Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Nous reconnaissons le financement ARO MURI W911NF-14-1-0403 à M.P.M., le National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 à M.P.M., les National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 et Human Frontiers Science Program (HFSP) numéro de subvention RGY0073/2018 à M.P.M. Toute opinion, constatation, conclusion ou recommandation exprimée dans ce document est celle de l’auteur (s) et ne reflète pas nécessairement les points de vue de l’ARO, des NIH ou du HFSP. S.C. reconnaît les discussions fructueuses avec V. Yadav, C. Muresan et S. Amiri.

1. Préparation des tampons et des solutions protéiques
<ol><li>Préparer le tampon aqueux de non-polymérisation interne (INP) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 0,1 mM de CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM de DTT, 0,5 mM de Dabco, 320 mM de saccharose et0,2 mM d’ATP.</li>
	<li>Préparer le mélange de protéines (PM) en ajoutant des protéines au tampon INP à 4 °C avec les concentrations suivantes : 11,2 μM de G-actine non fluorescente, 2,8 μM d’actine marquée par fluore...

Plusieurs étapes clés déterminent le succès d’un rendement élevé en liposomes pendant le processus de préparation. Pour dissoudre complètement le film lipidique dans l’huile, l’échantillon doit être soniqué jusqu’à ce que le film lipidique au fond du flacon en verre disparaisse complètement. Après la sonication, le mélange lipide-huile doit être stocké pendant la nuit à température ambiante dans des conditions sombres pour que les molécules lipidiques se dispersent davantage2...

Le cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans la construction de l’architecture intracellulaire de la cellule en coordonnant la contractilité au niveau moléculaire et la génération de force 1,2,3. En conséquence, il intervient dans de nombreuses activités cellulaires essentielles, notamment la déformation cellulaire4,5, la division6, la migration 7,8 et l’adhésion9. La reconstitution in vitro des réseaux d’actine a attiré énormément d’attention ces dernières années 10,11,12,13,14,15,16,17. Le but de la reconstitution est de construire un modèle minimal de la cellule dépourvu de la régulation biochimique complexe qui existe dans les cellules vivantes. Cela offre un environnement contrôlable pour sonder des activités intracellulaires spécifiques et facilite l’identification et l’analyse des différents composants du cytosquelette d’actine18,19. De plus, l’encapsulation de réseaux d’actine in vitro à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes phospholipides (GUV, liposomes) fournit un espace confiné mais déformable avec une limite semi-perméable. Il imite le microenvironnement physiologique et mécanique de la machinerie d’actine dans la cellule 9,20,21,22.
Parmi les différentes méthodes de préparation des liposomes, la méthode d’hydratation du film lipidique (également connue sous le nom de méthode de gonflement) est l’une des premières techniques23. Le film lipidique sec s’hydrate avec l’ajout de tampons, formant des bulles membraneuses qui finissent par devenir des vésicules24. Pour produire des vésicules plus grandes avec un rendement plus élevé, une méthode améliorée passant de la méthode d’hydratation du film, connue sous le nom de méthode d’électroformation25, applique un champ électrique AC pour favoriser efficacement le processus d’hydratation26. Les principales limites de ces méthodes basées sur l’hydratation pour l’encapsulation de l’actine sont qu’elles ont une faible efficacité d’encapsulation des protéines hautement concentrées, et qu’elles ne sont compatibles qu’avec des compositions lipidiques spécifiques24. La technique de l’émulsion inversée, en comparaison, a moins de limitations pour les composants lipidiques et les concentrations de protéines20,27,28,29. Dans cette méthode, un mélange de protéines pour l’encapsulation est ajouté au tampon aqueux interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des lipides, formant des gouttelettes lipides-monocouches. Les gouttelettes lipidiques monocouches traversent ensuite une autre interface lipide/huile-eau par centrifugation pour former des vésicules lipidiques bicouches (liposomes). Cette technique s’est avérée être l’une des stratégies les plus efficaces pour l’encapsulation d’actine24,30. Séparément, il existe certaines méthodes de dispositifs microfluidiques, notamment le jet pulsé31,32, l’éjection à membrane transitoire 33 et la méthode cDICE 34. Les similitudes entre la méthode d’émulsion inversée et la méthode microfluidique sont le solvant lipidique (huile) utilisé et l’introduction d’une interface lipide/huile-eau pour la formation du feuillet externe des liposomes. En revanche, la génération de liposomes par la méthode microfluidique nécessite une mise en place de dispositifs microfluidiques et s’accompagne d’huile piégée entre les deux feuillets de la bicouche, ce qui nécessite une étape supplémentaire pour l’élimination de l’huile35.
