Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Vi anerkender finansiering af ARO MURI W911NF-14-1-0403 til MPM, National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 til MPM, National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 og Human Frontiers Science Program (HFSP) tilskudsnummer RGY0073/2018 til M.P.M. Enhver mening, resultater, konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra ARO, NIH eller HFSP. S.C. anerkender frugtbare diskussioner med V. Yadav, C. Muresan og S. Amiri.

1. Fremstilling af buffere og proteinopløsninger
<ol><li>Den vandige indre ikke-polymerisationsbuffer (INP) fremstilles i et samlet volumen på 5 ml ved at blande 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccharose og 0,2 mM ATP.</li>
	<li>Forbered proteinblandingen (PM) ved at tilsætte proteiner til INP-bufferen ved 4 °C med følgende koncentrationer: 11,2 μM ikke-fluorescerende G-actin, 2,8 μM fluorescerende mærket actin og 0,24 μM Arp2/3 (materiale...

Flere nøgletrin bestemmer succesen med et højt udbytte af liposomer under forberedelsesprocessen. For helt at opløse lipidfilmen i olien skal prøven sonikeres, indtil lipidfilmen i bunden af hætteglasset forsvinder helt. Efter sonikeringen skal lipid-olieblandingen opbevares natten over ved stuetemperatur under mørke forhold for at lipidmolekylerne kan sprede sig yderligere29. Blandingen kan opbevares ved 4 °C i op til en uge. Ved fremstilling af en FB/olieemulsion med monolags lipiddråber...

