Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل برامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابعة للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوفسكا كوري رقم 722609 و 764474 ، NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). تم دعم هذا البحث من قبل BioSPX. تلقت WJ-D تمويلا من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) TRR219-Project ID 322900939 ومعرف المشروع 403041552

1. بذر الخلايا وصيانتها وتحريض التكلس
<ol><li>لزراعة الخلايا الأولية ، استخدم خزانة تدفق الهواء الصفحي والقفازات والمعدات المعقمة. تطهير اليدين ومساحة العمل قبل وبعد القيام بأي عمل. تعامل مع جميع الخلايا الأولية ووسائط المزرعة كخطر بيولوجي محتمل ، ما لم يثبت خلاف ذلك. يفضل الأوتوكل...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

في هذه المخطوطة ، نصف طريقة شبه آلية لتحديد التكلس في المختبر . لهذه الطريقة ، يجب تحسين ثلاث خطوات حاسمة لتكلس hVSMC. أولا ، الكثافة الخلوية أمر بالغ الأهمية لتطوير تكلس hVSMC. ستؤدي الكثافات المنخفضة ل hVSMCs إلى تكلس بطيء أو معدوم وموت الخلايا بسبب عدم وجود اتصال من خلية إلى خلية والإجهاد ال...

تكلس الأوعية الدموية (VC) هو عامل خطر مستقل لمراضة القلب والأوعية الدموية والوفيات1،2،3. تعتبر منذ فترة طويلة عملية كيميائية سلبية لترسب المعادن خارج الرحم ، ويبدو الآن استجابة قابلة للتعديل لشفاء الأنسجة تنطوي على المساهمة النشطة للخلايا المختلفة بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية المنشطة (hVSMC) كمحرك للمرض 4,5. في الجسم الحي يمكن قياس VC عن طريق التصوير المقطعي المحوسب متعدد الشرائح كتقييم لعبء تصلب الشرايين6،7،8. حاليا ، هناك نقلة نوعية جارية ، حيث أصبحت شدة VC معترف بها كعامل خطر في أمراض القلب والأوعية الدموية ، ومرض السكري من النوع الثاني ، وأمراض الكلى المزمنة ، والشيخوخة9،10،11،12،13،14،15.
hVSMCs هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في نظام القلب والأوعية الدموية وفاعل رئيسي في تطوير VC. التكلس الناجم عن hVSMC في المختبر هو نموذج مرض يستخدم على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية16,17. ومع ذلك ، فإن معظم بروتوكولات الكشف عن التكلس في المختبر تستخدم قياسات نقطة النهاية التي يمكن أن تحد من الحصول على البيانات ، وتتطلب استخداما أكبر للمواد الخلوية ، ويمكن أن تبطئ البحث. تشمل الطرق الشائعة للكشف عن تكلس hVSMC في المختبر مقايسة o-cresolphthalein ، والتي تقيس ترسب الكالسيوم المذاب مقابل البروتين الكلي وتتطلب تحلل الخلية18. أيضا ، يتم استخدام تلطيخ Alizarin الأحمر ، والذي يرتبط مباشرة برواسب الكالسيوم على الخلايا الثابتة أو الأنسجة19. لدراسة تكلس hVSMC بمرور الوقت مع o-cresolphthalein أو Alizarin Red يتطلب دفعات من النسخ المتماثلة لكل نقطة زمنية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ، وبالتالي يزيد من فرصة التباين.
في هذه الورقة ، نقوم بتفصيل طريقة تطبيق مقايسة جديدة تستخدم hVSMCs مع مسبار تصوير فلوري لتحديد تقدم VC في المختبر بالإضافة إلى العمل كاختبار تكلس فريد في المرحلة النهائية. لقد أثبتنا سابقا أن هذا الفحص يمكن مقارنته مباشرة بطريقتي o-cresolphthalein و Alizarin Red ويمكن استخدامه للتمييز بين ظروف الاستزراع المختلفة20. بالإضافة إلى القياسات في الوقت الفعلي ، يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد ميل عينات المصل أو البلازما كعلامة بديلة لتطوير VC السريري20. سيساعد هذا في تطبيق الاستراتيجيات البيولوجية لعلوم القلب والأوعية الدموية ونمذجة الأمراض. قد يكون التطبيق الآخر للمقايسة بمثابة نظام BioHybrid متعدي لتقييم شدة VC أو التقدم من مكونات الدم مثل المصل أو البلازما.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

