Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskning blev støttet af BioSPX. WJ-D modtog støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) TRR219-project ID 322900939 og project ID 403041552

1. Cellesåning, vedligeholdelse og forkalkningsinduktion
<ol><li>Til dyrkning af primære celler skal du bruge et laminært luftstrømsskab, handsker og sterilt udstyr. Desinficer hænder og arbejdsområde før og efter udførelse af arbejde. Behandl alle primære celler og kulturmedier som en potentiel biohazard, medmindre andet er bevist. Fortrinsvis autoklave overskydende celler og medier inden bortskaffelse. Inaktiver ikke kemisk og autoklave, da dette vil frigøre giftige dampe.</li>
	<li>Kultur ...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

I dette manuskript beskriver vi en halvautomatisk metode til in vitro-forkalkningsbestemmelse . Til denne metode skal tre kritiske trin i hVSMC-forkalkning optimeres. For det første er cellulær tæthed afgørende for udviklingen af hVSMC-forkalkning. Lave tætheder af hVSMC'er vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grund af manglen på celle-til-celle-kontakt og den stress, der induceres under forkalkningsforhold21. Høje cellulære tætheder resulterer i overk...

Vaskulær forkalkning (VC) er en uafhængig risikofaktor for kardiovaskulær sygelighed og dødelighed 1,2,3. Længe betragtet som en passiv kemisk proces med ektopisk mineralaflejring, ser det nu ud til at være et modificerbart vævshelingsrespons, der involverer det aktive bidrag fra forskellige celler, herunder aktiverede vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en drivkraft for sygdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-scanninger som en vurdering af aterosklerotisk byrde 6,7,8. I øjeblikket er et paradigmeskift i gang, hvor VC-sværhedsgrad bliver anerkendt som en risikofaktor i hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes, kronisk nyresygdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC'er er den mest rigelige celletype i det kardiovaskulære system og en hovedaktør i udviklingen af VC. In vitro hVSMC-induceret forkalkning er en meget anvendt sygdomsmodel til at studere hjerte-kar-sygdomme16,17. Imidlertid bruger de fleste protokoller til påvisning af in vitro-forkalkning slutpunktsmålinger, der kan begrænse dataindsamling, kræver større brug af cellulært materiale og kan bremse forskningen. Almindelige metoder til påvisning af in vitro hVSMC-forkalkning omfatter o-cresolphthalein-assayet, som måler opløselig calciumaflejring mod total protein og kræver cellelyse18. Alizarin Red farvning anvendes også, som binder direkte til calciumaflejringer på faste celler eller væv19. At studere hVSMC-forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red kræver partier af replikater pr. Tidspunkt, hvilket øger efterspørgslen efter biologisk materiale og igen øger chancen for variabilitet.
I dette papir beskriver vi metoden til anvendelse af et nyt assay, der anvender hVSMC'er med en fluorescerende billedsonde til at bestemme in vitro VC-progression samt fungere som et enestående forkalkningsassay i slutstadiet. Vi har tidligere vist, at dette assay er direkte sammenligneligt med o-cresolphthalein og Alizarin Red metoderne og kan bruges til at skelne mellem varierende kulturforhold20. Ud over realtidsmålinger kan dette assay bruges til at bestemme tilbøjeligheden af serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør til klinisk VC-udvikling20. Dette vil hjælpe med anvendelsen af biologiske strategier for kardiovaskulær videnskab og sygdomsmodellering. En yderligere anvendelse af analysen kan være som et translationelt BioHybrid-system til vurdering af VC-sværhedsgrad eller progression fra blodbestanddele såsom serum eller plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Vaskulær forkalkning involverer en række degenerative patologier, herunder inflammation, ændringer i cellulær fænotype, celledød og fravær af forkalkningshæmmere, der samtidig fører til tab af karelasticitet og funktion. Vaskulær forkalkning er en vigtig bidragyder til sygelighed og dødelighed i mange patologier, herunder kronisk nyresygdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nuværende forskningsmodeller til undersøgelse af vaskulær forkalkning er begrænsede og er kun levedygtige i de sene stadier af forkalkningsudvikling in vivo. In vitro-værktøjer til undersøgelse af vaskulær forkalkning bruger slutpunktsmålinger, hvilket øger kravene til biologisk materiale og risikerer at indføre variabilitet i forskningsundersøgelser. Vi demonstrerer anvendelsen af en ny fluorescerende mærket sonde, der binder til in vitro-forkalkningsudvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer realtidsudviklingen af in vitro-forkalkning. I denne protokol beskriver vi anvendelsen af vores nyudviklede forkalkningsassay, et nyt værktøj inden for sygdomsmodellering, der har potentielle translationelle anvendelser. Vi forestiller os, at denne analyse er relevant i et bredere spektrum af mineralaflejringsforskning, herunder anvendelser inden for knogle-, brusk- eller tandforskning.

