Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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我々は、ARO MURI W911NF-14-1-0403 to M.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)R01 1R01GM126256からM.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、ミシガン大学/ジェネンテック、SUBK00016255及びヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)の助成金番号RGY0073/2018からM.P.M.への資金提供を認める。この資料に記載されている意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもARO、NIH、またはHFSPの見解を反映するものではありません。S.C.は、V.ヤダヴ、C.ムレサン、S.アミリとの実りある議論を認める。

1. 緩衝液およびタンパク質溶液の調製
<ol><li>0.1 mM CaCl 2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、320 mM スクロース、および 0.2 mM ATP を混合して、全容量 5 mL の水性内部非重合 (INP) バッファーを調製します。</li>
	<li>タンパク質ミックス(PM)を調製するには、11.2 μM 非蛍光 G-アクチン、2.8 μM 蛍光標識アクチン、および 0.24 μM Arp2/3 (材料表) の濃度で INP バッファー?...

いくつかの重要なステップは、調製プロセス中の高収率のリポソームの成功を決定する。油中の脂質膜を完全に溶解するには、ガラスバイアルの底部の脂質膜が完全に消失するまでサンプルを超音波処理しなければならない。超音波処理の後、脂質 - 油混合物は、脂質分子がさらに分散するために暗条件下で室温で一晩保存されなければならない29。混合物は、4°Cで最大1週...

アクチン細胞骨格は、分子レベルの収縮性と力発生1,2,3を調整することによって、細胞の細胞内構造を構築する上で基本的な役割を果たす。その結果、細胞変形4、5、分裂6、遊走7、8、および接着9を含む多数の重要な細胞活動を媒介する。アクチンネットワークのインビトロ再構成は、近年10、11、12、13、14、15、16、17で大きな注目を集めている。再構成の目標は、生細胞内に存在する複雑な生化学的調節を欠いている細胞の最小モデルを構築することである。これは、特定の細胞内活動をプローブするための制御可能な環境を提供し、アクチン細胞骨格18、19の異なる成分の同定および分析を容易にする。さらに、リン脂質巨大単層小胞(GUV、リポソーム)内のインビトロアクチンネットワークのカプセル化は、半透過性の境界を有する閉じ込められたが変形可能な空間を提供する。細胞9、20、21、22内のアクチン機構の生理学的および機械的微小環境を模倣する。
リポソームを調製するための様々な方法の中で、脂質膜水和法(膨潤法としても知られる)は、最も初期の技術の1つである23。乾燥脂質膜は、緩衝液を添加して水和し、膜状の気泡を形成し、最終的に小胞24となる。より大きな小胞をより高い収率で製造するために、電形成法25として知られる膜水和法から進歩する改良された方法は、交流電界を印加して水和プロセス26を効率的に促進する。アクチン封入のためのこれらの水和ベースの方法の主な制限は、高濃度タンパク質のカプセル化効率が低く、かつ特定の脂質組成物とのみ適合性があることである24。この反転エマルジョン技術は、比較して、脂質成分およびタンパク質濃度に対する制限が少ない20、27、28、29である。この方法では、カプセル化のためのタンパク質の混合物が内部水性緩衝液に添加され、これは後で脂質含有鉱物油溶液中で乳化され、脂質単層液滴を形成する。次いで、単層脂肪滴は、遠心分離を介して別の脂質/油水界面を通過し、二重層脂質小胞(リポソーム)を形成する。この技術は、アクチンカプセル化のための最も成功した戦略の1つであることが証明されています24,30。これとは別に、パルス噴出31、32、過渡膜噴出33、およびcDICE法34を含むいくつかのマイクロ流体デバイス法がある。逆乳化法とマイクロ流体法の類似点は、利用される脂質溶媒(油)と、リポソームの外側小葉の形成のための脂質/油水界面の導入である。対照的に、マイクロ流体法によるリポソームの生成は、マイクロ流体デバイスのセットアップを必要とし、二重層の2つの小葉の間に閉じ込められた油を伴い、これは、油除去のための余分なステップを必要とする35。
この原稿では、以前に使用したように、逆エマルジョン技術を使用して、重合F-アクチンネットワークを封入したリポソームを調製した22。封入用のタンパク質混合物を、まず、アクチンをその球状(G)形態に維持するために、非重合条件を有する緩衝液に入れた。初期のアクチン重合を防ぐために、全プロセスを4°Cで実施し、後にサンプルを室温まで昇温させることによって引き起こされた。室温で一旦、アクチンは重合して糸状(F)形態になる。様々なアクチン結合タンパク質を内部水性緩衝液に添加して、タンパク質の機能性および特性を研究することができ、したがって、アクチンネットワークおよび膜表面との相互作用に関する洞察をさらに提供する。この方法は、最終リポソーム28、37のサイズに近い目的の様々なタンパク質36および大きな物体(微粒子、自走式マイクロスイマーなど)の封入にも適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

