Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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हम एमपीएम के लिए एआरओ मुरी डब्ल्यू 911 एनएफ-14-1-0403, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) आर 01 1 आर 01 जीएम 126256 से एमपीएम, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) यू 54 सीए 209992, एनआईएच आरओ 1 जीएम 126256, एनआईएच यू 54 सीए 209992, मिशिगन विश्वविद्यालय / इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों (ओं) की हैं और जरूरी नहीं कि एआरओ, एनआईएच या एचएफएसपी के विचारों को प्रतिबिंबित करें। एससी वी यादव, सी मुरेसन और एस अमीरी के साथ सार्थक चर्चा को स्वीकार करता है।

1. बफर और प्रोटीन समाधान की तैयारी
<ol><li>0.1 एमएम सीएसीएल 2, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 1 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम डाबको,320 एमएम सुक्रोज और 0.2 एमएम एटीपी को मिलाकर 5 एमएल की कुल मात्रा में जलीय इनर नॉन-पॉलिमराइजे?...

कई महत्वपूर्ण चरण तैयारी प्रक्रिया के दौरान लिपोसोम की उच्च उपज की सफलता का निर्धारण करते हैं। तेल में लिपिड फिल्म को पूरी तरह से भंग करने के लिए, नमूने को तब तक सोनीकेट किया जाना चाहिए जब तक कि कांच की श...

