Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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Wir bestätigen die Finanzierung von ARO MURI W911NF-14-1-0403 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 und die Fördernummer RGY0073/2018 des Human Frontiers Science Program (HFSP) an M.P.M. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der ARO, NIH oder HFSP wider. S.C. würdigt fruchtbare Gespräche mit V. Yadav, C. Muresan und S. Amiri.

1. Herstellung von Puffern und Proteinlösungen
<ol><li>Bereiten Sie den wässrigen inneren Nichtpolymerisationspuffer (INP) in einem Gesamtvolumen von 5 ml durch Mischen von 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM Saccharose und0,2 mM ATP vor.</li>
	<li>Bereiten Sie den Proteinmix (PM) vor, indem Sie dem INP-Puffer bei 4 °C Proteine mit folgenden Konzentrationen hinzufügen: 11,2 μM nicht-fluoreszierendes G-Aktin, 2,8 μM fluoreszenzmarkiertes Aktin und 0,24 μ...

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg einer hohen Ausbeute an Liposomen während des Herstellungsprozesses. Um den Lipidfilm im Öl vollständig aufzulösen, muss die Probe beschallt werden, bis der Lipidfilm am Boden der Glasdurchstechflasche vollständig verschwindet. Nach der Beschallung muss das Lipid-Öl-Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen gelagert werden, damit sich die Lipidmoleküle weiter verteilenkönnen 29. Die Mischung kann bis zu einer Woche bei 4...

