Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Reconhecemos o financiamento ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) U54 CA209992, NIH RO126256, NIH U54 CA209992, Universidade de Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) concedem o número RGY0073/2018 a M.P.M. Qualquer opinião, achados, conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do ARO, NIH ou HFSP. S.C. reconhece discussões frutíferas com V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

1. Preparação de tampões e soluções proteicas
<ol><li>Prepare o aquoso Tampão de Não Polimerização Interna (INP) em um volume total de 5 mL misturando 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM de sacarose e 0,2 mM ATP.</li>
	<li>Prepare o Mix de Proteínas (PM) adicionando proteínas ao tampão INP a 4 °C com as seguintes concentrações: 11,2 μM de G-actina não fluorescente, 2,8 μM de actina fluorescente e 0,24 μM Arp2/3 (Tabela de Materiais</s...

Várias etapas-chave determinam o sucesso de um alto rendimento de lipossomos durante o processo de preparação. Para dissolver completamente o filme lipíduo no óleo, a amostra deve ser sônica até que o filme lipídudo na parte inferior do frasco de vidro desapareça completamente. Após a sônica, a mistura lipídica-óleo deve ser armazenada durante a noite à temperatura ambiente em condições escuras para que as moléculas lipídicas se dispersem por mais29. A mistura pode ser armazenada...

O citoesqueleto de actina desempenha um papel fundamental na construção da arquitetura intracelular da célula, coordenando a contratude de nível molecular e a geraçãode força 1,2,3. Como resultado, media inúmeras atividades celulares essenciais, incluindo deformaçãocelular 4,5, divisão6, migração 7,8 e adesão9. A reconstituição in vitro das redes actin ganhou enorme atenção nos últimos anos 10,11,12,13,14,15,16,17. O objetivo da reconstituição é construir um modelo mínimo da célula desprovida da complexa regulação bioquímica que existe dentro das células vivas. Isso oferece um ambiente controlável para sondar atividades intracelulares específicas e facilita a identificação e análise de diferentes componentes do citoesqueleto de actina18,19. Além disso, o encapsulamento de redes in vitro actin dentro de vesículas unilamellar gigantes fosfolipídicas (GUVs, lipossomos) fornece um espaço confinado, mas deformável, com um limite semi-permeável. Imita o microambiente fisiológico e mecânico do maquinário de actina dentro da célula 9,20,21,22.
Entre vários métodos para preparar lipossomos, o método de hidratação de filme lipídeído (também conhecido como método de inchaço) é uma das primeiras técnicas23. O filme lipídigo seco hidrata-se com a adição de tampões, formando bolhas membranous que eventualmente se tornam vesículas24. Para produzir vesículas maiores com maior rendimento, um método melhorado avançando a partir do método de hidratação cinematográfica, conhecido como método de eletroformação25, aplica um campo elétrico CA para promover eficientemente o processo de hidratação26. As principais limitações desses métodos baseados em hidratação para encapsulamento de actina são que ele tem baixa eficiência de encapsulamento de proteínas altamente concentradas, e só é compatível com composições lipídicas específicas24. A técnica de emulsão invertida, em comparação, tem menos limitações para componentes lipídicos e concentrações proteicas 20,27,28,29. Neste método, uma mistura de proteínas para encapsulamento é adicionada ao tampão aquoso interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo lipídios, formando gotículas lipídicas-monocamadas. As gotículas lipídicas monocamadas então atravessam outra interface lipídica/óleo-água através da centrifugação para formar vesículas lipídicas bicamadas (lipossomos). Esta técnica provou ser uma das estratégias mais bem sucedidas para encapsulamento de actin 24,30. Separadamente, existem alguns métodos de dispositivo microfluido, incluindo o lançamento pulsado31,32, ejeção transitória da membrana33 e o método cDICE34. As semelhanças entre o método de emulsão invertida e o método microfluido são o solvente lipídico (óleo) que é utilizado e a introdução de interface lipídica/óleo-água para a formação do folheto externo de lipossomos. Em contrapartida, a geração de lipossomos pelo método microfluido requer uma configuração de dispositivos microfluidos e é acompanhada de óleo preso entre os dois folhetos da bicamada, o que requer um passo extra para a remoção do óleo35.
Neste manuscrito, utilizamos a técnica de emulsão invertida para preparar lipossomos encapsulando uma rede polimerizada de F-actin como usado anteriormente22. A mistura de proteínas para encapsulamento foi primeiramente colocada em um tampão com condições não polimerizantes para manter a actina em sua forma globular (G). Todo o processo foi realizado a 4 °C para evitar a polimerização da actina precoce, que mais tarde foi acionada permitindo que a amostra aquecesse à temperatura ambiente. Uma vez à temperatura ambiente, o actin polimeriza em sua forma de fistoso (F). Uma variedade de proteínas de ligação de actina pode ser adicionada à solução tampão aquosa interna para estudar funcionalidades e propriedades proteicas, fornecendo assim insights sobre sua interação com a rede actina e superfície da membrana. Este método também pode ser aplicado ao encapsulamento de várias proteínas de interesse36 e objetos grandes (micropartículas, microswimmers autopropulsores, etc.) perto do tamanho dos lipossomos finais28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

