Name: in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Vi erkänner finansiering av ARO MURI W911NF-14-1-0403 till M.P.M., National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 till M.P.M., National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 och Human Frontiers Science Program (HFSP) bidragsnummer RGY0073/2018 till M.P.M. Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis ARO: s, NIH: s eller HFSP: s åsikter. S.C. erkänner givande diskussioner med V. Yadav, C. Muresan och S. Amiri.

1. Beredning av buffertar och proteinlösningar
<ol><li>Förbered den vattenhaltiga inre icke-polymerisationsbufferten (INP) i en total volym på 5 ml genom att blanda 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sackaros och0,2 mM ATP.</li>
	<li>Förbered proteinblandningen (PM) genom att tillsätta proteiner till INP-bufferten vid 4 °C med följande koncentrationer: 11,2 μM icke-fluorescerande G-aktin, 2,8 μM fluorescerande märkt aktin och 0,24 μM Arp2/3 (<strong...

Flera viktiga steg avgör framgången för ett högt utbyte av liposomer under beredningsprocessen. För att helt lösa upp lipidfilmen i oljan måste provet sonikeras tills lipidfilmen i botten av glasflaskan försvinner helt. Efter ultraljudsbehandling, lipid-olja blandningen måste lagras över natten vid rumstemperatur under mörka förhållanden för lipidmolekylerna att sprida ytterligare29. Blandningen kan förvaras vid 4 °C i upp till en vecka. Vid beredning av en FB/oljeemulsion med lipi...

Aktincytoskelettet spelar en grundläggande roll för att konstruera cellens intracellulära arkitektur genom att samordna kontraktilitet på molekylär nivå och kraftgenerering 1,2,3. Som ett resultat förmedlar den många viktiga cellulära aktiviteter, inklusive celldeformation4,5, division6, migration 7,8 och vidhäftning9. In vitro-rekonstitueringen av aktinnätverk har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren 10,11,12,13,14,15,16,17. Målet med rekonstituering är att bygga en minimal modell av cellen utan den komplexa biokemiska reglering som finns i levande celler. Detta erbjuder en kontrollerbar miljö för att undersöka specifika intracellulära aktiviteter och underlättar identifiering och analys av olika komponenter i aktincytoskelettet18,19. Vidare ger inkapslingen av in vitro-aktinnätverk inuti fosfolipidjätte unilamellära vesiklar (GUVs, liposomer) ett begränsat men deformerbart utrymme med en halvgenomsläpplig gräns. Det efterliknar den fysiologiska och mekaniska mikromiljön hos aktinmaskineriet i cellen 9,20,21,22.
Bland olika metoder för att förbereda liposomer är lipidfilmhydratiseringsmetoden (även känd som svullnadsmetoden) en av de tidigaste teknikerna23. Den torra lipidfilmen hydratiseras med tillsats av buffertar och bildar membranösa bubblor som så småningom blir vesiklar24. För att producera större vesiklar med högre utbyte tillämpar en förbättrad metod som går vidare från filmhydratiseringsmetoden, känd som elektroformationsmetoden25, ett elektriskt växelströmsfält för att effektivt främja hydreringsprocessen26. De största begränsningarna med dessa hydratiseringsbaserade metoder för aktinkapsling är att den har låg inkapslingseffektivitet hos högkoncentrerade proteiner, och den är endast kompatibel med specifika lipidkompositioner24. Den inverterade emulsionstekniken har i jämförelse färre begränsningar för lipidkomponenter och proteinkoncentrationer20,27,28,29. I denna metod tillsätts en blandning av proteiner för inkapsling till den inre vattenhaltiga bufferten, som senare emulgeras i en lipidinnehållande mineraloljelösning och bildar lipid-monolagerdroppar. Monolayer lipiddropparna passerar sedan genom ett annat lipid / olje-vattengränssnitt genom centrifugering för att bilda dubbelskiktiga lipidblåsor (liposomer). Denna teknik har visat sig vara en av de mest framgångsrika strategierna för aktinkapsling24,30. Separat finns det några mikrofluidiska anordningsmetoder, inklusive pulserad jetting 31,32, övergående membranutkastning33 och cDICE-metoden34. Likheterna mellan den inverterade emulsionsmetoden och den mikrofluidiska metoden är lipidlösningsmedlet (olja) som används och införandet av lipid / olje-vattengränssnitt för bildandet av liposomernas yttre bipacksedel. Däremot kräver genereringen av liposomer med den mikrofluidiska metoden en uppsättning mikrofluidiska anordningar och åtföljs av olja som fångas mellan de två broschyrerna i dubbelskiktet, vilket kräver ett extra steg för oljeavlägsnande35.
I detta manuskript använde vi den inverterade emulsionstekniken för att förbereda liposomer som inkapslar ett polymeriserat F-aktinnätverk som tidigare använts22. Proteinblandningen för inkapsling placerades först i en buffert med icke-polymeriserande betingelser för att bibehålla aktin i sin globulära (G) form. Hela processen utfördes vid 4 °C för att förhindra tidig aktinpolymerisation, som senare utlöstes genom att låta provet värmas till rumstemperatur. En gång vid rumstemperatur polymeriseras aktinet till sin trådformiga (F). En mängd olika aktinbindande proteiner kan tillsättas till den inre vattenhaltiga buffertlösningen för att studera proteinfunktioner och egenskaper, vilket ytterligare ger insikter om dess interaktion med aktinnätverket och membranytan. Denna metod kan också tillämpas på inkapsling av olika proteiner av intresse36 och stora föremål (mikropartiklar, självgående mikroswimmers, etc.) nära storleken på de slutliga liposomerna 28,37.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>231615773</td>
			<td>Nickel Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td>DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (&#62;99% pure): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AKL99-D</td>
			<td>non-fluorescent G-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>AR05</td>
			<td>fluorescently labeled actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383-10G</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iQ3</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>control and acquisition software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>RP01P-A</td>
			<td>Arp 2/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10035048</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cofilin protein: human recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>CF01-C</td>
			<td>cofilin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (63&#215; oil-immersion objective)</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>LEICA DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>DOT Scientific&#160;</td>
			<td>DSD11000-10</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>HPG6</td>
			<td>gelsolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &#181;L, cemented needle, 22 G, 2&#34; conical tip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-07940-53</td>
			<td>glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/tutorials/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>97281442</td>
			<td>EPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786303</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8042475</td>
			<td>mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-WASP fragment WWA (aa400&#8211;501, VCA-His)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>O12650</td>
			<td>DHPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447407</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6905-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles

