Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
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Reconocemos la financiación de ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., los Institutos Nacionales de Salud (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, Universidad de Michigan / Genentech, SUBK00016255 y Human Frontiers Science Program (HFSP) número de subvención RGY0073/2018 a M.P.M. Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la ARO, NIH o HFSP. S.C. reconoce conversaciones fructíferas con V. Yadav, C. Muresan y S. Amiri.

1. Preparación de tampones y soluciones proteicas
<ol><li>Prepare el tampón acuoso de no polimerización interna (INP) en un volumen total de 5 mL mezclando 0.1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 320 mM sacarosa y0.2 mM ATP.</li>
	<li>Prepare la mezcla de proteínas (PM) agregando proteínas al tampón INP a 4 °C con las siguientes concentraciones: 11.2 μM de actina G no fluorescente, actina marcada fluorescente de 2.8 μM y Arp2/3 de 0.24 μM (Tabla de mate...

Varios pasos clave determinan el éxito de un alto rendimiento de liposomas durante el proceso de preparación. Para disolver completamente la película lipídica en el aceite, la muestra debe ser sonicada hasta que la película lipídica en el fondo del vial de vidrio desaparezca por completo. Después de la sonicación, la mezcla de lípidos y aceite debe almacenarse durante la noche a temperatura ambiente en condiciones oscuras para que las moléculas lipídicas se dispersen más29. La mezcla p...

El citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en la construcción de la arquitectura intracelular de la célula mediante la coordinación de la contractilidad a nivel molecular y la generación de fuerza 1,2,3. Como resultado, media numerosas actividades celulares esenciales, incluyendo la deformación celular4,5, división6, migración 7,8 y adhesión9. La reconstitución in vitro de las redes de actina ha ganado una gran atención en los últimos años 10,11,12,13,14,15,16,17. El objetivo de la reconstitución es construir un modelo mínimo de la célula desprovisto de la compleja regulación bioquímica que existe dentro de las células vivas. Esto ofrece un ambiente controlable para sondear actividades intracelulares específicas y facilita la identificación y análisis de diferentes componentes del citoesqueleto de actina18,19. Además, la encapsulación de las redes de actina in vitro dentro de las vesículas unilamelares gigantes de fosfolípidos (GUV, liposomas) proporciona un espacio confinado pero deformable con un límite semipermeable. Imita el microambiente fisiológico y mecánico de la maquinaria de actina dentro de la célula 9,20,21,22.
Entre los diversos métodos para preparar liposomas, el método de hidratación de la película lipídica (también conocido como método de hinchazón) es una de las primeras técnicas23. La película lipídica seca hidrata con la adición de tampones, formando burbujas membranosas que eventualmente se convierten en vesículas24. Para producir vesículas más grandes con un mayor rendimiento, un método mejorado que avanza desde el método de hidratación de la película, conocido como el método de electroformación25, aplica un campo eléctrico de CA para promover eficientemente el proceso de hidratación26. Las principales limitaciones de estos métodos basados en la hidratación para la encapsulación de actina son que tiene una baja eficiencia de encapsulación de proteínas altamente concentradas, y sólo es compatible con composiciones lipídicas específicas24. La técnica de emulsión invertida, en comparación, tiene menos limitaciones para los componentes lipídicos y las concentraciones de proteínas20,27,28,29. En este método, se agrega una mezcla de proteínas para la encapsulación al tampón acuoso interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene lípidos, formando gotitas de monocapa lipídica. Las gotas lipídicas monocapa luego cruzan a través de otra interfaz lípido/aceite-agua a través de la centrifugación para formar vesículas lipídicas bicapa (liposomas). Esta técnica ha demostrado ser una de las estrategias más exitosas para la encapsulación de actina24,30. Por separado, hay algunos métodos de dispositivos microfluídicos, incluyendo el chorro pulsado 31,32, la eyección transitoria de membrana33 y el método cDICE34. Las similitudes entre el método de emulsión invertida y el método microfluídico son el disolvente lipídico (aceite) que se utiliza y la introducción de la interfaz lípido/aceite-agua para la formación de la valva externa de los liposomas. Por el contrario, la generación de liposomas por el método microfluídico requiere una configuración de dispositivos microfluídicos y se acompaña de aceite atrapado entre las dos valvas de la bicapa, lo que requiere un paso adicional para la eliminación del aceite35.
En este manuscrito, utilizamos la técnica de emulsión invertida para preparar liposomas encapsulando una red de actina F polimerizada como se usó anteriormente22. La mezcla de proteínas para la encapsulación se colocó primero en un tampón con condiciones no polimerizantes para mantener la actina en su forma globular (G). Todo el proceso se llevó a cabo a 4 °C para evitar la polimerización temprana de actina, que luego se desencadenó al permitir que la muestra se calentara a temperatura ambiente. Una vez a temperatura ambiente, la actina polimeriza en su forma filamentosa (F). Se puede agregar una variedad de proteínas de unión a actina a la solución tampón acuosa interna para estudiar las funcionalidades y propiedades de las proteínas, lo que proporciona información adicional sobre su interacción con la red de actina y la superficie de la membrana. Este método también se puede aplicar a la encapsulación de diversas proteínas de interés36 y objetos grandes (micropartículas, micronadadores autopropulsados, etc.) cercanos al tamaño de los liposomas finales 28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