O citoesqueleto de actina, o principal maquinário mecânico da célula, media inúmeras atividades celulares físicas essenciais, incluindo deformação celular, divisão, migração e adesão. No entanto, estudar a dinâmica e a estrutura da rede actin in vivo é complicado pela regulação bioquímica e genética dentro das células vivas. Para construir um modelo mínimo desprovido de regulação bioquímica intracelular, o actin é encapsulado dentro de vesículas unilamellar gigantes (GUVs, também chamados lipossomos). Os lipossomos biomiméticos são do tamanho de células e facilitam uma visão quantitativa das propriedades mecânicas e dinâmicas da rede de citoesqueleto, abrindo uma rota viável para a biologia sintética de baixo para cima. Para gerar lipossomos para encapsulamento, utiliza-se o método de emulsão invertida (também chamado de método de transferência de emulsão), que é uma das técnicas mais bem sucedidas para encapsular soluções complexas em lipossomos para preparar vários sistemas de imitação celular. Com este método, uma mistura de proteínas de interesse é adicionada ao tampão interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo fosfolipídio para formar gotículas lipídicas monocamadas. Os lipossomos desejados são gerados a partir de gotículas lipídicas de monocamadas que cruzam uma interface lipídica/óleo-água. Este método permite o encapsulamento de polímeros concentrados de actina nos lipossomos com componentes lipídudos desejados, abrindo caminho para a reconstituição in vitro de uma rede de citoesqueleto biomimicing.