Dans ce manuscrit, nous avons utilisé la technique de l’émulsion inversée pour préparer des liposomes encapsulant un réseau d’actine F polymérisé tel qu’utilisé précédemment22. Le mélange de protéines pour l’encapsulation a d’abord été placé dans un tampon avec des conditions non polymérisantes pour maintenir l’actine sous sa forme globulaire (G). L’ensemble du processus a été effectué à 4 ° C pour empêcher la polymérisation précoce de l’actine, qui a ensuite été déclenchée en permettant à l’échantillon de se réchauffer à température ambiante. Une fois à température ambiante, l’actine polymérise sous sa forme filamenteuse (F). Une variété de protéines liant l’actine peuvent être ajoutées à la solution tampon aqueuse interne pour étudier les fonctionnalités et les propriétés des protéines, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur son interaction avec le réseau d’actine et la surface de la membrane. Cette méthode peut également être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines d’intérêt36 et de grands objets (microparticules, micronageurs automoteurs, etc.) proches de la taille des liposomesfinaux28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Le cytosquelette d’actine, la principale machinerie mécanique de la cellule, intervient dans de nombreuses activités cellulaires physiques essentielles, notamment la déformation, la division, la migration et l’adhésion cellulaires. Cependant, l’étude de la dynamique et de la structure du réseau d’actine in vivo est compliquée par la régulation biochimique et génétique au sein des cellules vivantes. Pour construire un modèle minimal dépourvu de régulation biochimique intracellulaire, l’actine est encapsulée dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV, également appelées liposomes). Les liposomes biomimétiques sont de la taille d’une cellule et facilitent un aperçu quantitatif des propriétés mécaniques et dynamiques du réseau de cytosquelettes, ouvrant une voie viable pour la biologie synthétique ascendante. Pour générer des liposomes pour l’encapsulation, la méthode d’émulsion inversée (également appelée méthode de transfert d’émulsion) est utilisée, qui est l’une des techniques les plus efficaces pour encapsuler des solutions complexes dans des liposomes afin de préparer divers systèmes imitant les cellules. Avec cette méthode, un mélange de protéines d’intérêt est ajouté au tampon interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des phospholipides pour former des gouttelettes lipidiques monocouches. Les liposomes souhaités sont générés à partir de gouttelettes lipidiques monocouches traversant une interface lipide/huile-eau. Cette méthode permet l’encapsulation de polymères d’actine concentrés dans les liposomes avec les composants lipidiques souhaités, ouvrant la voie à la reconstitution in vitro d’un réseau de cytosquelettes biomimiques.

La préparation des liposomes basée sur la technique de l’émulsion inversée est illustrée graphiquement et schématiquement sur la figure 1.