Actincytoskelettet spiller en grundlæggende rolle i konstruktionen af cellens intracellulære arkitektur ved at koordinere kontraktilitet på molekylært niveau og kraftgenerering 1,2,3. Som et resultat formidler det adskillige væsentlige cellulære aktiviteter, herunder celledeformation 4,5, division6, migration 7,8 og adhæsion9. In vitro-rekonstitutionen af actin-netværk har fået enorm opmærksomhed i de senere år 10,11,12,13,14,15,16,17. Målet med rekonstitution er at opbygge en minimal model af cellen blottet for den komplekse biokemiske regulering, der findes i levende celler. Dette giver et kontrollerbart miljø til at undersøge specifikke intracellulære aktiviteter og letter identifikation og analyse af forskellige komponenter i actincytoskelettet18,19. Endvidere giver indkapslingen af in vitro actinnetværk inde i phospholipid gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er, liposomer) et begrænset, men deformerbart rum med en semipermeabel grænse. Det efterligner det fysiologiske og mekaniske mikromiljø af actinmaskineriet i cellen 9,20,21,22.
Blandt forskellige metoder til fremstilling af liposomer er lipidfilmhydreringsmetoden (også kendt som hævelsesmetoden) en af de tidligste teknikker23. Den tørre lipidfilm hydrerer med tilsætning af buffere og danner membranøse bobler, der til sidst bliver vesikler24. For at producere større vesikler med et højere udbytte anvender en forbedret metode, der går videre fra filmhydreringsmetoden, kendt som elektroformationsmetoden25, et AC-elektrisk felt til effektivt at fremme hydreringsprocessen26. De største begrænsninger ved disse hydreringsbaserede metoder til actinindkapsling er, at den har lav indkapslingseffektivitet af stærkt koncentrerede proteiner, og den er kun kompatibel med specifikke lipidsammensætninger24. Den omvendte emulsionsteknik har til sammenligning færre begrænsninger for lipidkomponenter og proteinkoncentrationer 20,27,28,29. I denne metode tilsættes en blanding af proteiner til indkapsling til den indre vandige buffer, som senere emulgeres i en lipidholdig mineralolieopløsning, der danner lipid-monolagsdråber. Monolags lipiddråber krydser derefter gennem en anden lipid / olie-vand-grænseflade gennem centrifugering for at danne dobbeltlags lipidvesikler (liposomer). Denne teknik har vist sig at være en af de mest succesrige strategier til actinindkapsling24,30. Separat er der nogle mikrofluidiske enhedsmetoder, herunder pulserende jetting31,32, forbigående membranudstødning33 og cDICE-metoden34. Lighederne mellem den omvendte emulsionsmetode og den mikrofluidiske metode er lipidopløsningsmiddelet (olie), der anvendes, og indførelsen af lipid / olie-vand-grænseflade til dannelse af den ydre folder af liposomer. I modsætning hertil kræver dannelsen af liposomer ved den mikrofluidiske metode en opsætning af mikrofluidiske anordninger og ledsages af olie fanget mellem dobbeltlagets to foldere, hvilket kræver et ekstra trin til fjernelse af olie35.
I dette manuskript brugte vi den omvendte emulsionsteknik til at fremstille liposomer, der indkapslede et polymeriseret F-actin-netværk som tidligere anvendt22. Proteinblandingen til indkapsling blev først anbragt i en buffer med ikke-polymeriserende betingelser for at opretholde actin i sin kugleformede (G) form. Hele processen blev udført ved 4 °C for at forhindre tidlig actinpolymerisation, som senere blev udløst ved at lade prøven varme op til stuetemperatur. En gang ved stuetemperatur polymeriserer actinet i sin filamentøse (F) form. En række actinbindende proteiner kan tilsættes til den indre vandige bufferopløsning for at studere proteinfunktionaliteter og egenskaber og dermed yderligere give indsigt i dets interaktion med actinnetværket og membranoverfladen. Denne metode kan også anvendes til indkapsling af forskellige proteiner af interesse36 og store genstande (mikropartikler, selvkørende mikrosvømmere osv.) tæt på størrelsen af de endelige liposomer28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Actincytoskelettet, det vigtigste mekaniske maskineri i cellen, formidler adskillige væsentlige fysiske cellulære aktiviteter, herunder celledeformation, opdeling, migration og vedhæftning. Imidlertid kompliceres studiet af dynamikken og strukturen i actinnetværket in vivo af den biokemiske og genetiske regulering i levende celler. For at opbygge en minimal model uden intracellulær biokemisk regulering er actin indkapslet inde i gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er, også kaldet liposomer). De biomimetiske liposomer er cellestørrelse og letter en kvantitativ indsigt i cytoskeletnetværkets mekaniske og dynamiske egenskaber, hvilket åbner en levedygtig rute for bottom-up syntetisk biologi. For at generere liposomer til indkapsling anvendes den omvendte emulsionsmetode (også kaldet emulsionsoverførselsmetoden), hvilket er en af de mest succesrige teknikker til indkapsling af komplekse opløsninger i liposomer til fremstilling af forskellige celleefterlignende systemer. Med denne metode tilsættes en blanding af proteiner af interesse til den indre buffer, som senere emulgeres i en phospholipidholdig mineralolieopløsning til dannelse af monolags lipiddråber. De ønskede liposomer genereres fra monolags lipiddråber, der krydser en lipid / olie-vand-grænseflade. Denne metode muliggør indkapsling af koncentrerede actinpolymerer i liposomerne med ønskede lipidkomponenter, hvilket baner vejen for in vitro-rekonstitution af et biomimicking cytoskeletnetværk.

Fremstillingen af liposomer baseret på den omvendte emulsionsteknik er illustreret grafisk og skematisk i figur 1.
Først blev tomme (bare) liposomer (~ 5-50 μm i diameter), der var sammensat af phospholipid (EPC) og fluorescerende lipid (DHPE) fremstillet. Et lyst, langt rødt fluorescerende farvestof blev indkapslet i bare liposomer som et kontroleksperiment. Hvorvidt et lipidmonolag med succes er dannet i dråbens perifere enhed, kunne bestemmes ved at observ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

I dette manuskript demonstrerer vi de eksperimentelle teknikker til at indkapsle F-actincytoskelettet i gigantiske unilamellare lipidvesikler (også kaldet liposomer) og metoden til at danne et cortex-biomimicking F-actinlag ved den indre folder af liposommembranen.

