Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Мы признаем финансирование ARO MURI W911NF-14-1-0403 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 1R01GM126256 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 и Human Frontiers Science Program (HFSP) номер гранта RGY0073/2018 для M.P.M. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам (авторам) и не обязательно отражают взгляды ARO, NIH или HFSP. С.К. отмечает плодотворные беседы с В. Ядавом, К. Муресаном, С. Амири.

1. Приготовление буферов и белковых растворов
<ol><li>Готовят водный буфер внутренней неполимеризации (INP) в общем объеме 5 мл путем смешивания 0,1 мМCaCl2, 10 мМ HEPES (рН 7,5), 1 мМ DTT, 0,5 мМ Dabco, 320 мМ сахарозы и 0,2 мМ АТФ.</li>
	<li>Приготовьте белковую смесь (PM), добавив белки в буфер INP при 4 °C с...

Несколько ключевых шагов определяют успешность высокого выхода липосом в процессе приготовления. Чтобы полностью растворить липидную пленку в масле, образец необходимо обрабатывать ультразвуком до тех пор, пока липидная пленка на дне стеклянного флакона полностью не исчезнет. После ...

Актиновый цитоскелет играет фундаментальную роль в построении внутриклеточной архитектуры клетки путем координации сократимости на молекулярном уровне и генерации силы 1,2,3. В результате он опосредует многочисленные важные клеточные активности, включая клеточную деформацию 4,5, деление6, миграцию 7,8 и адгезию9. Восстановление актиновых сетей in vitro привлекло огромное внимание в последние годы 10,11,12,13,14,15,16,17. Целью восстановления является построение минимальной модели клетки, лишенной сложной биохимической регуляции, которая существует в живых клетках. Это обеспечивает контролируемую среду для зондирования специфических внутриклеточных действий и облегчает идентификацию и анализ различных компонентов актинового цитоскелета18,19. Кроме того, инкапсуляция актиновых сетей in vitro внутри фосфолипидных гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ, липосом) обеспечивает ограниченное, но деформируемое пространство с полупроницаемой границей. Он имитирует физиологическое и механическое микроокружение актинового механизма в клетке 9,20,21,22.
Среди различных методов получения липосом метод гидратации липидной пленки (также известный как метод набухания) является одним из самых ранних методов23. Сухая липидная пленка увлажняется с добавлением буферов, образуя мембранозные пузырьки, которые в конечном итоге становятся везикулами24. Чтобы получить более крупные везикулы с более высоким выходом, улучшенный метод, продвигающийся от метода гидратации пленки, известный как методэлектроформации 25, применяет электрическое поле переменного тока для эффективного содействия процессугидратации 26. Основные ограничения этих основанных на гидратации методов инкапсуляции актина заключаются в том, что они имеют низкую эффективность инкапсуляции высококонцентрированных белков и совместимы только со специфическими липидными композициями24. Метод инвертированной эмульсии, для сравнения, имеет меньше ограничений для липидных компонентов и концентраций белка 20,27,28,29. В этом способе смесь белков для инкапсуляции добавляют во внутренний водный буфер, который впоследствии эмульгируют в растворе липидсодержащего минерального масла, образуя липидно-монослойные капли. Монослойные липидные капли затем пересекают другую границу раздела липид/масло-вода посредством центрифугирования с образованием двухслойных липидных везикул (липосом). Этот метод оказался одной из самых успешных стратегий инкапсуляции актина 24,30. Отдельно выделяют некоторые методы микрофлюидных устройств, включая импульсную струйнуюобработку 31,32, переходный мембранный выброс33 и метод34 cDICE. Сходство между методом инвертированной эмульсии и микрофлюидным способом заключается в использовании липидного растворителя (масла) и введении интерфейса липид/масло-вода для образования внешнего листочка липосом. Напротив, генерация липосом микрофлюидным методом требует установки микрофлюидных устройств и сопровождается попаданием масла между двумя листочками бислоя, что требует дополнительного шага для удаления масла35.
В этой рукописи мы использовали метод инвертированной эмульсии для получения липосом, инкапсулирующих полимеризованную F-актиновую сеть, как это использовалось ранее22. Белковую смесь для инкапсуляции сначала помещали в буфер с неполимеризующими условиями для поддержания актина в его глобулярной (G) форме. Весь процесс проводили при 4 °C, чтобы предотвратить раннюю полимеризацию актина, которая позже была вызвана тем, что образец нагревался до комнатной температуры. После комнатной температуры актин полимеризуется в нитевидную (F) форму. Различные актин-связывающие белки могут быть добавлены во внутренний водный буферный раствор для изучения функциональных возможностей и свойств белка, таким образом, дополнительно давая представление о его взаимодействии с актиновой сетью и поверхностью мембраны. Этот метод также может быть применен для инкапсуляции различных белков, представляющих интерес36, и крупных объектов (микрочастиц, самоходных микропловцев и т.д.), близких к размеру конечных липосом28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Актиновый цитоскелет, главный механический механизм в клетке, опосредует многочисленные важные физические клеточные действия, включая клеточную деформацию, деление, миграцию и адгезию. Однако изучение динамики и структуры актиновой сети in vivo осложняется биохимической и генетической регуляцией внутри живых клеток. Чтобы построить минимальную модель, лишенную внутриклеточной биохимической регуляции, актин инкапсулируется внутри гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ, также называемых липосомами). Биомиметические липосомы имеют размер клетки и облегчают количественное понимание механических и динамических свойств сети цитоскелетов, открывая жизнеспособный путь для синтетической биологии снизу вверх. Для получения липосом для инкапсуляции используется метод инвертированной эмульсии (также называемый методом переноса эмульсии), который является одним из наиболее успешных методов инкапсуляции сложных растворов в липосомы для подготовки различных систем, имитирующих клетки. С помощью этого способа во внутренний буфер добавляют интересующую смесь белков, которую позже эмульгируют в фосфолипидсодержащем растворе минерального масла с образованием монослойных липидных капель. Желаемые липосомы образуются из монослойных липидных капель, пересекающих липидно-масляно-водный интерфейс. Этот метод позволяет инкапсуляцию концентрированных актиновых полимеров в липосомы с желаемыми липидными компонентами, прокладывая путь для восстановления in vitro биомикирующей цитоскелетной сети.