細胞内の主要な機械的機構であるアクチン細胞骨格は、細胞の変形、分裂、遊走、および接着を含む多数の重要な物理的細胞活動を媒介する。しかし、 インビボ でのアクチンネットワークのダイナミクスと構造の研究は、生細胞内の生化学的および遺伝的調節によって複雑になる。細胞内生化学的調節を欠いた最小モデルを構築するために、アクチンは巨大な単層小胞(GUV、リポソームとも呼ばれる)の内部に封入される。生体模倣リポソームは細胞サイズであり、細胞骨格ネットワークの機械的および動的特性に対する定量的洞察を容易にし、ボトムアップ合成生物学のための実行可能なルートを開く。封入用のリポソームを生成するために、反転エマルジョン法(エマルジョン移動法とも呼ばれる)が利用され、これは複雑な溶液をリポソームに封入して様々な細胞模倣系を調製するための最も成功した技術の1つである。この方法では、目的のタンパク質の混合物を内部緩衝液に添加し、これを後でリン脂質含有鉱物油溶液に乳化させて単層脂肪滴を形成する。所望のリポソームは、脂質/油水界面を横切る単層脂肪滴から生成される。この方法は、所望の脂質成分を含むリポソームへの濃縮アクチンポリマーのカプセル化を可能にし、生体模倣細胞骨格ネットワークの in vitro 再構成への道を開く。

反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製を、 図1にグラフィカルかつ概略的に例示する。
まず、リン脂質(EPC)および蛍光脂質(DHPE)で構成された空(ベア)リポソーム(直径約5〜50μm)を調製した。対照実験として、明るい遠赤色蛍光色素を裸のリポソーム内に封入した。液滴の周囲に脂質単層が首尾よく形成されたかどうかは、図...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

