使用倒置乳液技术制备包封聚合的F-肌动蛋白网络的脂质体，如之前22所示。首先将用于包封的蛋白质混合物置于具有非聚合条件的缓冲液中，以维持其球状（G）形式的肌动蛋白。整个过程在4°C下进行，以防止早期肌动蛋白聚合，随后通过允许样品升温至室温而触发。一旦在室温下，肌动蛋白聚合成其丝状（F）形式。可以将各种肌动蛋白结合蛋白添加到内部水缓冲液中以研究蛋白质的功能和性质，从而进一步深入了解其与肌动蛋白网络和膜表面的相互作用。该方法还可应用于包封感兴趣的各种蛋白质36和接近最终脂质体28，37大小的大型物体（微粒、自走式微游泳器等）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

肌动蛋白细胞骨架是细胞中的主要机械机制，介导许多必需的物理细胞活动，包括细胞变形，分裂，迁移和粘附。然而，研究 体内 肌动蛋白网络的动力学和结构由于活细胞内的生化和遗传调控而变得复杂。为了建立一个缺乏细胞内生化调节的最小模型，肌动蛋白被封装在巨大的单层囊泡（GUV，也称为脂质体）中。仿生脂质体是细胞大小的，有助于定量了解细胞骨架网络的机械和动力学特性，为自下而上的合成生物学开辟了一条可行的途径。为了生成用于包封的脂质体，利用倒置乳化法（也称为乳化液转移法），这是将复杂溶液包封到脂质体中以制备各种细胞模拟系统的最成功的技术之一。使用这种方法，将目标蛋白质的混合物添加到内部缓冲液中，然后将其在含磷脂的矿物油溶液中乳化以形成单层脂质液滴。所需的脂质体是由穿过脂质/油水界面的单层脂质液滴产生的。该方法能够将浓缩的肌动蛋白聚合物包封到具有所需脂质组分的脂质体中，为仿生细胞骨架网络的 体外 重建铺平了道路。

基于倒置乳液技术的脂质体的制备在 图1中以图形和示意性方式说明。
首先，制备由磷脂（EPC）和荧光脂质（DHPE）组成的空（裸）脂质体（直径约5-50μm）。作为对照实验，一种明亮的远红色荧光染料被封装在裸脂质体中。脂质单层是否在液滴的外周成功形成，可以通过观察在乳液中掺入荧光染料的单层脂质液滴来确定，如图2A所?...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

在这份手稿中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架封装到巨大的单层脂质囊泡（也称为脂质体）中的实验技术，以及在脂质体膜的内小叶处形成皮质仿生F-肌动蛋白层的方法。

