Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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Riconosciamo il finanziamento di ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) numero di sovvenzione RGY0073/2018 a M.P.M. Qualsiasi opinione, risultato, conclusione o raccomandazione espressa in questo materiale è quella degli autori e non riflette necessariamente le opinioni di ARO, NIH o HFSP. S.C. riconosce le fruttuose discussioni con V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche
<ol><li>Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e0,2 mM ATP.</li>
	<li>Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei ...

Diversi passaggi chiave determinano il successo di un'alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell'olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente29. La miscela ...

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell'architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza 1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare4,5, la divisione6, la migrazione 7,8 e l'adesione9. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guadagnato enorme attenzione negli ultimi anni 10,11,12,13,14,15,16,17. L'obiettivo della ricostituzione è quello di costruire un modello minimo della cellula privo della complessa regolazione biochimica che esiste all'interno delle cellule vive. Ciò offre un ambiente controllabile per sondare specifiche attività intracellulari e facilita l'identificazione e l'analisi di diversi componenti del citoscheletro di actina18,19. Inoltre, l'incapsulamento di reti di actina in vitro all'interno di vescicole unilamellari giganti fosfolipidi (GUV, liposomi) fornisce uno spazio confinato ma deformabile con un confine semipermeabile. Imita il microambiente fisiologico e meccanico del macchinario dell'actina all'interno della cellula 9,20,21,22.
Tra i vari metodi per preparare i liposomi, il metodo di idratazione del film lipidico (noto anche come metodo del gonfiore) è una delle prime tecniche23. Il film lipidico secco idrata con l'aggiunta di tamponi, formando bolle membranose che alla fine diventano vescicole24. Per produrre vescicole più grandi con una resa più elevata, un metodo migliorato che avanza dal metodo di idratazione del film, noto come metodo di elettroformazione25, applica un campo elettrico CA per promuovere in modo efficiente il processo di idratazione26. I principali limiti di questi metodi basati sull'idratazione per l'incapsulamento di actina sono che ha una bassa efficienza di incapsulamento di proteine altamente concentrate ed è compatibile solo con specifiche composizioni lipidiche24. La tecnica dell'emulsione invertita, in confronto, ha meno limitazioni per i componenti lipidici e le concentrazioni proteiche20,27,28,29. In questo metodo, una miscela di proteine per l'incapsulamento viene aggiunta al tampone acquoso interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente lipidi, formando goccioline monostrato lipidiche. Le goccioline lipidiche monostrato attraversano quindi un'altra interfaccia lipide/olio-acqua attraverso la centrifugazione per formare vescicole lipidiche a doppio strato (liposomi). Questa tecnica ha dimostrato di essere una delle strategie di maggior successo per l'incapsulamento di actina24,30. Separatamente, ci sono alcuni metodi di dispositivi microfluidici, tra cui il getto pulsato 31,32, l'espulsione transitoria della membrana33 e il metodo cDICE34. Le somiglianze tra il metodo dell'emulsione invertita e il metodo microfluidico sono il solvente lipidico (olio) utilizzato e l'introduzione dell'interfaccia lipide/olio-acqua per la formazione del foglietto esterno dei liposomi. Al contrario, la generazione di liposomi con il metodo microfluidico richiede una messa a punto di dispositivi microfluidici ed è accompagnata da olio intrappolato tra i due lembi del doppio strato, che richiede un passaggio supplementare per la rimozione dell'olio35.
In questo manoscritto, abbiamo usato la tecnica dell'emulsione invertita per preparare liposomi che incapsulano una rete polimerizzata F-actina come usato in precedenza22. La miscela proteica per l'incapsulamento è stata prima posta in un tampone con condizioni non polimerizzanti per mantenere l'actina nella sua forma globulare (G). L'intero processo è stato eseguito a 4 °C per prevenire la polimerizzazione precoce dell'actina, che è stata successivamente innescata consentendo al campione di riscaldarsi a temperatura ambiente. Una volta a temperatura ambiente, l'actina polimerizza nella sua forma filamentosa (F). Una varietà di proteine leganti l'actina può essere aggiunta alla soluzione tampone acquosa interna per studiare le funzionalità e le proprietà delle proteine, fornendo così ulteriori informazioni sulla sua interazione con la rete di actina e la superficie della membrana. Questo metodo può essere applicato anche all'incapsulamento di varie proteine di interesse36 e oggetti di grandi dimensioni (microparticelle, micronuotatori semoventi, ecc.) vicini alla dimensione dei liposomi finali 28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l'adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all'interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l'actina viene incapsulata all'interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l'incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell'emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell'emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un'interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l'incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.