Aktincytoskelettet, det huvudsakliga mekaniska maskineriet i cellen, förmedlar många väsentliga fysiska cellulära aktiviteter, inklusive celldeformation, delning, migration och vidhäftning. Att studera dynamiken och strukturen i aktinnätverket in vivo kompliceras dock av den biokemiska och genetiska regleringen i levande celler. För att bygga en minimal modell utan intracellulär biokemisk reglering är aktin inkapslat inuti gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs, även kallade liposomer). De biomimetiska liposomerna är cellstora och underlättar en kvantitativ inblick i cytoskelettnätverkets mekaniska och dynamiska egenskaper, vilket öppnar en livskraftig väg för syntetisk biologi nedifrån och upp. För att generera liposomer för inkapsling används den inverterade emulsionsmetoden (även kallad emulsionsöverföringsmetoden), som är en av de mest framgångsrika teknikerna för att kapsla in komplexa lösningar i liposomer för att förbereda olika cellliknande system. Med denna metod tillsätts en blandning av proteiner av intresse till den inre bufferten, som senare emulgeras i en fosfolipidinnehållande mineraloljelösning för att bilda monolager lipiddroppar. De önskade liposomerna genereras från monolager lipiddroppar som passerar ett lipid / olje-vattengränssnitt. Denna metod möjliggör inkapsling av koncentrerade aktinpolymerer i liposomerna med önskade lipidkomponenter, vilket banar väg för in vitro-rekonstituering av ett biohärmande cytoskelettnätverk.