يتضمن تكلس الأوعية الدموية سلسلة من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الالتهاب ، والتغيرات في النمط الظاهري الخلوي ، وموت الخلايا ، وغياب مثبطات التكلس ، والتي تؤدي في نفس الوقت إلى فقدان مرونة الأوعية ووظيفتها. يعد تكلس الأوعية الدموية مساهما مهما في المراضة والوفيات في العديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى المزمنة والسكري وتصلب الشرايين. نماذج البحث الحالية لدراسة تكلس الأوعية الدموية محدودة ولا يمكن تطبيقها إلا في المراحل المتأخرة من تطور التكلس في الجسم الحي. تستخدم الأدوات المختبرية لدراسة تكلس الأوعية الدموية قياسات نقطة النهاية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ويخاطر بإدخال التباين في الدراسات البحثية. نوضح تطبيق مسبار جديد يحمل علامة الفلورسنت يرتبط بتطور التكلس في المختبر على خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية ويحدد التطور في الوقت الفعلي للتكلس في المختبر . في هذا البروتوكول ، نصف تطبيق مقايسة التكلس المطورة حديثا ، وهي أداة جديدة في نمذجة الأمراض لها تطبيقات متعدية محتملة. نتصور أن يكون هذا الاختبار ذا صلة بمجموعة أوسع من أبحاث ترسب المعادن ، بما في ذلك التطبيقات في أبحاث العظام أو الغضاريف أو الأسنان.

تتضمن النتيجة صورا أصلية للنوى الملطخة ب HOECHST ، والتكلس المسمى RFP ، وصور برايتفيلد. يمكن الكشف عن مراحل مختلفة من التكلس تتراوح من منخفضة (الشكل 2) إلى عالية (الشكل 3) وتحليلها. يمكن عادة رصد التكلس على شكل بقع سوداء باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2D</st...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. يساهم تكلس الأوعية الدموية بشكل كبير في عبء المراضة والوفيات القلبية الوعائية. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لقياس ترسيب الكالسيوم بوساطة خلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر عن طريق التصوير الفلوري.

طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم في المختبر

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

تسمح طريقتنا بقياس ميل التكلس لعينات المرضى باستخدام خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية. سيساعد هذا في دفع البحث في اضطرابات تكلس الأوعية الدموية ، مما يساعد في تطوير علاجات جديدة. تستخدم هذه التقنية الكشف القائم على الفلورسنت ، مما يزيد من الحساسية ويسمح بقياس العينات بمرور الوقت ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى النسخ المتماثلة وزيادة المتانة.للبدء ، زرع خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية على قوارير زراعة الخلايا غير المطلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتقسيم الخلايا عند الوصول إلى 70 إلى 90٪ من التقاء. للتقسيم ، اغسل HVSMCs مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.يضاف التربسين ويحتضن لمدة 2 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تثبيط تفاعل التربسين عن طريق إضافة مصل يحتوي على وسط. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 4 دقائق عند 350 RCF وأعد تعليق الحبيبات في وسط صيانة.بعد تحضير الخلايا للانقسام كما هو موضح ، عد الخلايا وزرعها في صفيحة من 48 بئرا لبدء تجربة التكلس. بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS ، مع استنشاق جميع PBS المتبقية بعناية بعد الغسيل الثاني. أضف وسط التكلس برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.تحقق يوميا باستخدام المجهر الضوئي حتى يحدث التكلس. للكشف عن التكلس عبر التصوير ، افتح البرنامج وحدد البروتوكولات وإنشاء جديد. حدد الإجراء وانقر فوق ضبط درجة الحرارة.اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والتدرج على 1 درجة مئوية في النافذة المنبثقة وانقر فوق موافق. حدد نوع اللوحة التي تختارها من القائمة المنسدلة. أضف خطوة التصوير بالنقر فوق صورة. حدد الصورة المعكوسة وانقر فوق موافق. أضف ثلاث قنوات تصوير واضبطها على DAPI و RFP و Bright Field.ضع علامة في مربع المونتاج وقم بتعيين الرقم المطلوب وموقع الصور. قم بتغيير التداخل لتمثيل تغطية أفضل لكل بئر. حدد الآبار التي سيتم تصويرها.سيتم فتح نافذة جديدة حيث يمكن اختيار الآبار ذات الأهمية. انقر فوق خيارات التركيز لتعيين وضع التركيز البؤري. سيتم فتح نافذة جديدة.قم بتعيين كل قناة على حدة. بشكل عام ، يتم تركيز الآبار تلقائيا على قناة DAPI. اضبط جميع القنوات الأخرى على ارتفاع بؤري ثابت من القناة الأولى وقم بتعيينه بالنقر فوق موافق. أغلق النافذة.ابدأ خطوات الضبط المسبق لتقليل البيانات بالنقر فوق تقليل البيانات وحدد المعالجة المسبقة للصورة. اقبل الإعدادات الافتراضية عن طريق تحديد موافق. قم بإعداد خطوة لحساب عدد الخلايا عن طريق تحديد التحليل الخلوي. حدد صور TsF DAPI من القائمة المنسدلة للقناة.قم بتعيين مزيد من التفاصيل بعد إجراء التصوير. قم بإعداد تحليل إشارة RFP عن طريق تحديد إحصائيات في النافذة المنبثقة خطوة التسمية وحدد TsF RFP كقناة الإدخال. ضع علامة في المربعين القيمة العليا والقيمة الأقل.ضع علامة في المربع الخاص بالمساحة الإجمالية في القائمة السفلية. حدد لا شيء في عمود تأثير اللون. في النافذة المنبثقة ، انقر فوق مخصص وحدد مربع الخلفية.اضغط على موافق. للحصول على قراءة عادلة ، قم بتطبيع إشارة RFP لكل خلية بالضغط على النسبة على الجانب الأيسر. في النافذة المنبثقة، حدد المساحة الإجمالية للقياس الكمي لطلب تقديم العروض. لإدخال البيانات 1 من القائمة المنسدلة وحدد عدد الخلايا ك إدخال البيانات 2.أخيرا ، حدد اسم مجموعة بيانات جديدة واضغط على موافق مرتين. حدد تأثير اللون كما هو موضح سابقا ، وانقر فوق OK.In الزاوية اليسرى العليا ، وحدد ملف واحفظ الملف كنوع ملف بروتوكول. سجل الملاحظات لكل نقطة زمنية بعد حدوث المثيل الأول للتكلس.اضغط على Read Now في برنامج بدء التشغيل وانقر فوق البروتوكول الحالي. حدد البروتوكول الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. سيطالبك البرنامج بحفظ التجربة.