La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1.
In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all'interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella per...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Questa misura costruisce un modello minimo della cellula privo di complesse regolazioni biochimiche. La tecnica utilizzata può generare un'elevata resa di liposomi e avere elevate efficienze di incapsulamento per le proteine del citoscheletro. Questa misura può essere applicata all'incapsulamento di varietà di proteine e oggetti di grandi dimensioni come microparticelle e micro nuotatori auto-preparanti.Un individuo sta lottando aumentando la resa liposomica per i primi tentativi. Si raccomanda di discutere regolarmente la sezione del manoscritto per maggiori dettagli per aumentare la resa. Per iniziare, preparare il tampone acquoso interno non polimerizzante in un volume totale di cinque millilitri mescolando 0,1 millimolari CACL due, 10 millimolari HEPES, un millimolare DTT, 0,5 millimolare DAPCO, 320 millimolare di saccarosio e 0,2 millimolare ATP.Preparare il mix proteico aggiungendo proteine al tampone interno di non polimerizzazione a quattro gradi Celsius. Per formare uno strato di actina, aggiungere 100 gellcalina nanomolare, quattro tossialina micromolare e 2,2 micromolari VCA HEZ al mix proteico. Come esperimento di controllo, sostituire la miscela proteica con 100 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente.Preparare il tampone di polimerizzazione interno acquoso in un volume totale di cinque millilitri mescolando 100 millimolari di cloruro di potassio. Quattro cloruro di magnesio millimolare, HEPES 10 millimolare, un DTT millimolare, DABCO 0,5 millimolare, ATP 10 millimolare e saccarosio 80 millimolare. Preparare il tampone finale mescolando tampone interno non polimerizzante e tampone interno di polimerizzazione con un rapporto volumetrico di uno a uno, per ottenere la soluzione acquosa interna in un volume totale di 30 microlitri che sarà incapsulato all'interno del liposoma.Preparare il tampone esterno acquoso in un volume totale di 150 microlitri mescolando 10 millimolari HEPES, 50 millimolari cloruro di potassio, due millimolari cloruro di magnesio, 0,2 millimolare di cloruro di calcio, due millimolari ATP, un millimolare DTT, 0,5 millimolare DAPCO, 212 millimolare di glucosio e 0,1 milligrammi per millilitro di involucro beta. Per preparare la miscela di olio lipidico, iniziare aggiungendo 100 microlitri di 25 milligrammi per millilitri EGGPC in una fiala di vetro. Evaporare il cloroformio con gas argon lasciando un film lipidico solido secco sul fondo del flaconcino.Per formare uno strato di actina, aggiungere lipidi di nichel con un rapporto di 10 a uno di EGGPC con lipidi di nichel e mescolare, prima dell'evaporazione del cloroformio. Aggiungere due millilitri di olio minerale. Far evaporare il cloroformio e sonicare la miscela di olio lipidico a temperatura ambiente in un bagno per un'ora, per risospendere i lipidi.Preparare un tampone finale in emulsione oleosa per la preparazione di goccioline lipidiche monostrato contenenti la proteina di interesse. Inizia prendendo 100 microlitri della miscela di olio lipidico in un tubo di plastica e aggiungi 10 microlitri di tampone finale alla miscela di olio lipidico. Assicurarsi che il buffer finale sia in una goccia.Utilizzando una siringa di vetro aspirare prima una piccola quantità di miscela di olio lipidico e poi la goccia tampone finale posizionando la punta della siringa alla periferia della goccia per romperla in minuscole goccioline. Aspirare delicatamente su e giù più volte fino a formare un'emulsione torbida. Mettere 30 microlitri di tampone esterno in un tubo di plastica separato.Posizionare 30 microlitri della miscela di olio lipidico sopra il tampone esterno e lasciarlo riposare per circa 10 minuti per sviluppare un monostrato lipidico all'interfaccia. Per preparare i liposomi, aggiungere con attenzione 50 microlitri dell'emulsione finale di olio tampone, alla fase superiore dell'olio