एक्टिन साइटोस्केलेटन आणविक स्तर के संकुचन और बल उत्पादन 1,2,3 का समन्वय करके सेल के इंट्रासेल्युलर आर्किटेक्चर के निर्माण में एक मौलिक भूमिका निभाता है। नतीजतन, यह कई आवश्यक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करता है, जिसमें सेल विरूपण 4,5, विभाजन6, माइग्रेशन 7,8 और आसंजन 9 शामिलहैं। एक्टिन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन ने हाल के वर्षों में 10,11,12,13,14,15,16,17 में जबरदस्त ध्यान आकर्षित किया है। पुनर्गठन का लक्ष्य जीवित कोशिकाओं के भीतर मौजूद जटिल जैव रासायनिक विनियमन से रहित सेल का एक न्यूनतम मॉडल बनाना है। यह विशिष्ट इंट्रासेल्युलर गतिविधियों की जांच करने के लिए एक नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करता है और एक्टिन साइटोस्केलेटन18,19 के विभिन्न घटकों की पहचान और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, लिपोसोम) के अंदर इन विट्रो एक्टिन नेटवर्क का एनकैप्सुलेशन अर्ध-पारगम्य सीमा के साथ एक सीमित लेकिन विकृत स्थान प्रदान करता है। यह सेल 9,20,21,22 के भीतर एक्टिन मशीनरी के शारीरिक और यांत्रिक सूक्ष्म वातावरण की नकल करता है।
लिपोसोम तैयार करने के विभिन्न तरीकों में, लिपिड फिल्म हाइड्रेशन विधि (जिसे सूजन विधि के रूप में भी जाना जाता है) सबसे शुरुआती तकनीकों में से एक है23. शुष्क लिपिड फिल्म बफ़र्स के अलावा हाइड्रेट करती है, जिससे झिल्लीदार बुलबुले बनते हैं जो अंततः पुटिका24 बन जाते हैं। उच्च उपज के साथ बड़े पुटिकाओं का उत्पादन करने के लिए, फिल्म हाइड्रेशन विधि से आगे बढ़ने वाली एक बेहतर विधि, जिसे इलेक्ट्रोफॉर्मेशन विधि 25 के रूप में जाना जाता है,जलयोजन प्रक्रिया 26 कोकुशलतापूर्वक बढ़ावा देने के लिए एक एसी विद्युत क्षेत्र लागू करता है। एक्टिन एनकैप्सुलेशन के लिए इन जलयोजन-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं यह हैं कि इसमें अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन की कम एनकैप्सुलेशन दक्षता है, और यह केवल विशिष्ट लिपिड रचनाओं के साथ संगत है24. उल्टे पायस तकनीक, तुलना में, लिपिड घटकों और प्रोटीन सांद्रता 20,27,28,29 के लिए कम सीमाएं हैं। इस विधि में, एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक जलीय बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में लिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है, जिससे लिपिड-मोनोलेयर बूंदें बनती हैं। मोनोलेयर लिपिड बूंदें तब बाइलेयर लिपिड पुटिकाओं (लिपोसोम्स) बनाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एक और लिपिड / यह तकनीक एक्टिन एनकैप्सुलेशन24,30 के लिए सबसे सफल रणनीतियों में से एक साबित हुई है। अलग-अलग, कुछ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विधियां हैं, जिनमें स्पंदित जेटिंग31,32, क्षणिक झिल्ली इजेक्शन33 और सीडीआईएएसई विधि34 शामिल हैं। उल्टे पायस विधि और माइक्रोफ्लुइडिक विधि के बीच समानताएं लिपिड विलायक (तेल) हैं जिनका उपयोग किया जाता है और लिपोसोम के बाहरी पत्रक के गठन के लिए लिपिड / इसके विपरीत, माइक्रोफ्लुइडिक विधि द्वारा लिपोसोम की पीढ़ी को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के सेट-अप की आवश्यकता होती है और बाइलेयर के दो पत्रकों के बीच फंसे तेल के साथ होता है, जिसके लिए तेल हटाने के लिए एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है35.
इस पांडुलिपि में, हमने एक बहुलकीकृत एफ-एक्टिन नेटवर्क को एनकैप्सुलेट करने वाले लिपोसोम तैयार करने के लिए उल्टे पायस तकनीक का उपयोग किया जैसा कि पहले22 उपयोग किया गया था। एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन मिश्रण को पहले एक बफर में रखा गया था जिसमें एक्टिन को अपने गोलाकार (जी) रूप में बनाए रखने के लिए गैर-बहुलक स्थितियां थीं। प्रारंभिक एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर की गई थी, जिसे बाद में नमूने को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति देकर ट्रिगर किया गया था। एक बार कमरे के तापमान पर, एक्टिन अपने फिलामेंटस (एफ) रूप में पॉलीमराइज़ करता है। प्रोटीन कार्यक्षमताओं और गुणों का अध्ययन करने के लिए आंतरिक जलीय बफर समाधान में विभिन्न प्रकार के एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन जोड़े जा सकते हैं, इस प्रकार, एक्टिन नेटवर्क और झिल्ली की सतह के साथ इसकी बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इस विधि को ब्याज के विभिन्न प्रोटीनों के एनकैप्सुलेशन पर भी लागू किया जा सकताहै 36 और बड़ी वस्तुओं (माइक्रोपार्टिकल्स, स्व-चालित माइक्रोस्विमर्स, आदि) अंतिम लिपोसोम28,37 के आकार के करीब।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

एक्टिन साइटोस्केलेटन, कोशिका में प्रमुख यांत्रिक मशीनरी, कोशिका विरूपण, विभाजन, प्रवास और आसंजन सहित कई आवश्यक शारीरिक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करती है। हालांकि, विवो में एक्टिन नेटवर्क की गतिशीलता और संरचना का अध्ययन करना जीवित कोशिकाओं के भीतर जैव रासायनिक और आनुवंशिक विनियमन से जटिल है। इंट्रासेल्युलर जैव रासायनिक विनियमन से रहित एक न्यूनतम मॉडल बनाने के लिए, एक्टिन को विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) के अंदर समझाया जाता है। बायोमिमेटिक लिपोसोम कोशिका के आकार के होते हैं और साइटोस्केलेटन नेटवर्क के यांत्रिक और गतिशील गुणों में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करते हैं, जो नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक व्यवहार्य मार्ग खोलते हैं। एनकैप्सुलेशन के लिए लिपोसोम उत्पन्न करने के लिए, उल्टे पायस विधि (जिसे इमल्शन ट्रांसफर विधि भी कहा जाता है) का उपयोग किया जाता है, जो विभिन्न सेल-नकल प्रणालियों को तैयार करने के लिए लिपोसोम में जटिल समाधानों को एनकैप्सुलेट करने के लिए सबसे सफल तकनीकों में से एक है। इस विधि के साथ, ब्याज के प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में मोनोलेयर लिपिड बूंदों को बनाने के लिए फॉस्फोलिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है। वांछित लिपोसोम मोनोलेयर लिपिड बूंदों से उत्पन्न होते हैं जो लिपिड / तेल-पानी इंटरफ़ेस को पार करते हैं। यह विधि वांछित लिपिड घटकों के साथ लिपोसोम में केंद्रित एक्टिन पॉलिमर के एनकैप्सुलेशन को सक्षम बनाती है, जिससे बायोमिमिकिंग साइटोस्केलेटन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन का मार्ग प्रशस्त होता है।