この尺度は、複雑な生化学的調節を欠く細胞の最小モデルを構築する。使用される技術は、リポソームの高収率を生成し、細胞骨格タンパク質に対して高いカプセル化効率を有することができる。この対策は、さまざまなタンパク質や、微粒子や自己準備マイクロスイマーなどの大きな物体のカプセル化に適用できます。個人は、最初の数回の試みでリポソーム収量を増やすのに苦労しています。歩留まりを上げるために、原稿のセクションを定期的に議論して詳細を確認することをお勧めします。はじめに、0.1ミリモルのCACL2種、10ミリモルのHEPES、1ミリモルのDTT、0.5ミリモルのDAPCO、320ミリモルのスクロース、および0.2ミリモルのATPを混合することにより、水性内部非重合緩衝液を総容量5ミリリットルで調製する。摂氏4度で内側の非重合バッファーにタンパク質を添加して、タンパク質ミックスを調製します。アクチン層を形成するには、100ナノモルのゲルカリン、4マイクロモルのコファリン、および2.2マイクロモルのVCA HEZをタンパク質ミックスに加えます。対照実験として、タンパク質混合物を1ミリリットル当たり100マイクログラムの蛍光色素に置き換えます。100ミリモルの塩化カリウムを混合することにより、全量5ミリリットルの水性内部重合緩衝液を調製する。4ミリモル塩化マグネシウム、10ミリモルHEPES、1ミリモルDTT、0.5ミリモルDABCO、10ミリモルATPおよび80ミリモルスクロース。内部非重合緩衝液と内部重合緩衝液を1対1の容量比で混合して最終緩衝液を調製し、リポソーム内に封入されることになる総容量30マイクロリットルの内水溶液を得た。10ミリモルのHEPES、50ミリモルの塩化カリウム、2ミリモルの塩化マグネシウム、0.2ミリモルの塩化カルシウム、2ミリモルのATP、1ミリモルのDTT、0.5ミリモルのDAPCO、212ミリモルのグルコースおよび0.1ミリグラム/ミリリットルのベータケーシングを混合することにより、総容量150マイクロリットルの水性外部緩衝液を調製する。脂質油混合物を調製するには、1ミリリットルあたり25ミリグラムの100マイクロリットルをガラスバイアルに加えることから始めます。アルゴンガスでクロロホルムを蒸発させ、バイアルの底に乾燥した固体脂質フィルムを残します。アクチン層を形成するには、クロロホルムを蒸発させる前に、EGGPCとニッケル脂質の比率を10対1の割合でニッケル脂質を加えて混合します。2ミリリットルの鉱油を加える。クロロホルムを蒸発させ、脂質を再懸濁するために、浴中で室温で脂質油混合物を1時間超音波処理する。目的のタンパク質を含む単層脂肪滴を調製するための油エマルジョン中の最終バッファーを調製する。まず、100マイクロリットルの脂質油混合物をプラスチックチューブに入れ、10マイクロリットルの最終バッファーを脂質油混合物に加えます。最終バッファーが 1 つの液滴に入っていることを確認します。ガラスシリンジを使用して、最初に少量の脂質オイル混合物を吸引し、次にシリンジの先端を液滴の周囲に配置して小さな液滴に分解することにより、最終的なバッファー液滴を吸引します。濁ったエマルジョンが形成されるまで、上下に複数回穏やかに吸引します。30マイクロリットルの外部バッファーを別のプラスチックチューブに入れます。30マイクロリットルの脂質オイル混合物を外側のバッファーの上に置き、約10分間放置して、界面に脂質単層を発達させます。リポソームを調製するには、50マイクロリットルの最終バッファーオイルエマルジョンをチューブの上部油相に注意深く加えます。プラスチックチューブを摂氏4度で100倍Gで15分間遠心分離します。時間と遠心分離速度を変化させ、リポソーム形成のために最適化する。必要に応じて、余分な容量をピペット吸引して油相を慎重に取り除きます。リポソーム相の上にオイルのメニスカスが作成されないように、ピペットチップをチューブの側面に置かないようにしてください。新しいピペットで、ピペットの先端を切ります。ピペットを残りのボトムフェーズにゆっくりと貼り付け、水性容量を吸引してリポソームを収集します。100マイクロリットルの外部バッファーをインキュベーションチャンバーのウェルに注ぎます。採取したリポソームを外側のバッファーに静かに入れ、チャンバーの上に別のカバースリップを置きます。63倍の油浸対物レンズを使用して共焦点顕微鏡でリポソームを観察します。488、647、および561ナノメートルのレーザーラインを使用します。蛍光標識脂質を観察するために、封入蛍光色素および封入蛍光標識アクチンをそれぞれ行った。目的のフレームをキャプチャし、画像をTIF形式で保存します。画像J内の画像を処理および分析まず、画像Jソフトウェアを使用してTIFファイルを開きます。画像に移動し、[調整]をクリックします。明るさのコントラストに続いて、最小設定と最大設定、明るさとコントラストのスライダーを調整して、画像の明るさとコントラストを目的のスケールに調整します。ツールバーの長方形選択ツールをクリックし、関心領域を選択します。画像に移動し、[切り抜き]をクリックしてROIをトリミングします。[解析] に移動し、[縮尺を設定] をクリックします。ポップアップウィンドウで、ピクセルアスペクト比フィールドに1.0と入力し、長さの単位としてマイクロメートルを設定します。[ピクセル単位の距離] フィールドに、画像の幅をピクセル単位で入力します。既知の距離フィールドに、実際の画像の幅をミクロン単位で入力します。リポソームのサイズを測定するには、ツールバーの楕円形の選択ツールを使用して、リポソームのエッジに沿って円を描きます。分析に移動し、[測定]をクリックして円の面積を測定し、そこからリポソームの直径を計算できます。リポソーム生成の成功は、緑色の蛍光脂質二重層である薄い円形のリングの視覚化によって検証されます。共焦点顕微鏡を用いて488ナノメートルレーザー下で蛍光色素の封入を確認した。リポソームの内部環境は、647ナノメートルのレーザー下で均一に蛍光する必要があります。リポソームの形成は、薄い緑色の円形のリングによって視覚化することができます。リポソーム内のネットワークにおける再構成された影響は不均一であり、アクチンフィラメントの分岐ネットワーク構造として現れる。分岐アーキテクチャは、VCA HEZとともにアクチンフィラメントの核形成と分岐を同時に制御するARP two 3複合体の導入によって引き起こされました。薄いが密に分岐したアクチン層が、蛍光として視覚化できるリポソームの二重層の内側のリーフレットに作成されます。脂質オーディオ最終緩衝液混合物は、気泡の導入を避けるために、一般にガラスシリンジを通して前後にポンプで送られなければならない。混合物はプロセス後に白っぽくなければなりません。この技術は、複雑な生化学的調節を欠いた細胞の最小限のモデルを構築するための道を開いた。この細胞模倣システムにより、研究者は細胞骨格タンパク質、核細胞、分子モーターの機械的および動的特性を調べることができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

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