Beredningen av liposomer baserat på den inverterade emulsionstekniken illustreras grafiskt och schematiskt i figur 1.
Först framställdes tomma (nakna) liposomer (~ 5-50 μm i diameter) som bestod av fosfolipid (EPC) och fluorescerande lipid (DHPE). Ett ljust, långt rött fluorescerande färgämne kapslades in i nakna liposomer som ett kontrollexperiment. Huruvida ett lipidmonolager framgångsrikt har bildats i droppens perifera kan bestämmas genom att observe...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

I detta manuskript demonstrerar vi de experimentella teknikerna för att kapsla in F-aktincytoskelettet i gigantiska unilamellära lipidblåsor (även kallade liposomer) och metoden för att bilda ett cortex-biohärmande F-aktinskikt vid liposommembranets inre broschyr.

In vitro Rekonstitution av aktincytoskeletten inuti gigantiska unilamellära vesiklar

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Denna åtgärd bygger en minimimodell av cellen utan komplexa biokemiska regler. Tekniken som används kan generera högt utbyte av liposomer och ha hög inkapslingseffektivitet för cytoskelettproteiner. Denna åtgärd kan tillämpas på inkapsling av olika proteiner och stora föremål som mikropartiklar och självförberedande mikrosimmare.En individ kämpar med att öka liposomutbytet under de första flera försöken. Det rekommenderas att regelbundet diskutera avsnittet i manuskriptet för mer information för att öka avkastningen. För att börja, förbered den vattenhaltiga inre icke-polymerisationsbufferten i en total volym av fem milliliter genom att blanda 0,1 millimolar CACL två, 10 millimolar HEPES, en millimolär DTT, 0,5 millimolar DAPCO, 320 millimolar sackaros och 0,2 millimolar ATP.Förbered proteinblandningen genom att tillsätta proteiner till den inre icke-polymerisationsbufferten vid fyra grader Celsius. För att bilda ett aktinskikt, tillsätt 100 nanomolar gellcalin, fyra mikromolära hostalin och 2,2 mikromolar VCA HEZ till proteinblandningen. Som ett kontrollexperiment, ersätt proteinblandningen med 100 mikrogram per milliliter fluorescerande färgämne.Bered den vattenhaltiga inre polymerisationsbufferten i en total volym av fem ml genom att blanda 100 millimolar kaliumklorid. Fyra millimolar magnesiumklorid, 10 millimolar HEPES, en millimolär DTT, 0,5 millimolar DABCO, 10 millimolar ATP och 80 millimolar sackaros. Förbered den slutliga bufferten genom att blanda inre icke-polymerisationsbuffert och inre polymerisationsbuffert i ett volymförhållande av en till en, för att ge den inre vattenhaltiga lösningen i en total volym av 30 mikroliter som kommer att kapslas in i liposomen.Förbered den vattenhaltiga yttre bufferten i en total volym på 150 mikroliter genom att blanda 10 millimolar HEPES, 50 millimolar kaliumklorid, två millimolar magnesiumklorid, 0,2 millimolar kalciumklorid, två millimolar ATP, en millimolär DTT, 0,5 millimolar DAPCO, 212 millimolar glukos och 0,1 milligram per milliliter betahölje. För att förbereda lipidoljeblandningen, börja med att tillsätta 100 mikroliter 25 milligram per milliliter EGGPC i en glasflaska. Indunsta kloroform med argongas och lämna en torr fast lipidfilm i botten av injektionsflaskan.För att bilda ett aktinskikt, tillsätt nickellipid i ett förhållande mellan 10 och ett förhållande mellan EGGPC och nickellipid och blanda före avdunstning av kloroform. Tillsätt två milliliter mineralolja. Indunsta kloroformen och sonikat lipidoljeblandningen vid rumstemperatur i ett bad i en timme, att återsuspendera lipiderna.Förbered en slutlig buffert i oljeemulsion för beredning av monolager lipiddroppar innehållande proteinet av intresse. Börja med att ta 100 mikroliter av lipidoljeblandningen i ett plaströr och tillsätt 10 mikroliter slutlig buffert till lipidoljeblandningen. Se till att den slutliga bufferten finns i en droppe.Använd en glasspruta dra först en liten mängd lipidoljeblandning och sedan den slutliga buffertdroppen genom att placera sprutans spets i droppens periferi för att bryta upp den i små droppar. Aspirera försiktigt upp och ner flera gånger tills en grumlig emulsion bildas. Lägg 30 