Resultatet omfatter originale billeder af HOECHST-farvede kerner, RFP-mærket forkalkning og brightfield-billeder. Forskellige forkalkningsstadier, der spænder fra lav (figur 2) til høj (figur 3), kan detekteres og analyseres. Forkalkning kan normalt ses som sorte pletter ved hjælp af lysmikroskopi (figur 2D og figur 3B, pile angiver forkalkning), som er nyttige til primær vurdering og til at bestem...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. Vaskulær forkalkning bidrager væsentligt til byrden af kardiovaskulær sygelighed og dødelighed. Denne protokol beskriver en simpel metode til kvantificering af vaskulær glat muskelcellemedieret calciumudfældning in vitro ved fluorescerende billeddannelse.

En semi-automatiseret og reproducerbar biologisk baseret metode til kvantificering af calciumaflejring in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Vores metode gør det muligt at måle forkalkningstilbøjelighed af patientprøver ved hjælp af humane vaskulære glatte muskelceller. Dette vil hjælpe med at drive forskning i vaskulære forkalkningsforstyrrelser og hjælpe med udviklingen af nye terapier. Denne teknik bruger en fluorescerende baseret detektion, som øger følsomheden og gør det muligt at måle prøver over tid, hvilket reducerer behovet for replikater og øger robustheden.Til at begynde med dyrkes humane vaskulære glatte muskelceller på ubelagte cellekulturkolber ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Opdel cellerne, når de når 70 til 90% sammenløb. For at opdele skal du vaske HVSMC'erne to gange med PBS.Tilsæt trypsin og inkuber i 2 til 5 minutter ved 37 grader Celsius. Hæmmer trypsinreaktionen ved at tilsætte et serum indeholdende medium. Centrifuger cellerne i 4 minutter ved 350 RCF, og pelleten resuspenderes i et vedligeholdelsesmedium.Efter at have forberedt cellerne til en opdeling som demonstreret, skal du tælle og så cellerne i en 48-brøndplade for at starte forkalkningseksperimentet. Efter inkubation natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid vaskes cellerne forsigtigt to gange med PBS og forsigtigt opsuges alle de resterende PBS efter den anden vask. Tilsæt forsigtigt forkalkningsmedium og inkuberes yderligere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Kontroller dagligt med et lysmikroskop, indtil forkalkning finder sted. For at registrere forkalkning via billeddannelse skal du åbne softwaren og vælge Protokoller og Opret ny. Vælg Procedure, og klik på Indstil temperatur.Indstil temperaturen til 37 grader Celsius og gradienten til 1 grad Celsius i pop op-vinduet, og klik på OK. Vælg den valgte pladetype i rullemenuen. Tilføj billedbehandlingstrinnet ved at klikke på Billede. Vælg det omvendte billede, og klik på OK. Tilføj tre billedkanaler, og indstil dem til DAPI, RFP og Bright Field.Marker feltet Montage, og indstil det ønskede antal og placering af billederne. Skift overlapningen, så den repræsenterer en bedre dækning af hver brønd. Vælg, hvilke brønde der skal afbildes.Et nyt vindue åbnes, hvor brøndene af interesse kan vælges. Klik på Fokusindstillinger for at indstille fokustilstanden. Et nyt vindue åbnes.Indstil hver kanal individuelt. Normalt er brønde automatisk fokuseret på DAPI-kanalen. Indstil alle andre kanaler til Fast brændvidde fra første kanal, og indstil ved at klikke på OK. Luk vinduet.Start trinnene til forudindstilling af datareduktion ved at klikke på Datareduktion, og vælg Billedforbehandling. Accepter standardindstillingerne ved at vælge OK. Opret et trin til at tælle cellerne ved at vælge Cellulær analyse. Vælg TsF DAPI-billeder i rullemenuen for kanaler.Angiv yderligere detaljer, efter at billeddannelsen er udført. Forbered analysen af RFP-signalet ved at vælge Statistik i pop op-vinduet Etikettrin og vælg TsF RFP som inputkanal. Marker felterne Øvre værdi og Nedre værdi.Marker afkrydsningsfeltet for Samlet areal på den nederste liste. Vælg Ingen i kolonnen Farveeffekt. I pop op-vinduet skal du klikke på Brugerdefineret og markere afkrydsningsfeltet Baggrund.Tryk på OK. For en retfærdig udlæsning skal du normalisere RFP-signalet pr. celle ved at trykke på Forhold på venstre side. I pop op-vinduet skal du vælge RFP Quantification Total Area. For Datainput 1 i rullemenuen skal du vælge Celleantal som datainput 2.Til sidst skal du vælge et nyt datasætnavn og trykke på OK to gange. Vælg Farveeffekt som vist tidligere, og klik OK.In øverste venstre