Das Aktinzytoskelett spielt eine grundlegende Rolle beim Aufbau der intrazellulären Architektur der Zelle, indem es die Kontraktilität auf molekularer Ebene und die Krafterzeugung koordiniert 1,2,3. Infolgedessen vermittelt es zahlreiche essentielle zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zelldeformation4,5, Division6, Migration 7,8 und Adhäsion9. Die in vitro Rekonstitution von Aktinnetzwerken hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erlangt 10,11,12,13,14,15,16,17. Das Ziel der Rekonstitution ist es, ein Minimalmodell der Zelle ohne die komplexe biochemische Regulation zu erstellen, die in lebenden Zellen existiert. Dies bietet eine kontrollierbare Umgebung zur Untersuchung spezifischer intrazellulärer Aktivitäten und erleichtert die Identifizierung und Analyse verschiedener Komponenten des Aktinzytoskeletts18,19. Darüber hinaus bietet die Verkapselung von in vitro Aktinnetzwerken in Phospholipid-Riesen-Unilamellenvesikeln (GUVs, Liposomen) einen begrenzten, aber deformierbaren Raum mit einer semipermeablen Grenze. Es ahmt die physiologische und mechanische Mikroumgebung der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle 9,20,21,22 nach.
Unter verschiedenen Methoden zur Herstellung von Liposomen ist die Lipidfilmhydratationsmethode (auch bekannt als Quellmethode) eine der frühesten Techniken23. Der trockene Lipidfilm hydratisiert unter Zugabe von Puffern und bildet membranöse Blasen, die schließlich zu Vesikeln werden24. Um größere Vesikel mit einer höheren Ausbeute zu erzeugen, wendet ein verbessertes Verfahren, das von der Filmhydratationsmethode fortschreitet, bekannt als Elektrobildungsmethode25, ein elektrisches Wechselstromfeld an, um den Hydratationsprozess26 effizient zu fördern. Die Haupteinschränkungen dieser hydratationsbasierten Methoden zur Aktinverkapselung bestehen darin, dass sie eine geringe Verkapselungseffizienz von hochkonzentrierten Proteinen aufweist und nur mit spezifischen Lipidzusammensetzungen kompatibel ist24. Die invertierte Emulsionstechnik hat im Vergleich dazu weniger Einschränkungen für Lipidkomponenten und Proteinkonzentrationen20,27,28,29. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung von Proteinen zur Verkapselung in den inneren wässrigen Puffer gegeben, der später in einer lipidhaltigen Mineralöllösung emulgiert wird, wobei Lipid-Monoschicht-Tröpfchen gebildet werden. Die einschichtigen Lipidtröpfchen durchqueren dann durch Zentrifugation eine weitere Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche, um zweischichtige Lipidvesikel (Liposomen) zu bilden. Diese Technik hat sich als eine der erfolgreichsten Strategien zur Aktinverkapselung24,30 erwiesen. Unabhängig davon gibt es einige mikrofluidische Gerätemethoden, einschließlich gepulstes Jetting31,32, transienten Membranauswurf 33 und das cDICE-Verfahren 34. Die Ähnlichkeiten zwischen der inversen Emulsionsmethode und der mikrofluidischen Methode sind das verwendete Lipidlösungsmittel (Öl) und die Einführung einer Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche für die Bildung des äußeren Blattes von Liposomen. Im Gegensatz dazu erfordert die Erzeugung von Liposomen durch das mikrofluidische Verfahren einen Aufbau mikrofluidischer Vorrichtungen und wird von Öl begleitet, das zwischen den beiden Blättchen der Doppelschicht eingeschlossen ist, was einen zusätzlichen Schritt zur Ölentfernung erfordert35.
In diesem Manuskript verwendeten wir die invertierte Emulsionstechnik, um Liposomen herzustellen, die ein polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, wie zuvor verwendet22. Die Proteinmischung für die Verkapselung wurde zunächst in einen Puffer mit nichtpolymerisierenden Bedingungen gegeben, um Aktin in seiner globulären (G) Form zu erhalten. Der gesamte Prozess wurde bei 4 °C durchgeführt, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern, die später ausgelöst wurde, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Bei Raumtemperatur polymerisiert das Aktin in seine filamentöse (F) Form. Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen kann der inneren wässrigen Pufferlösung hinzugefügt werden, um Proteinfunktionalitäten und -eigenschaften zu untersuchen und so weitere Einblicke in ihre Interaktion mit dem Aktinnetzwerk und der Membranoberfläche zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch auf die Verkapselung verschiedener Proteine von Interesse36 und großer Objekte (Mikropartikel, selbstfahrende Mikroschwimmer usw.) nahe der Größe der endgültigen Liposomen 28,37 angewendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Das Aktinzytoskelett, die wichtigste mechanische Maschinerie in der Zelle, vermittelt zahlreiche wesentliche physikalische zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zellverformung, Teilung, Migration und Adhäsion. Die Untersuchung der Dynamik und Struktur des Aktinnetzwerks in vivo wird jedoch durch die biochemische und genetische Regulation innerhalb lebender Zellen erschwert. Um ein minimales Modell ohne intrazelluläre biochemische Regulation zu erstellen, wird Aktin in riesige unilamellare Vesikel (GUVs, auch Liposomen genannt) eingekapselt. Die biomimetischen Liposomen sind zellgroß und ermöglichen einen quantitativen Einblick in die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zytoskelett-Netzwerks, was einen gangbaren Weg für die synthetische Bottom-up-Biologie eröffnet. Um Liposomen für die Verkapselung zu erzeugen, wird die invertierte Emulsionsmethode (auch als Emulsionstransfermethode bezeichnet) verwendet, eine der erfolgreichsten Techniken zur Verkapselung komplexer Lösungen in Liposomen, um verschiedene zellnachahmende Systeme herzustellen. Bei dieser Methode wird dem inneren Puffer eine Mischung interessanter Proteine zugegeben, die später in einer phospholipidhaltigen Mineralöllösung zu einschichtigen Lipidtröpfchen emulgiert wird. Die gewünschten Liposomen werden aus einschichtigen Lipidtröpfchen erzeugt, die eine Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche kreuzen. Diese Methode ermöglicht die Verkapselung konzentrierter Aktinpolymere in die Liposomen mit gewünschten Lipidkomponenten und ebnet den Weg für die in vitro Rekonstitution eines bioimitierenden Zytoskelett-Netzwerks.