mikroliter yttre buffert i ett separat plaströr.Placera 30 mikroliter av lipidoljeblandningen ovanpå den yttre bufferten och låt den sitta i cirka 10 minuter för att utveckla ett lipidmonolager vid gränssnittet. För att förbereda liposomer, tillsätt försiktigt 50 mikroliter av den slutliga buffertoljeemulsionen till rörets övre oljefas. Centrifugera plaströret vid 100 gånger G i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Variera tid och centrifugeringshastighet, för att optimera för liposombildning. Ta försiktigt bort oljefasen med pipettaspirat extra volym om det behövs. Se till att inte sätta pipettspetsen vid sidan av röret för att undvika att skapa en menisk av olja ovanpå liposomfasen.Skär pipettens spets med en ny pipett. Stick långsamt pipetten i den återstående bottenfasen och aspirera den vattenhaltiga volymen för att samla liposomer. Häll 100 mikroliter yttre buffert i brunnen i en inkubationskammare.Sätt försiktigt in de uppsamlade liposomerna i den yttre bufferten och placera sedan en annan täckglidning ovanpå kammaren. Observera liposomer med ett konfokalmikroskop med ett 63 x oljedoppningsmål. Använd 488, 647 och 561 nanometer laserlinjer.Att observera fluorescerande märkt lipid, inkapslat fluorescerande färgämne respektive inkapslat fluorescerande märkt aktin. Fånga ramarna av intresse och spara bilderna i TIF-format. Bearbeta och analysera bilder i bild J.Börja med att öppna TIF-filen med hjälp av bild J-programvaran.Gå till bilden och klicka sedan på justera. Följt av ljusstyrka kontrast, justera ljusstyrkan och kontrasten i bilden till önskad skala genom att justera lägsta och maximala inställningar och ljusstyrka och kontrastreglage. Klicka på rektangelvalsverktyget i verktygsfältet och välj intresseområdet.Gå till bilden och klicka sedan på beskär för att beskära avkastningen. Gå till analysera och klicka sedan på ange skala. I popup-fönstret anger du 1.0 i fältet pixelformat och ställer in mikrometer som längdenhet.I fältet avstånd i pixlar anger du bildbredden i pixlar. I fältet känt avstånd anger du den verkliga bildbredden i mikron. Om du vill mäta liposomens storlek ritar du en cirkel längs liposomens kant med hjälp av det ovala markeringsverktyget i verktygsfältet.Gå för att analysera, klicka sedan på mät, för att mäta cirkelns yta, från vilken liposomens diameter kan beräknas. Framgångsrik liposomgenerering verifieras genom visualisering av den tunna cirkulära ringen som är det gröna fluorescerande lipiddubbelskiktet. Under en 488 nanometer laser med konfokalmikroskopi för att bekräfta inkapsling av det fluorescerande färgämnet.Liposomernas inre miljö bör vara jämnt fluorescerande under en 647 nanometer laser. Bildandet av liposomer kunde visualiseras av de tunna gröna cirkulära ringarna. Den rekonstituerade effekten i nätverk inuti liposomer är heterogen och manifesterar sig som grenade nätverksstrukturer av aktinfilament.Grenarkitekturen utlöstes av introduktionen av ARP två tre komplex, som samtidigt styr kärnbildning och förgrening av aktinfilament, tillsammans med VCA HEZ. Ett tunt, men tätt grenat aktinskikt skapas vid den inre broschyren av det dubbelskikt av liposomer som kan visualiseras som en fluorescerande skall. Den slutliga buffertblandningen av lipidljud måste i allmänhet pumpas fram och tillbaka genom en glasspruta för att undvika att införa luftbubblor.Blandningen måste vara vitaktig efter processen. Denna teknik banade väg för att bygga en minimal modell av cellen, utan komplexa biokemiska regler. Med detta cellliknande system kan forskare utforska de mekaniska och dynamiska egenskaperna hos cytoskelettproteiner, nukleatorn och molekylmotorn.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid beredning analysen (ORA) för den funktionella analysen av Intestinal Stem och nisch celler

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization av hela människans hjärta inuti en trycksatt påsen i en omvänd riktning

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Utvärdering av lagrings stabiliteten hos extracellulära vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...