In vitro Rekonstitution af Actin Cytoskelettet Inde i Giant Unilamellar Vesikler

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Denne foranstaltning bygger en minimumsmodel af cellen uden komplekse biokemiske regler. Den anvendte teknik kan generere højt udbytte af liposomer og have høje indkapslingseffektiviteter for cytoskeletproteiner. Denne foranstaltning kan anvendes til indkapsling af forskellige proteiner og store genstande såsom mikropartikler og selvforberedende mikrosvømmere.En person kæmper for at øge liposomudbyttet for de første mange forsøg. Det anbefales regelmæssigt at diskutere afsnit af manuskriptet for flere detaljer for at øge udbyttet. Til at begynde med fremstilles den vandige indre ikke-polymerisationsbuffer i et samlet volumen på fem milliliter ved at blande 0,1 millimolar CACL to, 10 millimolar HEPES, en millimolar DTT, 0,5 millimolar DAPCO, 320 millimolar saccharose og 0,2 millimolar ATP.Forbered proteinblandingen ved at tilsætte proteiner til den indre ikke-polymerisationsbuffer ved fire grader Celsius. For at danne et actinlag tilsættes 100 nanomolære gellcalin, fire mikromolære hostalin og 2,2 mikromolære VCA HEZ til proteinblandingen. Som et kontroleksperiment erstattes proteinblanding med 100 mikrogram pr. milliliter fluorescerende farvestof.Forbered den vandige indre polymerisationsbuffer i et samlet volumen på fem milliliter ved at blande 100 millimolar kaliumchlorid. Fire millimolar magnesiumchlorid, 10 millimolar HEPES, en millimolar DTT, 0,5 millimolar DABCO, 10 millimolar ATP og 80 millimolar saccharose. Forbered den endelige buffer ved at blande indre ikke-polymerisationsbuffer og indre polymerisationsbuffer ved et volumenforhold på en til en for at give den indre vandige opløsning i et samlet volumen på 30 mikroliter, der vil blive indkapslet i liposomet.Forbered den vandige ydre buffer i et samlet volumen på 150 mikroliter ved at blande 10 millimolar HEPES, 50 millimolar kaliumchlorid, to millimolar magnesiumchlorid, 0,2 millimolar calciumchlorid, to millimolar ATP, en millimolar DTT, 0,5 millimolar DAPCO, 212 millimolar glucose og 0,1 milligram pr. milliliter beta-hus. For at forberede lipidolieblandingen skal du begynde med at tilføje 100 mikroliter 25 milligram pr. Milliliter EGGPC i et hætteglas med glas. Fordamp chloroform med argongas og efterlader en tør fast lipidfilm i bunden af hætteglasset.For at danne et actinlag tilsættes nikkellipid ved et 10 til et forhold mellem EGGPC og nikkellipid og blandes, før fordampningen af chloroform. Tilsæt to milliliter mineralolie. Fordamp chloroformen og soniker lipidolieblandingen ved stuetemperatur i et bad i en time for at suspendere lipiderne.Forbered en endelig buffer i olieemulsion til fremstilling af monolags lipiddråber indeholdende proteinet af interesse. Start med at tage 100 mikroliter af lipidolieblandingen i et plastrør og tilsæt 10 mikroliter endelig buffer til lipidolieblandingen. Sørg for, at den endelige buffer er i en dråbe.Brug en glassprøjte til at tegne en lille mængde lipidolieblanding først og derefter den sidste bufferdråbe ved at placere spidsen af sprøjten i periferien af dråben for at bryde den op i små dråber. Opsæt forsigtigt op og ned flere gange, indtil der dannes en overskyet emulsion. Sæt 30 mikroliter udvendig buffer i et separat plastrør.Placer 30 mikroliter af lipidolieblandingen oven på den udvendige buffer, og lad den sidde i ca. 10 minutter for at udvikle et lipidmonolag ved grænsefladen. For at forberede liposomer tilsættes forsigtigt 50 mikroliter af den endelige bufferolieemulsion til rørets øverste oliefase. Centrifuger plastrøret ved 100 gange G i 15 minutter ved