del tubo. Centrifugare il tubo di plastica a 100 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Variare il tempo e la velocità di centrifugazione, per ottimizzare la formazione dei liposomi. Rimuovere con cautela la fase dell'olio aspirando il volume supplementare della pipetta, se necessario. Assicurarsi di non mettere la punta della pipetta sul lato del tubo per evitare di creare un menisco di olio sopra la fase liposomica.Con una nuova pipetta, tagliare la punta della pipetta. Inserire lentamente la pipetta nella fase inferiore rimanente e aspirare il volume acquoso per raccogliere i liposomi. Versare 100 microlitri di tampone esterno nel pozzetto di una camera di incubazione.Depositare delicatamente i liposomi raccolti nel tampone esterno e quindi posizionare un altro vetrino di copertura sulla parte superiore della camera. Osservare i liposomi con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63x. Utilizzare linee laser a 488, 647 e 561 nanometri.Per osservare rispettivamente lipidi marcati fluorescenti, colorante fluorescente incapsulato e actina incapsulata con fluorescenza. Cattura i fotogrammi di interesse e salva le immagini in formato TIF. Elabora e analizza le immagini nell'immagine J.Start aprendo il file TIF, utilizzando il software immagine J.Vai all'immagine, quindi fai clic su Regola. Seguito dal contrasto della luminosità, regola la luminosità e il contrasto dell'immagine alla scala desiderata regolando le impostazioni minime e massime e i cursori di luminosità e contrasto. Fare clic sullo strumento di selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e selezionare la regione di interesse.Vai all'immagine, quindi fai clic su Ritaglia per ritagliare il ROI. Vai su analizza, quindi fai clic su imposta scala. Nella finestra pop-up, inserisci 1.0 nel campo delle proporzioni pixel e imposta micrometro come unità di lunghezza.Nel campo Distanza in pixel, immettere la larghezza dell'immagine in pixel. Nel campo Distanza nota, inserisci la larghezza effettiva dell'immagine in micron. Per misurare la dimensione del liposoma, utilizzando lo strumento di selezione ovale nella barra degli strumenti, disegnare un cerchio lungo il bordo del liposoma.Vai ad analizzare, quindi fai clic su misura, per misurare l'area del cerchio, da cui è possibile calcolare il diametro del liposoma. Il successo della generazione di liposomi viene verificato attraverso la visualizzazione del sottile anello circolare che è il doppio strato lipidico fluorescente verde. Sotto un laser a 488 nanometri utilizzando la microscopia confocale per confermare l'incapsulamento del colorante fluorescente.L'ambiente interno dei liposomi dovrebbe essere uniformemente fluorescente sotto un laser a 647 nanometri. La formazione di liposomi potrebbe essere visualizzata dai sottili anelli circolari verdi. Gli effetti ricostituiti nelle reti all'interno dei liposomi sono eterogenei, manifestandosi come strutture reticolari ramificate di filamenti di actina.L'architettura del ramo è stata innescata dall'introduzione del complesso ARP due tre, che controlla simultaneamente la nucleazione e la ramificazione dei filamenti di actina, insieme a VCA HEZ. Uno strato di actina sottile, ma densamente ramificato, viene creato sul foglietto interno del doppio strato di liposomi che può essere visualizzato come un mosto fluorescente. La miscela tampone finale audio lipidico deve essere generalmente pompata avanti e indietro attraverso una siringa di vetro, per evitare l'introduzione di bolle d'aria.La miscela deve essere biancastra dopo il processo. Questa tecnica ha aperto la strada alla costruzione di un modello minimale della cellula, privo di complesse regolazioni biochimiche. Con questo sistema di imitazione cellulare i ricercatori possono esplorare le proprietà meccaniche e dinamiche delle proteine del citoscheletro, del nucleatore e del motore molecolare.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Ricerca

Bioingegneria

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

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