Получение липосом на основе метода инвертированной эмульсии проиллюстрировано графически и схематично на фиг.1.
Во-первых, были получены пустые (голые) липосомы (~5-50 мкм в диаметре), которые состояли из фосфолипида (EPC) и флуоресцентного липида (DHPE). Яркий, д?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

В этой рукописи мы демонстрируем экспериментальные методы инкапсулирования F-актинового цитоскелета в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (также называемые липосомами) и метод формирования биомимикирующего коры F-актинового слоя на внутреннем листке липосомной мембраны.

В пробирке Восстановление актин-цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Эта мера строит минимальную модель клетки, лишенную сложных биохимических регуляций. Используемый метод может генерировать высокий выход липосом и иметь высокую эффективность инкапсуляции для белков цитоскелета. Эта мера может быть применена к инкапсуляции различных белков и крупных объектов, таких как микрочастицы и самоподготовившиеся микропловцы.Человек изо всех сил пытается увеличить выход липосом в течение первых нескольких попыток. Рекомендуется регулярно обсуждать раздел рукописи для более подробного повышения урожайности. Для начала подготовьте водный внутренний неполимеризационный буфер в общем объеме пяти миллилитров путем смешивания 0,1 миллимоляра CACL два, 10 миллимоляров HEPES, одного миллимоляра DTT, 0,5 миллимоляра DAPCO, 320 миллимолярной сахарозы и 0,2 миллимолярной АТФ.Приготовьте белковую смесь, добавив белки во внутренний неполимеризационный буфер при четырех градусах Цельсия. Чтобы сформировать актиновый слой, добавьте в белковую смесь 100 наномолярных геллкалинов, четыре микромоляльных кашалина и 2,2 микромолярного VCA HEZ. В качестве контрольного эксперимента замените белковую смесь 100 микрограммами на миллилитр флуоресцентного красителя.Готовят водный внутренний полимеризационный буфер в общем объеме пять миллилитров путем смешивания 100 миллимоляров хлорида калия. Четыре миллимоляра хлорида магния, 10 миллимоляров HEPES, один миллимоляр DTT, 0,5 миллимоляр DABCO, 10 миллимоляров АТФ и 80 миллимоляров сахарозы. Подготовьте конечный буфер путем смешивания внутреннего неполимеризационного буфера и внутреннего полимеризационного буфера в объемном соотношении один к одному, чтобы получить внутренний водный раствор в общем объеме 30 микролитров, которые будут инкапсулированы внутри липосомы.Готовят водный внешний буфер в общем объеме 150 микролитров путем смешивания 10 миллимоляров HEPES, 50 миллимоляров хлорида калия, двух миллимоляров хлорида магния, 0,2 миллимоляра хлорида кальция, двух миллимоляров АТФ, одного миллимоляра DTT, 0,5 миллимоляра DAPCO, 212 миллимоляров глюкозы и 0,1 миллиграмма на миллилитр бета-оболочки. Чтобы приготовить смесь липидных масел, начните с добавления 100 микролитров по 25 миллиграммов на миллилитр EGGPC в стеклянный флакон. Испаряют хлороформ с газообразным аргоном, оставляя сухую твердую липидную пленку на дне флакона.Чтобы сформировать актиновый слой, добавляют липид никеля в соотношении 10 к одному EGGPC к липиду никеля и смешивают перед испарением хлороформа. Добавьте два миллилитра минерального масла. Выпаривают хлороформ и обрабатывают ультразвуком липидную масляную смесь при комнатной температуре в ванне в течение одного часа, чтобы повторно суспендировать липиды.Подготовьте конечный буфер в масляной эмульсии для получения монослойных липидных капель, содержащих интересующий белок. Начните с того, что возьмите 100 микролитров смеси липидного масла в пластиковой трубке и добавьте 10 микролитров конечного буфера в липидную масляную смесь. Убедитесь, что конечный буфер находится в одной капле.С помощью стеклянного шприца сначала нарисуйте небольшое количество смеси липидного масла, а затем конечную буферную каплю, поместив кончик шприца на периферию капли, чтобы разбить ее на крошечные капли. Осторожно аспирируйте вверх и вниз несколько раз, пока не образуется мутная эмульсия. Поместите 30 микролитров наружного буфера в отдельную пластиковую трубку.