Tout d’abord, des liposomes vides (nus) (~5-50 μm de diamètre) composés de phospholipides (EPC) et de lipides fluorescents (DHPE) ont été préparés. Un colorant fluorescent rouge vif a été encapsulé dans des liposomes nus comme expérience de contrôle. Il a été possible de déterminer si une monocouche lip...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Cette mesure construit un modèle minimum de la cellule dépourvu de réglementations biochimiques complexes. La technique utilisée peut générer un rendement élevé en liposomes et avoir une efficacité d’encapsulation élevée pour les protéines du cytosquelette. Cette mesure peut être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines et de gros objets tels que des microparticules et des micronageurs auto-préparés.Un individu a du mal à augmenter le rendement en liposomes pour les premières tentatives. Il est recommandé de discuter régulièrement de la section du manuscrit pour plus de détails afin d’augmenter le rendement. Pour commencer, préparez le tampon aqueux interne de non-polymérisation dans un volume total de cinq millilitres en mélangeant 0,1 millimolaire CACL deux, 10 millimolaires HEPES, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire DAPCO, 320 millimolaires de saccharose et 0,2 millimolaire d’ATP.Préparer le mélange de protéines en ajoutant des protéines au tampon interne de non-polymérisation à quatre degrés Celsius. Pour former une couche d’actine, ajoutez 100 nanomolaires de gélcaline, quatre micromolaires de toux et 2,2 micromolaires de VCA HEZ au mélange de protéines. Comme expérience de contrôle, remplacez le mélange de protéines par un colorant fluorescent de 100 microgrammes par millilitre.Préparer le tampon de polymérisation interne aqueuse dans un volume total de cinq millilitres en mélangeant 100 millimolaires de chlorure de potassium. Quatre millimolaires de chlorure de magnésium, 10 millimolaires HEPES, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire DABCO, 10 millimolaires d’ATP et 80 millimolaires de saccharose. Préparer le tampon final en mélangeant le tampon de non-polymérisation interne et le tampon de polymérisation interne à un rapport volumique de un à un, pour obtenir la solution aqueuse interne dans un volume total de 30 microlitres qui sera encapsulé dans le liposome.Préparer le tampon extérieur aqueux dans un volume total de 150 microlitres en mélangeant 10 millimolaires HEPES, 50 millimolaires de chlorure de potassium, deux millimolaires de chlorure de magnésium, 0,2 millimolaire de chlorure de calcium, deux millimolaires d’ATP, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire de DAPCO, 212 millimolaires de glucose et 0,1 milligramme par millilitre de boîtier bêta. Pour préparer le mélange d’huile lipidique, commencez par ajouter 100 microlitres de 25 milligrammes par millilitre EGGPC dans un flacon en verre. Évaporer le chloroforme avec du gaz argon en laissant un film lipidique solide sec au fond du flacon.Pour former une couche d’actine, ajouter du lipide de nickel à un rapport de 10 à un EGGPC au lipide de nickel et mélanger, avant l’évaporation du chloroforme. Ajouter deux millilitres d’huile minérale. Évaporer le chloroforme et sonifier le mélange d’huile lipidique à température ambiante dans un bain pendant une heure, pour remettre les lipides en suspension.Préparer un tampon final dans l’émulsion d’huile pour préparer des gouttelettes lipidiques monocouches contenant la protéine d’intérêt. Commencez par prendre 100 microlitres du mélange d’huile lipidique dans un tube en plastique et ajoutez 10 microlitres de tampon final au mélange d’huile lipidique. Assurez-vous que le tampon final est dans une gouttelette.