उल्टे पायस तकनीक के आधार पर लिपोसोम की तैयारी चित्रा 1 में ग्राफिक और योजनाबद्ध रूप से सचित्र है।
सबसे पहले, खाली (नंगे) लिपोसोम (~ 5-50 μm व्यास) जो फॉस्फोलिपिड (ईपीसी) और फ्लोरोसेंट लिप?...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

इस पांडुलिपि में, हम एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटन को विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं (जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) में समाहित करने के लिए प्रयोगात्मक तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं, और लिपोसोम झिल्ली के आंतरिक पत्रक पर एक कॉर्टेक्स-बायोमिमिकिंग एफ-एक्टिन परत बनाने की विधि।

इन विट्रो में विशालकाय यूनिलामेलर पुटिकाओं के अंदर एक्टिन साइटोस्केलेटन का पुनर्गठन

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

यह उपाय जटिल जैव रासायनिक नियमों से रहित सेल का एक न्यूनतम मॉडल बनाता है। उपयोग की जाने वाली तकनीक लिपोसोम की उच्च उपज उत्पन्न कर सकती है और साइटोस्केलेटन प्रोटीन के लिए उच्च एनकैप्सुलेशन क्षमता है। इस उपाय को विभिन्न प्रकार के प्रोटीन और बड़ी वस्तुओं जैसे सूक्ष्म कणों और स्वयं तैयार करने वाले सूक्ष्म तैराकों के एनकैप्सुलेशन पर लागू किया जा सकता है।एक व्यक्ति पहले कई प्रयासों के लिए लिपोसोम उपज बढ़ाने के लिए संघर्ष कर रहा है। उपज बढ़ाने के लिए अधिक जानकारी के लिए पांडुलिपि के अनुभाग पर नियमित रूप से चर्चा करने की सिफारिश की जाती है। शुरू करने के लिए, 0.1 मिलीमोलर सीएसीएल दो, 10 मिलीमोलर एचईपीईएस, एक मिलीमोलर डीटीटी, 0.5 मिलीमोलर डीएपीसीओ, 320 मिलीमोलर सुक्रोज और 0.2 मिलीमोलर एटीपी को मिलाकर पांच मिलीलीटर की कुल मात्रा में जलीय आंतरिक गैर पोलीमराइजेशन बफर तैयार करें।चार डिग्री सेल्सियस पर आंतरिक गैर पोलीमराइजेशन बफर में प्रोटीन जोड़कर प्रोटीन मिश्रण तैयार करें। एक्टिन परत बनाने के लिए, प्रोटीन मिश्रण में 100 नैनोमोलर गेलकालिन, चार माइक्रोमोलर कफलिन और 2.2 माइक्रोमोलर वीसीए एचईजेड जोड़ें। एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, प्रोटीन मिश्रण को 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर फ्लोरोसेंट डाई के साथ बदलें।100 मिलीमोलर पोटेशियम क्लोराइड को मिलाकर पांच मिलीलीटर की कुल मात्रा में जलीय आंतरिक पोलीमराइजेशन बफर तैयार करें। चार मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 मिलीमोलर एचईपीईएस, एक मिलीमोलर डीटीटी, 0.5 मिलीमोलर डीएबीसीओ, 10 मिलीमोलर एटीपी और 80 मिलीमोलर सुक्रोज। आंतरिक गैर पोलीमराइजेशन बफर और आंतरिक पोलीमराइजेशन बफर को एक से एक की मात्रा अनुपात में मिलाकर अंतिम बफर तैयार करें, ताकि लिपोसोम के भीतर एनकैप्सुलेटेड 30 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में आंतरिक जलीय घोल का उत्पादन किया जा सके।