Поместите 30 микролитров липидной масляной смеси поверх внешнего буфера и оставьте его примерно на 10 минут, чтобы образовался липидный монослой на границе раздела. Чтобы приготовить липосомы, осторожно добавьте 50 микролитров конечной буферной масляной эмульсии в верхнюю масляную фазу трубки. Центрифугируйте пластиковую трубку в 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.Варьируйте время и скорость центрифугирования, чтобы оптимизировать образование липосом. Осторожно удалите масляную фазу пипеткой аспирата дополнительного объема, если это необходимо. Убедитесь, что кончик пипетки не помещается сбоку трубки, чтобы избежать создания мениска масла поверх фазы липосомы.Новой пипеткой вырежьте кончик пипетки. Медленно вставьте пипетку в оставшуюся нижнюю фазу и аспирируйте водный объем, чтобы собрать липосомы. Вылейте 100 микролитров наружного буфера в колодец инкубационной камеры.Аккуратно нанесите собранные липосомы во внешний буфер, а затем поместите еще один крышку поверх камеры. Наблюдайте за липосомами с помощью конфокального микроскопа с помощью 63-кратного масляного погружного объектива. Используйте лазерные линии 488, 647 и 561 нанометр.Наблюдать флуоресцентно меченый липид, инкапсулированный флуоресцентный краситель и инкапсулированный флуоресцентно меченый актин соответственно. Захватите интересующие кадры и сохраните изображения в формате TIF. Обработка и анализ изображений в изображении J.Начните с открытия файла TIF с помощью программного обеспечения image J.Перейдите к изображению, затем нажмите кнопку «Настроить». Затем контраст яркости отрегулируйте яркость и контрастность изображения до нужного масштаба, настроив минимальные и максимальные настройки и ползунки яркости и контрастности. Нажмите на инструмент выделения прямоугольника на панели инструментов и выберите интересующую область.Перейдите к изображению, затем нажмите «Обрезать», чтобы обрезать рентабельность инвестиций. Перейдите к анализу, затем нажмите установить масштаб. Во всплывающем окне введите 1.0 в поле соотношения сторон пикселей и установите микрометр в качестве единицы длины.В поле «Расстояние в пикселях» введите ширину изображения в пикселях. В поле известного расстояния введите реальную ширину изображения в микронах. Чтобы измерить размер липосомы, с помощью инструмента выделения овала на панели инструментов нарисуйте круг вдоль края липосомы.Перейдите к анализу, затем нажмите «Измерить», чтобы измерить площадь круга, из которой можно вычислить диаметр липосомы. Успешная генерация липосом подтверждается визуализацией тонкого круглого кольца, которое является зеленым флуоресцентным липидным бислоем. Под 488 нанометровым лазером используют конфокальную микроскопию для подтверждения инкапсуляции флуоресцентного красителя.Внутренняя среда липосом должна быть равномерно флуоресцентной под 647-нанометровым лазером. Образование липосом может быть визуализировано тонкими зелеными круглыми кольцами. Восстановленный аффект в сетях внутри липосом неоднороден, проявляясь в виде разветвленных сетевых структур актиновых нитей.Отраслевая архитектура была вызвана введением ARP двух трех комплексов, который одновременно управляет нуклеацией и ветвлением актиновых нитей вместе с VCA HEZ. Тонкий, но густо разветвленный актиновый слой создается на внутренней створке бислоя липосом, который можно визуализировать как флуоресцентный. Липидная звуковая конечная буферная смесь обычно должна перекачиваться вперед и назад через стеклянный шприц, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.Смесь должна быть беловатой после обработки. Эта методика проложила путь к построению минимальной модели клетки, лишенной сложных биохимических норм. С помощью этой системы, имитирующей клетки, исследователи могут исследовать механические и динамические свойства белков цитоскелета, нуклеатора и молекулярного двигателя.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Assay органоид растворения (ОРА) для функционального анализа кишечных стволовых и ниша клеток

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization всего человеческого сердца внутри под давлением мешочек в Перевернутый ориентации

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...