fire grader Celsius.Varier tid og centrifugeringshastighed for at optimere til liposomdannelse. Fjern forsigtigt oliefasen med pipetteaspirer ekstra volumen, hvis det er nødvendigt. Sørg for ikke at placere pipettespidsen ved siden af røret for at undgå at skabe en menisk olie oven på liposomfasen.Skær pipettens spids med en ny pipette. Stik langsomt pipetten ind i den resterende bundfase og opsug det vandige volumen for at samle liposomer. Hæld 100 mikroliter udvendig buffer i brønden i et inkubationskammer.Deponer forsigtigt de opsamlede liposomer i den udvendige buffer, og læg derefter en anden dækseddel oven på kammeret. Overhold liposomer med et konfokalmikroskop ved hjælp af et 63 x olienedsænkningsmål. Brug 488, 647 og 561 nanometer laserlinjer.For at observere fluorescerende mærket lipid, indkapslet fluorescerende farvestof og indkapslet fluorescerende mærket actin henholdsvis. Fang de interessante rammer, og gem billederne i TIF-format. Behandl og analyser billeder i billede J.Start med at åbne TIF-filen ved hjælp af billede J-software.Gå til billede, og klik derefter på juster. Efterfulgt af lysstyrkekontrast skal du justere billedets lysstyrke og kontrast til den ønskede skala ved at justere minimums- og maksimumindstillingerne og lysstyrke- og kontrastskyderne. Klik på rektangelmarkeringsværktøjet på værktøjslinjen, og vælg interesseområdet.Gå til billede, og klik derefter på beskær for at beskære ROI. Gå til analyse, og klik derefter på indstil skala. I pop op-vinduet skal du indtaste 1.0 i pixelstørrelsesforholdsfeltet og indstille mikrometer som længdeenhed.I feltet afstand i pixels skal du indtaste billedbredden i pixels. I det kendte afstandsfelt skal du indtaste den reelle billedbredde i mikron. For at måle størrelsen på liposomet skal du bruge det ovale markeringsværktøj i værktøjslinjen til at tegne en cirkel langs kanten af liposomet.Gå til analyse, og klik derefter på mål for at måle cirklens areal, hvorfra liposomets diameter kan beregnes. Vellykket liposomgenerering verificeres gennem visualisering af den tynde cirkulære ring, som er det grønne fluorescerende lipiddobbeltlag. Under en 488 nanometer laser ved hjælp af konfokal mikroskopi for at bekræfte indkapsling af det fluorescerende farvestof.Liposomernes indre miljø skal være ensartet fluorescerende under en 647 nanometer laser. Dannelsen af liposomer kunne visualiseres af de tynde grønne cirkulære ringe. Den rekonstituerede påvirkning i netværk inde i liposomer er heterogene og manifesterer sig som forgrenede netværksstrukturer af actinfilamenter.Grenarkitekturen blev udløst af introduktionen af ARP to tre komplekser, som samtidig styrer kimdannelse og forgrening af actinfilamenter sammen med VCA HEZ. Et tyndt, men tæt forgrenet actinlag skabes ved den indre folder af dobbeltlaget af liposomer, som kan visualiseres som en fluorescerende skal. Den endelige bufferblanding af lipidlyd skal generelt pumpes frem og tilbage gennem en glassprøjte for at undgå at indføre luftbobler.Blandingen skal være hvidlig efter processen. Denne teknik banede vejen for at opbygge en minimal model af cellen, blottet for komplekse biokemiske regler. Med dette celleefterligningssystem kan forskere udforske de mekaniske og dynamiske egenskaber af cytoskeletproteiner, nukleator og molekylærmotoren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid rekonstitution Assay (ORA) for den funktionelle analyse af Intestinal stilk og Niche celler

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization af hele den menneskelige hjerte indeni en trykisoleret pose i en inverteret orientering

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...