体外 重组巨型单层囊泡内的肌动蛋白细胞骨架

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

该措施建立了没有复杂生化法规的细胞最小模型。所使用的技术可以产生高产量的脂质体，并对细胞骨架蛋白具有很高的包封效率。该措施可应用于各种蛋白质和大型物体（如微粒和自准备的微型游泳者）的封装。一个人正在努力提高前几次尝试的脂质体产量。建议定期讨论稿件部分，了解更多细节，提高产量。首先，通过混合0.1毫摩尔CACL二，10毫摩尔HEPES，1毫摩尔DTT，0.5毫摩尔DAPCO，320毫摩尔蔗糖和0.2毫摩尔ATP，制备总体积为5毫升的水性内部非聚合缓冲液。通过将蛋白质添加到 4 摄氏度的内部非聚合缓冲液中来制备蛋白质混合物。为了形成肌动蛋白层，向蛋白质混合物中加入100纳摩尔凝胶钙蛋白，4微摩尔咳嗽素和2.2微摩尔VCA HEZ。作为对照实验，用每毫升100微克的荧光染料代替蛋白质混合物。通过混合100毫摩尔氯化钾来制备总体积为5毫升的水性内部聚合缓冲液。4毫摩尔氯化镁，10毫摩尔HEPES，1毫摩尔DTT，0.5毫摩尔DABCO，10毫摩尔ATP和80毫摩尔蔗糖。通过以一比一的体积比混合内部非聚合缓冲液和内部聚合缓冲液来制备最终缓冲液，以产生总体积为30微升的内部水溶液，该溶液将被封装在脂质体中。通过混合10毫摩尔HEPES，50毫摩尔氯化钾，2毫摩尔氯化镁，0.2毫摩尔氯化钙，2毫摩尔ATP，1毫摩尔DTT，0.5毫摩尔DAPCO，212毫摩尔葡萄糖和0.1毫克/毫升β肠衣，制备总体积为150微升的水性外部缓冲液。要制备脂质油混合物，首先将 100 微升每毫升 25 毫克 EGGPC 加入玻璃小瓶中。用氩气蒸发氯仿，在小瓶底部留下干燥的固体脂质膜。为了形成肌动蛋白层，在氯仿蒸发之前，以 EGGPC 与镍脂质的 10：1 比例加入镍脂质并混合。加入两毫升矿物油。蒸发氯仿并在室温下将脂质油混合物在浴中超声处理一小时，以重悬脂质。在油乳液中制备最终缓冲液，用于制备含有目标蛋白质的单层脂滴。首先在塑料管中取100微升脂质油混合物，并向脂质油混合物中加入10微升最终缓冲液。确保最终缓冲液位于一滴中。使用玻璃注射器首先抽取少量脂质油混合物，然后通过将注射器的尖端放在液滴的外围将其分解成微小的液滴来抽取最终的缓冲液滴。轻轻上下吸出多次，直到形成浑浊的乳液。将30微升外部缓冲液放入单独的塑料管中。将30微升脂质油混合物放在外部缓冲液的顶部，静置约10分钟，以在界面处形成脂质单层。为了制备脂质体，小心地将50微升最终缓冲油乳液添加到管的顶部油相中。将塑料管以 100 倍 G 在 4 摄氏度下离心 15 分钟。改变时间和离心速度，以优化脂质体的形成。如果需要，通过移液器吸出额外的体积小心地去除油相。确保不要将移液器吸头放在试管的侧面，以避免在脂质体相顶部产生半月板油。使用新移液器，切开移液器的尖端。慢慢将移液管插入剩余的底相并吸出水体积以收集脂质体。将100微升外部缓冲液倒入培养室的孔中。轻轻地将收集的脂质体沉积到外部缓冲液中，然后将另一张盖玻片放在腔室顶部。使用63 x油浸物镜用共聚焦显微镜观察脂质体。使用 488、647 和 561 纳米激光线。为了观察荧光标记的脂质，分别封装荧光染料和封装的荧光标记肌动蛋白。捕获感兴趣的帧并以TIF格式保存图像。处理和分析图像J中的图像首先使用图像J软件打开TIF文件。转到图像，然后单击调整。其次是亮度对比度，通过调整最小和最大设置以及亮度和对比度滑块，将图像的亮度和对比度调整到所需的比例。单击工具栏中的矩形选择工具，然后选择感兴趣的区域。转到图像，然后单击裁剪以裁剪投资回报率。转到分析，然后单击设置比例。在弹出窗口中，在像素长宽比字段中输入 1.0，并将千分尺设置为长度单位。在距离（以像素为单位）字段中，输入图像宽度（以像素为单位）。在已知距离字段中，输入以微米为单位的实际图像宽度。要测量脂质体的大小，请使用工具栏中的椭圆形选择工具，沿着脂质体的边缘画一个圆。去分析，然后点击测量，测量圆的面积，从中可以计算脂质体的直径。通过薄圆形环（绿色荧光脂质双层）的可视化验证了脂质体的成功生成。在488纳米激光下使用共聚焦显微镜确认荧光染料的包封。脂质体的内部环境应在647纳米激光下均匀荧光。脂质体的形成可以通过薄的绿色圆环来观察。脂质体内部网络中的重建影响是异质的，表现为肌动蛋白丝的分支网络结构。分支结构是由引入ARP两个三个复合物触发的，它同时控制肌动蛋白丝的成核和分支，以及VCA HEZ。在脂质体双层的内小叶处形成薄但密集支链的肌动蛋白层，其可可视化为荧光应。脂质音频最终缓冲混合物通常必须通过玻璃注射器来回泵送，以避免引入气泡。处理后混合物必须是白色的。这项技术为建立细胞的最小模型铺平了道路，没有复杂的生化法规。通过这种细胞模拟系统，研究人员可以探索细胞骨架蛋白、成核器和分子马达的机械和动力学特性。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

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