A preparação de lipossomos baseados na técnica de emulsão invertida é ilustrada graficamente e esquematicamente na Figura 1.
Primeiro, foram preparados lipossomos vazios (nus) (~5-50 μm de diâmetro) compostos de fosfolipídio (EPC) e lipídio fluorescente (DHPE). Um corante fluorescente vermelho brilhante foi encapsulado dentro de lipossomos nus como um experimento de controle. Se uma monocamada lipídica se formou com sucesso no periférico da gotícula po...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Esta medida constrói um modelo mínimo da célula desprovida de complexas regulamentações bioquímicas. A técnica utilizada pode gerar alto rendimento de lipossomos e ter alta eficiência de encapsulamento para proteínas citoesqueletos. Essa medida pode ser aplicada ao encapsulamento de variedade de proteínas e objetos grandes, como micropartículas e micro-nadadores auto-preparadores.Um indivíduo está lutando para aumentar o rendimento lipossomo para as primeiras várias tentativas. Recomenda-se discutir regularmente a seção do manuscrito para obter mais detalhes para aumentar o rendimento. Para começar, prepare o aquoso tampão interno não polimerização em um volume total de cinco mililitros misturando 0,1 mililitro CACL dois, 10 mililitros HEPES, um mililitro DTT, 0,5 mililitro DAPCO, 320 mililimilhas de sacarose e 0,2 mililitro ATP.Prepare a mistura de proteínas adicionando proteínas ao tampão interno de não polimerização a quatro graus Celsius. Para formar uma camada de actina, adicione 100 gellcalina nanomolar, quatro tosselina micromolar e 2,2 micromolar VCA HEZ à mistura de proteínas. Como um experimento de controle, substitua a mistura de proteínas por 100 microgramas por corante fluorescente mililitro.Prepare o tampão de polimerização interna aquoso em um volume total de cinco mililitros misturando 100 mililitros de potássio. Quatro cloreto de magnésio milimona, 10 mililitros HEPES, um mililitro DTT, 0,5 mililitro DABCO, 10 milimilas ATP e 80 milimilas de sacarose. Prepare o buffer final misturando tampão interno não polimerização e tampão de polimerização interna em uma razão de volume de um para um, para produzir a solução aquosa interna em um volume total de 30 microliters que serão encapsulados dentro do lipossomo.Prepare o tampão externo aquoso em um volume total de 150 microliters misturando HEPES de 10 mililitros, 50 milimil de cloreto de potássio, dois cloreto de magnésio milimil, 0,2 milimolar de cloreto de cálcio, dois ATP milimilas, um milimil DTT, 0,5 milimil DAPCO, 212 milimonas de glicose e 0,1 miligramas por casing beta mililitro. Para preparar a mistura de óleo lipíduo, comece adicionando 100 microliters de 25 miligramas por mililitros EGGPC em um frasco de vidro. Evaporar clorofórmio com gás argônio deixando um filme lipídedo sólido seco na parte inferior do frasco.Para formar uma camada de actina, adicione lipídio de níquel a uma proporção de 10 a uma razão de EGGPC para lipídio de níquel e misture, antes da evaporação do clorofórmio. Adicione dois mililitros de óleo mineral. Evaporar o clorofórmio e sonicar a mistura de óleo lipíduo à temperatura ambiente em um banho por uma hora, para resuspensar os lipídios.Prepare um tampão final na emulsão do óleo para preparar gotículas lipídicas monocamadas contendo a proteína de interesse. Comece tomando 100 microliters da mistura de óleo lipíduo em um tubo plástico e adicione 10 microliters de tampão final à mistura de óleo lipíduo. Certifique-se de que o buffer final está em uma gota.Usando uma seringa de vidro, desenhe uma pequena quantidade de mistura de óleo lipídico primeiro e, em seguida, a gota final tampão colocando a ponta da seringa na periferia da gotícula para quebrá-la em pequenas gotículas. Aspire suavemente várias vezes até formar uma emulsão nublada. Coloque 30 microliters de tampão externo em um tubo plástico separado.Coloque 30 microliters da mistura de óleo lipíduo em cima do tampão externo e deixe descansar por aproximadamente 10 minutos para desenvolver uma monocameira lipídica na interface. Para preparar lipossomos, adicione cuidadosamente 50 microliters da emulsão final do óleo tampão, à fase superior do óleo do tubo. Centrifugar o tubo plástico a 100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius.Varie a velocidade de tempo e centrifugação, para otimizar para a formação de lipossomos. Remova cuidadosamente a fase do óleo por pipeta aspirar volume extra, se necessário. Certifique-se de não colocar a ponta da pipeta na lateral do tubo para evitar criar um menisco de óleo em cima da fase liposesome.Com uma nova pipeta, corte a ponta da pipeta. Coloque lentamente a pipeta na fase inferior restante e aspire o volume aquoso para coletar lipossomos. Despeje 100 microliters de tampão externo no poço de uma câmara de incubação.Deposite suavemente os lipossomos coletados no tampão externo e, em seguida, coloque outro deslizamento de cobertura em cima da câmara. Observe lipossomos com um microscópio confocal usando um objetivo de imersão de óleo de 63 x. Use linhas laser 488, 647 e 561 nanômetros.Observar lipídio fluorescentemente rotulado, corante fluorescente encapsulado e atuação fluorescente encapsulada, respectivamente. Capture os quadros de interesse e salve as imagens no formato TIF. Processe e analise imagens na imagem J.Start abrindo o arquivo TIF, usando o software image J.Vá para a imagem e clique em ajustar. Seguido pelo contraste de brilho, ajuste o brilho e o contraste da imagem na escala desejada, ajustando as configurações mínimas e máximas e os controles deslizantes de brilho e contraste. Clique na ferramenta de seleção de retângulos na barra de ferramentas e selecione a região de interesse.Vá para a imagem e clique em crop para cortar o ROI. Vá para analisar e clique em escala definida. Na janela pop-up, digite 1.0 no campo de proporção de pixels e coloque o micrômetro como a unidade de comprimento.Na distância no campo pixels, digite a largura da imagem em pixels. No campo de distância conhecido, digite a largura real da imagem em mícrons. Para medir o tamanho do lipossomo, usando a ferramenta de seleção oval na barra de ferramentas, desenhe um círculo ao longo da borda do lipossomo.Vá analisar, em seguida, clique na medida, para medir a área do círculo, a partir da qual o diâmetro do lipossomo pode ser calculado. A geração liposasome bem sucedida é verificada através da visualização do fino anel circular que é o bicamadorão lipídeto fluorescente verde. Sob um laser de 488 nanômetros usando microscopia confocal para confirmar o encapsulamento do corante fluorescente.O ambiente interno dos lipossomos deve ser uniformemente fluorescente sob um laser de 647 nanômetros. A formação de lipossomos poderia ser visualizada pelos finos anéis circulares verdes. O afeto reconstituído nas redes dentro dos lipossomos são heterogêneos, manifestando-se como estruturas de rede ramificadas de filamentos actin.A arquitetura do ramo foi desencadeada pela introdução do complexo ARP dois três, que controla simultaneamente a nucleação e ramificação de filamentos de actin, juntamente com vca HEZ. Uma fina, mas densamente ramificada camada de actin é criada no folheto interno do bicamado de lipossomos que podem ser visualizados como uma obrigação fluorescente. A mistura final de tampão de áudio lipídudo deve ser geralmente bombeada para frente e para trás através de uma seringa de vidro, para evitar a introdução de bolhas de ar.A mistura deve ser esbranquiçada após o processo. Essa técnica abriu caminho para a construção de um modelo mínimo da célula, desprovido de complexas regulamentações bioquímicas. Com esta célula imitando o sistema os pesquisadores podem explorar as propriedades mecânicas e dinâmicas das proteínas do citoesqueleto, do nucleador e do motor molecular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Bioengenharia

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...