El citoesqueleto de actina, la principal maquinaria mecánica en la célula, media numerosas actividades celulares físicas esenciales, incluyendo la deformación, división, migración y adhesión celular. Sin embargo, el estudio de la dinámica y la estructura de la red de actina in vivo se complica por la regulación bioquímica y genética dentro de las células vivas. Para construir un modelo mínimo desprovisto de regulación bioquímica intracelular, la actina se encapsula dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV, también llamadas liposomas). Los liposomas biomiméticos son del tamaño de una célula y facilitan una visión cuantitativa de las propiedades mecánicas y dinámicas de la red del citoesqueleto, abriendo una ruta viable para la biología sintética ascendente. Para generar liposomas para encapsulación, se utiliza el método de emulsión invertida (también conocido como método de transferencia de emulsión), que es una de las técnicas más exitosas para encapsular soluciones complejas en liposomas para preparar varios sistemas que imitan células. Con este método, se agrega una mezcla de proteínas de interés al tampón interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene fosfolípidos para formar gotas de lípidos monocapa. Los liposomas deseados se generan a partir de gotas lipídicas monocapa que cruzan una interfaz lípido/aceite-agua. Este método permite la encapsulación de polímeros de actina concentrados en los liposomas con los componentes lipídicos deseados, allanando el camino para la reconstitución in vitro de una red de citoesqueleto bioimitador.

La preparación de liposomas basada en la técnica de emulsión invertida se ilustra gráfica y esquemáticamente en la Figura 1.
Primero, se prepararon liposomas vacíos (desnudos) (~ 5-50 μm de diámetro) que estaban compuestos de fosfolípidos (EPC) y lípidos fluorescentes (DHPE). Un tinte fluorescente brillante de color rojo lejano se encapsuló dentro de liposomas desnudos como un experimento de control. Si una monocapa lipídica se ha formado con éxito en...