10 मिलीमोलर एचईपीईएस, 50 मिलीमोलर पोटेशियम क्लोराइड, दो मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड, 0.2 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड, दो मिलीमोलर एटीपी, एक मिलीमोलर डीटीटी, 0.5 मिलीमोलर डीएपीसीओ, 212 मिलीमोलर ग्लूकोज और 0.1 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बीटा आवरण को मिलाकर 150 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में जलीय बाहरी बफर तैयार करें। लिपिड तेल मिश्रण तैयार करने के लिए, एक कांच की शीशी में 25 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर ईजीजीपीसी के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर शुरू करें। शीशी के तल पर एक सूखी ठोस लिपिड फिल्म छोड़कर आर्गन गैस के साथ क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें।एक्टिन परत बनाने के लिए, क्लोरोफॉर्म के वाष्पीकरण से पहले निकल लिपिड को ईजीजीपीसी के 10 से एक अनुपात में निकल लिपिड जोड़ें और मिश्रण करें। दो मिलीलीटर खनिज तेल डालें। क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें और लिपिड को फिर से निलंबित करने के लिए एक घंटे के लिए स्नान में कमरे के तापमान पर लिपिड तेल मिश्रण को सोनीकेट करें।ब्याज के प्रोटीन युक्त मोनोलेयर लिपिड बूंदों को तैयार करने के लिए तेल पायस में एक अंतिम बफर तैयार करें। प्लास्टिक ट्यूब में लिपिड तेल मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर लेने से शुरू करें और लिपिड तेल मिश्रण में अंतिम बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि अंतिम बफर एक बूंद में है।एक ग्लास सिरिंज का उपयोग करके पहले लिपिड तेल मिश्रण की एक छोटी मात्रा खींचें और फिर छोटी बूंदों में तोड़ने के लिए छोटी बूंद की परिधि में सिरिंज की नोक रखकर अंतिम बफर बूंद। धीरे-धीरे कई बार ऊपर और नीचे की आकांक्षा करें जब तक कि बादल इमल्शन न बन जाए। एक अलग प्लास्टिक ट्यूब में बाहरी बफर के 30 माइक्रोलीटर रखो।बाहरी बफर के शीर्ष पर लिपिड तेल मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर रखें और इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर विकसित करने के लिए इसे लगभग 10 मिनट तक बैठने दें। लिपोसोम तैयार करने के लिए, ट्यूब के शीर्ष तेल चरण में अंतिम बफर तेल पायस के 50 माइक्रोलीटर सावधानीपूर्वक जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100 गुना जी पर प्लास्टिक ट्यूब अपकेंद्रित्र।लिपोसोम गठन के लिए अनुकूलित करने के लिए समय और सेंट्रीफ्यूजेशन गति बदलें। ध्यान से विंदुक आकांक्षा अतिरिक्त मात्रा द्वारा तेल चरण को हटा दें यदि आवश्यक हो। सुनिश्चित करें कि लिपोसोम चरण के शीर्ष पर तेल का मेनिस्कस बनाने से बचने के लिए ट्यूब के किनारे पिपेट टिप न डालें।एक नए विंदुक के साथ, विंदुक की नोक में कटौती। धीरे-धीरे शेष निचले चरण में पिपेट छड़ी और लिपोसोम इकट्ठा करने के लिए जलीय मात्रा की आकांक्षा। एक इनक्यूबेशन कक्ष के कुएं में बाहरी बफर के 100 माइक्रोलीटर डालो।धीरे-धीरे एकत्रित लिपोसोम को बाहरी बफर में जमा करें और फिर कक्ष के शीर्ष पर एक और कवर पर्ची रखें। एक 63 एक्स तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ लिपोसोम का निरीक्षण करें। 488, 647 और 561 नैनोमीटर लेजर लाइनों का उपयोग करें।फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिपिड का निरीक्षण करने के लिए, क्रमशः फ्लोरोसेंट डाई और एनकैप्सुलेटेड फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन। ब्याज के फ्रेम पर कब्जा और टीआईएफ प्रारूप में छवियों को बचाने के लिए। छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टीआईएफ फ़ाइल खोलकर छवि जे.स्टार्ट में छवियों को संसाधित और विश्लेषण करें।छवि पर जाएं, फिर समायोजित करें पर क्लिक करें। चमक कंट्रास्ट के बाद, न्यूनतम और अधिकतम सेटिंग्स और चमक और कंट्रास्ट स्लाइडर्स को समायोजित करके वांछित पैमाने पर छवि की चमक और विपरीत समायोजित करें। टूलबार में आयत चयन उपकरण पर क्लिक करें और ब्याज के क्षेत्र का चयन करें।छवि पर जाएं, फिर आरओआई को क्रॉप करने के लिए क्रॉप पर क्लिक करें। विश्लेषण करने के लिए जाएं, फिर स्केल सेट करें पर क्लिक करें। पॉप अप विंडो में, पिक्सेल पहलू अनुपात फ़ील्ड में 1.0 दर्ज करें और माइक्रोमीटर को लंबाई की इकाई के रूप में सेट करें।पिक्सेल फ़ील्ड में दूरी में, पिक्सेल में छवि चौड़ाई दर्ज करें। ज्ञात दूरी क्षेत्र में, माइक्रोन में वास्तविक छवि चौड़ाई दर्ज करें। टूलबार में अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग करके, लिपोसोम के आकार को मापने के लिए, लिपोसोम के किनारे के साथ एक सर्कल खींचें।विश्लेषण करने के लिए जाएं, फिर सर्कल के क्षेत्र को मापने के लिए माप पर क्लिक करें, जिसमें से लिपोसोम के व्यास की गणना की जा सकती है। सफल लिपोसोम पीढ़ी पतली परिपत्र अंगूठी के दृश्य के माध्यम से सत्यापित की जाती है जो हरे फ्लोरोसेंट लिपिड बाइलेयर है। फ्लोरोसेंट डाई के एनकैप्सुलेशन की पुष्टि करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 488 नैनोमीटर लेजर के तहत।लिपोसोम का आंतरिक वातावरण 647 नैनोमीटर लेजर के तहत समान रूप से फ्लोरोसेंट होना चाहिए। लिपोसोम के गठन को पतले हरे रंग के गोलाकार छल्ले द्वारा देखा जा सकता है। लिपोसोम के अंदर नेटवर्क में पुनर्गठित प्रभाव विषम हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स की शाखित नेटवर्क संरचनाओं के रूप में प्रकट होते हैं।शाखा वास्तुकला को एआरपी दो तीन परिसर की शुरूआत से ट्रिगर किया गया था, जो एक साथ वीसीए एचईजेड के साथ एक्टिन फिलामेंट्स के न्यूक्लिएशन और ब्रांचिंग को नियंत्रित करता है। एक पतली, लेकिन घनी शाखित एक्टिन परत लिपोसोम के बाइलेयर के आंतरिक पत्रक पर बनाई जाती है जिसे फ्लोरोसेंट के रूप में देखा जा सकता है। लिपिड ऑडियो अंतिम बफर मिश्रण को आम तौर पर एक ग्लास सिरिंज के माध्यम से आगे और पीछे पंप किया जाना चाहिए, ताकि हवा के बुलबुले पेश करने से बचा जा सके।प्रक्रिया के बाद मिश्रण सफेद होना चाहिए। इस तकनीक ने जटिल जैव रासायनिक नियमों से रहित सेल के न्यूनतम मॉडल के निर्माण का मार्ग प्रशस्त किया। इस सेल नकल प्रणाली के साथ शोधकर्ता साइटोस्केलेटन प्रोटीन, न्यूक्लिएटर और आणविक मोटर के यांत्रिक और गतिशील गुणों का पता लगा सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

सेलुलर Mimics के निर्माण के लिए vesicles में सेल मुक्त ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद मशीनरी की इनकैप्सुलेशन

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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