Die Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik ist in Abbildung 1 grafisch und schematisch dargestellt.
Zunächst wurden leere (nackte) Liposomen (~5-50 μm Durchmesser) hergestellt, die aus Phospholipid (EPC) und fluoreszierendem Lipid (DHPE) zusammengesetzt waren. Ein heller, tiefroter Fluoreszenzfarbstoff wurde als Kontrollexperiment in nackte Liposomen eingekapselt. Ob sich eine Lipidmonoschicht erfolgreich in der Peripherie des Tröpfch...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Diese Maßnahme erstellt ein Minimalmodell der Zelle ohne komplexe biochemische Vorschriften. Die verwendete Technik kann eine hohe Ausbeute an Liposomen erzeugen und eine hohe Verkapselungseffizienz für Zytoskelettproteine aufweisen. Diese Maßnahme kann auf die Verkapselung einer Vielzahl von Proteinen und großen Objekten wie Mikropartikeln und selbstvorbereitenden Mikroschwimmern angewendet werden.Ein Individuum kämpft darum, die Liposomenausbeute für die ersten Versuche zu erhöhen. Es wird empfohlen, regelmäßig einen Abschnitt des Manuskripts zu diskutieren, um weitere Details zu erhalten, um die Ausbeute zu erhöhen. Zu Beginn wird der wässrige innere Nichtpolymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter hergestellt, indem 0,1 Millimolar CACL zwei, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 320 Millimolar Saccharose und 0,2 Millimolar ATP gemischt werden.Bereiten Sie die Proteinmischung vor, indem Sie Proteine in den inneren Nichtpolymerisationspuffer bei vier Grad Celsius geben. Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie der Proteinmischung 100 nanomolares Gellcalin, vier mikromolare Hustensäure und 2,2 mikromolare VCA HEZ hinzu. Als Kontrollexperiment ersetzen Sie die Proteinmischung durch 100 Mikrogramm pro Milliliter Fluoreszenzfarbstoff.Bereiten Sie den wässrigen inneren Polymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter durch Mischen von 100 Millimolarkaliumchlorid vor. Vier Millimolar Magnesiumchlorid, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DABCO, 10 Millimolar ATP und 80 Millimolar Saccharose. Bereiten Sie den endgültigen Puffer vor, indem Sie den inneren Nichtpolymerisationspuffer und den inneren Polymerisationspuffer in einem Volumenverhältnis von eins zu eins mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern zu erhalten, das im Liposom eingekapselt wird.Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer in einem Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern vor, indem Sie 10 Millimolar HEPES, 50 Millimolar Kaliumchlorid, zwei Millimolar Magnesiumchlorid, 0,2 Millimolar Calciumchlorid, zwei Millimolar ATP, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 212 Millimolar Glucose und 0,1 Milligramm pro Milliliter Beta-Gehäuse mischen. Um die Lipidölmischung vorzubereiten, beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Mikrolitern von 25 Milligramm pro Milliliter EGGPC in eine Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas und hinterlassen Sie einen trockenen festen Lipidfilm am Boden der Durchstechflasche.Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie Nickellipid in einem Verhältnis von 10 zu eins von EGGPC zu Nickellipid hinzu und mischen Sie es, bevor Chloroform verdampft wird. Fügen Sie zwei Milliliter Mineralöl hinzu. Verdampfen Sie das Chloroform und beschallen Sie die Lipidölmischung bei Raumtemperatur in einem Bad für eine Stunde, um die Lipide zu resuspendieren.Bereiten Sie eine abschließende Puffer-in-Öl-Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten. Beginnen Sie mit der Einnahme von 100 Mikrolitern der Lipidölmischung in einem Kunststoffröhrchen und fügen Sie der Lipidölmischung 10 Mikroliter Endpuffer hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich der letzte Puffer in einem Tröpfchen befindet.Ziehen Sie mit einer Glasspritze zuerst eine kleine Menge Lipidölgemisch und dann den endgültigen Puffertropfen, indem Sie die Spitze der Spritze an die Peripherie des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Mehrmals vorsichtig auf und ab saugen, bis sich eine trübe Emulsion bildet. Geben Sie 30 Mikroliter Außenpuffer in ein separates Kunststoffrohr.Legen Sie 30 Mikroliter der Lipidölmischung auf den äußeren Puffer und lassen Sie sie etwa 10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln. Um Liposomen herzustellen, fügen Sie vorsichtig 50 Mikroliter der endgültigen Pufferölemulsion in die oberste Ölphase des Röhrchens hinzu. Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren. Entfernen Sie vorsichtig die Ölphase, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.Schneiden Sie mit einer neuen Pipette die Spitze der Pipette ab. Stecken Sie die Pipette langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln. Gießen Sie 100 Mikroliter Außenpuffer in den Brunnen einer Inkubationskammer.Legen Sie die gesammelten Liposomen vorsichtig in den äußeren Puffer ab und legen Sie dann einen weiteren Abdeckstreifen auf die Kammer. Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Tauchobjektiv. Verwenden Sie 488, 647 und 561 Nanometer Laserlinien.Zur Beobachtung fluoreszierend markierter Lipide, verkapselter Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszenzmarkiertes Aktin. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIF-Format. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in Bild J.Start, indem Sie die TIF-Datei mit der Image J-Software öffnen.Gehe zum Bild und klicke dann auf "Anpassen". Passen Sie anschließend den Helligkeitskontrast an Helligkeit und Kontrast des Bildes an den gewünschten Maßstab an, indem Sie die minimalen und maximalen Einstellungen sowie die Helligkeits- und Kontrastregler anpassen. Klicken Sie auf das Rechteckauswahlwerkzeug in der Symbolleiste und wählen Sie den gewünschten Bereich aus.Gehen Sie zum Bild und klicken Sie dann auf Zuschneiden, um den ROI zu beschneiden. Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Maßstab festlegen. Geben Sie im Popup-Fenster 1,0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie Mikrometer als Längeneinheit fest.Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein. Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem ovalen Auswahlwerkzeug in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms.Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Messen, um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann. Die erfolgreiche Liposomenerzeugung wird durch die Visualisierung des dünnen kreisförmigen Rings, der grün fluoreszierenden Lipiddoppelschicht, verifiziert. Unter einem 488-Nanometer-Laser mit konfokaler Mikroskopie zur Bestätigung der Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs.Die innere Umgebung der Liposomen sollte unter einem 647-Nanometer-Laser gleichmäßig fluoreszierend sein. Die Bildung von Liposomen konnte durch die dünnen grünen kreisförmigen Ringe sichtbar gemacht werden. Die rekonstituierten Affekte in Netzwerken innerhalb von Liposomen sind heterogen und manifestieren sich als verzweigte Netzwerkstrukturen von Aktinfilamenten.Die Zweigarchitektur wurde durch die Einführung des ARP two three complex ausgelöst, der zusammen mit VCA HEZ gleichzeitig die Keimbildung und Verzweigung von Aktinfilamenten steuert. Am inneren Blättchen der Doppelschicht von Liposomen entsteht eine dünne, aber dicht verzweigte Aktinschicht, die als fluoreszierender Schicht sichtbar gemacht werden kann. Die Lipid-Audio-Endpuffermischung muss im Allgemeinen durch eine Glasspritze hin und her gepumpt werden, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden.Die Mischung muss nach dem Prozess weißlich sein. Diese Technik ebnete den Weg für den Aufbau eines Minimalmodells der Zelle, frei von komplexen biochemischen Vorschriften. Mit diesem zellnachahmenden System können Forscher die mechanischen und dynamischen Eigenschaften von Zytoskelettproteinen, Nukleator und molekularem Motor erforschen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Forschung

Biotechnik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

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Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

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Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...