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In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Esta medida construye un modelo mínimo de la célula desprovisto de regulaciones bioquímicas complejas. La técnica utilizada puede generar un alto rendimiento de liposomas y tener altas eficiencias de encapsulación para las proteínas del citoesqueleto. Esta medida se puede aplicar a la encapsulación de una variedad de proteínas y objetos grandes como micropartículas y micro nadadores autopreparados.Un individuo está luchando para aumentar el rendimiento del liposoma durante los primeros intentos. Se recomienda discutir regularmente la sección del manuscrito para obtener más detalles para aumentar el rendimiento. Para comenzar, prepare el tampón acuoso interno no polimerizado en un volumen total de cinco mililitros mezclando 0.1 milimolar CACL dos, 10 milimolares HEPES, un DTT milimolar, 0.5 milimolar DAPCO, 320 milimolar sacarosa y 0.2 milimolar ATP.Prepare la mezcla de proteínas agregando proteínas al tampón interno de no polimerización a cuatro grados centígrados. Para formar una capa de actina, agregue 100 nanomolares de gelcalina, cuatro micromolares de tosalina y 2.2 micromolares VCA HEZ a la mezcla de proteínas. Como experimento de control, reemplace la mezcla de proteínas con 100 microgramos por mililitro de tinte fluorescente.Prepare el tampón de polimerización interna acuosa en un volumen total de cinco mililitros mezclando cloruro de potasio 100 milimolar. Cuatro cloruro de magnesio milimolar, 10 HEPES, un DTT milimolar, DABCO 0,5 milimolar, ATP 10 milimolar y sacarosa 80 milimolar. Prepare el tampón final mezclando tampón interno de no polimerización y tampón de polimerización interno en una proporción de volumen de uno a uno, para producir la solución acuosa interna en un volumen total de 30 microlitros que se encapsulará dentro del liposoma.Prepare el tampón exterior acuoso en un volumen total de 150 microlitros mezclando 10 HEPES milimolares, cloruro de potasio 50 milimolar, cloruro de magnesio dos milimolares, cloruro de calcio milimolar 0.2, ATP milimolar, un DTT milimolar, DAPCO 0.5 milimolar, 212 milimolar de glucosa y 0.1 miligramos por millolitro de tripa beta. Para preparar la mezcla de aceite lipídico, comience agregando 100 microlitros de 25 miligramos por mililitros EGGPC en un vial de vidrio. Evaporar el cloroformo con gas argón dejando una película lipídica sólida seca en el fondo del vial.Para formar una capa de actina, agregue níquel lípido en una proporción de 10 a uno de EGGPC a níquel lípido y mezcla, antes de la evaporación del cloroformo. Añadir dos mililitros de aceite mineral. Evaporar el cloroformo y sonicar la mezcla de aceite lipídico a temperatura ambiente en un baño durante una hora, para resuspender los lípidos.Preparar un tampón final en emulsión oleosa para preparar gotas lipídicas monocapa que contengan la proteína de interés. Comience tomando 100 microlitros de la mezcla de aceite lipídico en un tubo de plástico y agregue 10 microlitros de tampón final a la mezcla de aceite lipídico. Asegúrese de que el búfer final esté en una gota.Usando una jeringa de vidrio, extraiga primero una pequeña cantidad de mezcla de aceite lipídico y luego la gota tampón final colocando la punta de la jeringa en la periferia de la gota para dividirla en pequeñas gotas. Aspire suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta que se forme una emulsión turbia. Coloque 30 microlitros de tampón exterior en un tubo de plástico separado.Coloque 30 microlitros de la mezcla de aceite lipídico sobre el tampón exterior y déjelo reposar durante aproximadamente 10 minutos para desarrollar una monocapa lipídica en la interfaz. Para preparar liposomas, agregue cuidadosamente 50 microlitros de la emulsión de aceite tampón final a la fase superior de aceite del tubo. Centrifugar el tubo de plástico a 100 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Varíe el tiempo y la velocidad de centrifugación, para optimizar la formación de liposomas. Retire con cuidado la fase oleosa con aspiración de pipeta de volumen adicional si es necesario. Asegúrese de no colocar la punta de la pipeta en el lado del tubo para evitar crear un menisco de aceite en la parte superior de la fase liposómica.Con una pipeta nueva, corte la punta de la pipeta. Inserte lentamente la pipeta en la fase inferior restante y aspire el volumen acuoso para recoger los liposomas. Vierta 100 microlitros de tampón exterior en el pozo de una cámara de incubación.Deposite suavemente los liposomas recolectados en el tampón exterior y luego coloque otro resbalón de cobertura en la parte superior de la cámara. Observe los liposomas con un microscopio confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63 x. Utilice líneas láser de 488, 647 y 561 nanómetros.Observar lípidos marcados con fluorescencia, colorante fluorescente encapsulado y actina encapsulada marcada con fluorescencia respectivamente. Captura los marcos de interés y guarda las imágenes en formato TIF. Procese y analice imágenes en la imagen J.Comience abriendo el archivo TIF, utilizando el software Image J.Ve a la imagen y, a continuación, haz clic en ajustar. Seguido del contraste de brillo, ajuste el brillo y el contraste de la imagen a la escala deseada ajustando la configuración mínima y máxima y los controles deslizantes de brillo y contraste. Haga clic en la herramienta de selección de rectángulos en la barra de herramientas y seleccione la región de interés.Vaya a la imagen y, a continuación, haga clic en recortar para recortar el ROI. Vaya a analizar y, a continuación, haga clic en Establecer escala. En la ventana emergente, introduzca 1,0 en el campo de relación de aspecto de píxeles y establezca micrómetro como unidad de longitud.En el campo distancia en píxeles, introduzca el ancho de la imagen en píxeles. En el campo de distancia conocida, introduzca el ancho real de la imagen en micras. Para medir el tamaño del liposoma, usando la herramienta de selección ovalada en la barra de herramientas, dibuje un círculo a lo largo del borde del liposoma.Vaya a analizar, luego haga clic en medir, para medir el área del círculo, a partir de la cual se puede calcular el diámetro del liposoma. La generación exitosa de liposomas se verifica a través de la visualización del anillo circular delgado que es la bicapa lipídica fluorescente verde. Bajo un láser de 488 nanómetros utilizando microscopía confocal para confirmar la encapsulación del tinte fluorescente.El ambiente interno de los liposomas debe ser uniformemente fluorescente bajo un láser de 647 nanómetros. La formación de liposomas podría ser visualizada por los delgados anillos circulares verdes. El efecto reconstituido en redes dentro de los liposomas es heterogéneo, manifestándose como estructuras de red ramificadas de filamentos de actina.La arquitectura de la rama fue activada por la introducción del complejo ARP dos tres, que controla simultáneamente la nucleación y ramificación de los filamentos de actina, junto con VCA HEZ. Se crea una capa de actina delgada, pero densamente ramificada en la valva interna de la bicapa de liposomas que se puede visualizar como una capa fluorescente. La mezcla tampón final de audio lipídico generalmente debe bombearse hacia adelante y hacia atrás a través de una jeringa de vidrio, para evitar la introducción de burbujas de aire.La mezcla debe ser blanquecina después del proceso. Esta técnica allanó el camino para construir un modelo mínimo de la célula, desprovisto de complejas regulaciones bioquímicas. Con este sistema de imitación celular, los investigadores pueden explorar las propiedades mecánicas y dinámicas de las proteínas del citoesqueleto, el nucleador y el motor molecular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

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Investigación

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