يمكن القيام بذلك في هذه المرحلة أو لاحقا يدويا بالنقر فوق الزر "حفظ" في الجزء العلوي الأيسر. ستطلب نافذة منبثقة انتظار تسخين النظام. قم بتشغيل وحدة التحكم في غاز ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 5٪ بمجرد وصول النظام إلى درجة الحرارة المحددة ، ستظهر مطالبة لإدخال لوحة وقراءتها.اضغط على إلغاء. نقل اللوحة من الحاضنة إلى جهاز التصوير في صندوق آمن لتجنب الكسر والانسكاب ويتماشى مع لوائح السلامة البيولوجية المحلية لنقل الخلايا الحية في حالة وقوع حادث. ضع اللوحة في قارئ اللوحة.انقر فوق إجراء. في النافذة المنبثقة، حدد خطوة التصوير المعدة مسبقا. اضبط التركيز والتعرض على قناة DAPI أولا.قم بإلغاء تحديد مربع التعرض التلقائي في جميع القنوات، ثم انقر على أيقونة المجهر بجوار قناة DAPI. سيتم فتح نافذة جديدة. حدد البئر لتوجيه التركيز.إذا كانت الإشارة مرئية بالفعل، فانقر أولا فوق التركيز البؤري التلقائي ثم فوق التعرض التلقائي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم أولا بزيادة التعرض وكرر التركيز التلقائي والتعرض التلقائي. يمكن ضبط التعرض يدويا عن طريق تحديد القائمة المنسدلة التعرض للضوء.تحقق من الإعدادات على آبار متعددة ، ثم احفظ الإعدادات. اضبط التعرض بنفس الطريقة لجميع القنوات. بالنسبة لقناة RFP ، تأكد من البدء ببئر مع تكلس متوسط إلى مرتفع.أغلق نافذة الإجراء وحدد الزر الأخضر "اقرأ الآن" في شريط المهام العلوي. احفظ التجربة كما هو موضح في البرنامج. كرر هذه العملية لكل نقطة زمنية.بينما يقرأ النظام اللوحة ، تتم معالجة جميع الصور تلقائيا في الخلفية. اضبط إعدادات عدد الخلايا عن طريق تحديد صور TsF DAPI لعرضها. حدد البئر المفضل بالنقر المزدوج.ستظهر نافذة جديدة. حدد إحدى الصور. حدد علامة التبويب تحليل في النافذة المنبثقة.حدد عدد خلايا التحليل الخلوي وانقر فوق موافق. قم بإلغاء تحديد قنوات RFP و Bright Field. ضع علامة في المربع تمييز الكائنات. انقر فوق خيارات لفتح القائمة.اضبط عتبة الحجم والشدة لتشمل كل النوى، مع استبعاد الحطام، ثم انقر فوق موافق. انقر فوق تطبيق التغييرات في أسفل اليمين لتطبيق الإعدادات على جميع الصور. وبالمثل ، حدد صورة جيدة مع كمية متوسطة إلى عالية من التكلس. لضبط نسبة الإشارة إلى الضوضاء بشكل أفضل، انقر فوق علامة التبويب تحليل في قائمة المهام.حدد إحصائيات الصورة. قم بإلغاء تحديد DAPI وقناة الحقل الساطع. انقر فوق خيارات لفتح القائمة.ضع علامة في المربع القيم المتطرفة للعتبة. لتعيين قيمة العتبة غير الذاتية للإشارة فوق الخلفية، حدد أداة الخط من شريط المهام. ستظهر نافذة.ارسم خطا عبر رقعة من الإشارة أثناء تضمين منطقة من الخلفية. اضبط القيم العليا والسفلى. احسب الإشارة فوق الخلفية فقط واستبعد إذا كان هناك حطام أو قطع أثرية.انقر فوق "موافق" وقم بتطبيق التغييرات لنقل الإعدادات إلى جميع الآبار الأخرى. تأكد من تحديد العتبة بدقة في الآبار الأخرى. بمجرد تعيين عدد الخلايا وعتبات طلب تقديم العروض ، قم بتصدير البيانات.انقر فوق الزر Excel بجوار القائمة المنسدلة لتصدير البيانات مباشرة إلى جدول بيانات. تم الكشف عن مراحل التكلس المختلفة التي تتراوح من الأقل إلى الأعلى وتحليلها. تم رصد التكلس على شكل بقع سوداء باستخدام المجهر الضوئي ، والتي كانت مفيدة للتقييم الأولي وتحديد وقت بدء التصوير.لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تم تحليل صور RFP المعالجة لتحديد التكلس. تم الحصول على البيانات من خلال مقارنة شرطين أو أكثر في نفس النقطة الزمنية. تمت تسوية البيانات إلى عدد الخلايا كمنطقة تكلس لكل خلية.تم تصوير البيانات أيضا على أنها سلسلة زمنية تظهر نفس الحالة في نقاط زمنية مختلفة. من المهم أن تعكس النتائج بعد تقليل البيانات وتحليلها ما يمكن للمرء رؤيته قبل تحويل الصورة والعتبة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

تحريض الخلايا الحمراء للدم باستخدام الكالسيوم الأيوني

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...