À l’aide d’une seringue en verre, prélever d’abord une petite quantité de mélange d’huile lipidique, puis la gouttelette tampon finale en plaçant l’extrémité de la seringue à la périphérie de la gouttelette pour la briser en minuscules gouttelettes. Aspirer doucement de haut en bas plusieurs fois jusqu’à ce qu’une émulsion trouble se forme. Mettez 30 microlitres de tampon extérieur dans un tube en plastique séparé.Placez 30 microlitres du mélange d’huile lipidique sur le tampon extérieur et laissez-le reposer pendant environ 10 minutes pour développer une monocouche lipidique à l’interface. Pour préparer les liposomes, ajoutez soigneusement 50 microlitres de l’émulsion finale d’huile tampon à la phase huileuse supérieure du tube. Centrifuger le tube en plastique à 100 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Variez le temps et la vitesse de centrifugation, pour optimiser la formation de liposomes. Retirez délicatement la phase huileuse à l’aide d’une pipette en aspirant le volume supplémentaire si nécessaire. Assurez-vous de ne pas placer l’embout de la pipette sur le côté du tube pour éviter de créer un ménisque d’huile au-dessus de la phase liposomique.Avec une pipette neuve, coupez l’extrémité de la pipette. Collez lentement la pipette dans la phase inférieure restante et aspirez le volume aqueux pour recueillir les liposomes. Versez 100 microlitres de tampon extérieur dans le puits d’une chambre d’incubation.Déposez doucement les liposomes collectés dans le tampon extérieur, puis placez un autre couvercle sur le dessus de la chambre. Observez les liposomes avec un microscope confocal à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile de 63 x. Utilisez des lignes laser de 488, 647 et 561 nanomètres.Pour observer respectivement les lipides marqués par fluorescence, les colorants fluorescents encapsulés et l’actine encapsulée marquée par fluorescence. Capturez les images d’intérêt et enregistrez les images au format TIF. Traitez et analysez les images dans l’image J.Commencez par ouvrir le fichier TIF, à l’aide du logiciel image J.Accédez à l’image, puis cliquez sur Ajuster. Suivi d’un contraste de luminosité, réglez la luminosité et le contraste de l’image à l’échelle souhaitée en ajustant les paramètres minimum et maximum et les curseurs de luminosité et de contraste. Cliquez sur l’outil de sélection de rectangle dans la barre d’outils et sélectionnez la région d’intérêt.Accédez à l’image, puis cliquez sur recadrer pour recadrer le retour sur investissement. Accédez à analyser, puis cliquez sur Définir l’échelle. Dans la fenêtre contextuelle, entrez 1,0 dans le champ Format des pixels et définissez micromètre comme unité de longueur.Dans le champ distance en pixels, entrez la largeur de l’image en pixels. Dans le champ Distance connue, entrez la largeur réelle de l’image en microns. Pour mesurer la taille du liposome, à l’aide de l’outil de sélection ovale de la barre d’outils, tracez un cercle le long du bord du liposome.Allez à analyser, puis cliquez sur mesurer, pour mesurer la surface du cercle, à partir de laquelle le diamètre du liposome peut être calculé. La génération réussie de liposomes est vérifiée par la visualisation de l’anneau circulaire mince qui est la bicouche lipidique fluorescente verte. Sous un laser de 488 nanomètres utilisant la microscopie confocale pour confirmer l’encapsulation du colorant fluorescent.L’environnement interne des liposomes doit être uniformément fluorescent sous un laser de 647 nanomètres. La formation de liposomes pourrait être visualisée par les minces anneaux circulaires verts. L’effet reconstitué dans les réseaux à l’intérieur des liposomes est hétérogène, se manifestant par des structures de réseau ramifiées de filaments d’actine.L’architecture de branche a été déclenchée par l’introduction du complexe ARP deux trois, qui contrôle simultanément la nucléation et la ramification des filaments d’actine, ainsi que VCA HEZ. Une fine couche d’actine densément ramifiée est créée au niveau du feuillet interne de la bicouche de liposomes qui peut être visualisée comme un fluorescent. Le mélange tampon final audio lipidique doit généralement être pompé d’avant en arrière à travers une seringue en verre, pour éviter l’introduction de bulles d’air.Le mélange doit être blanchâtre après le procédé. Cette technique a ouvert la voie à la construction d’un modèle minimal de la cellule, dépourvu de régulations biochimiques complexes. Avec ce système d’imitation cellulaire, les chercheurs peuvent explorer les propriétés mécaniques et dynamiques des protéines du cytosquelette, du nucléateur et du moteur moléculaire.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

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