hjørne, vælg Filer, og gem filen som en protokolfiltype. Optag observationer for hvert tidspunkt, efter at den første forekomst af forkalkning finder sted.Tryk på Læs nu i startsoftwaren, og klik på Eksisterende protokol. Vælg den protokol, der blev oprettet i det forrige trin. Programmet vil bede om at gemme eksperimentet.Dette kan gøres på dette tidspunkt eller senere manuelt ved at klikke på Gem knappen øverst til venstre. Et pop op-vindue beder om at vente på, at systemet opvarmes. Tænd for kuldioxidgasregulatoren, og indstil den til 5% Når systemet har nået den indstillede temperatur, vises en prompt om at indsætte en plade og læse.Tryk på Annuller. Transporter pladen fra inkubatoren til billedapparatet i en pengeskab for at undgå brud og spild og er i overensstemmelse med lokale biosikkerhedsbestemmelser for transport af levende celler i tilfælde af en ulykke. Placer pladen i pladelæseren.Klik på Procedure. I pop op-vinduet skal du vælge forudindstillet billedbehandlingstrin. Juster fokus og eksponering på DAPI-kanalen først.Fjern markeringen i feltet Automatisk eksponering ved alle kanaler, og klik derefter på mikroskopikonet ved siden af DAPI-kanalen. Et nyt vindue åbnes. Vælg brønden for at rette fokus.Hvis et signal allerede er synligt, skal du først klikke på Autofokus og derefter på Automatisk eksponering. Hvis ikke, skal du først øge eksponeringen og gentage Autofokus og Autoeksponering. Eksponeringen kan justeres manuelt ved at vælge rullemenuen Eksponering.Kontroller indstillingerne på flere brønde, og gem derefter indstillingerne. Juster eksponeringen på samme måde for alle kanaler. For RFP-kanalen skal du sørge for at starte med en brønd med medium til høj forkalkning.Luk procedurevinduet, og vælg den grønne Læs nu-knap i den øverste proceslinje. Gem eksperimentet som angivet af softwaren. Gentag denne proces for hvert tidspunkt.Mens systemet læser pladen, behandles alle billederne automatisk i baggrunden. Juster indstillingerne for celleantal ved at vælge TsF DAPI-billeder, der skal vises. Vælg den valgte brønd ved at dobbeltklikke.Et nyt vindue vises. Vælg et af billederne. Vælg fanen Analyse i pop op-vinduet.Vælg Celletælling til mobilanalyse, og klik på OK. Fravælg RFP- og Bright Field-kanalerne. Marker afkrydsningsfeltet Fremhæv objekter. Klik på Indstillinger for at åbne menuen.Juster størrelses- og intensitetsgrænsen for at inkludere alle kerner, men udelad snavs, og klik derefter på OK. Klik på Anvend ændringer nederst til venstre for at anvende indstillingerne på alle billeder. På samme måde skal du vælge et godt billede med en medium til høj mængde forkalkning. For bedst at justere signal-støj-forholdet skal du klikke på fanen Analyse i menuen Opgave.Vælg Billedstatistik. Fravælg DAPI- og Bright Field-kanalen. Klik på Indstillinger for at åbne menuen.Marker afkrydsningsfeltet Tærskel outliers. Hvis du vil angive den ikke-subjektive tærskelværdi for signalet over baggrunden, skal du vælge linjeværktøjet på proceslinjen. Et vindue vises.Tegn en linje gennem et signalområde, mens du inkluderer et område af baggrunden. Juster tærsklerne øvre og nedre værdier. Tæl kun signalet over baggrunden, og ekskluder, hvis der er snavs eller artefakter.Klik på OK, og anvend ændringer for at overføre indstillingerne til alle andre brønde. Bekræft, at tærsklen er nøjagtigt valgt i de andre brønde. Når celletællings- og RFP-tærsklerne er indstillet, skal du eksportere dataene.Klik på Excel-knappen ved siden af rullemenuen for at eksportere dataene direkte til et regneark. Forskellige forkalkningsstadier lige fra lav til høj blev detekteret og analyseret. Forkalkning blev opdaget som sorte pletter ved hjælp af lysmikroskopi, som var nyttige til primær vurdering og bestemmelse af, hvornår man skulle starte billeddannelse.For et forbedret signal-støj-forhold blev de behandlede RFP-billeder analyseret for at kvantificere forkalkning. Dataene blev opnået ved at sammenligne to eller flere betingelser på samme tidspunkt. Data blev normaliseret til celletal som forkalkningsområde pr. Celle.Dataene blev også afbildet som en tidsserie, der viser den samme tilstand på forskellige tidspunkter. Det er vigtigt, at resultaterne efter datareduktion og analyse stadig afspejler, hvad man kan se før billedtransformationen og tærsklen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induktion af Eryptose i røde blodlegemer ved hjælp af en calcium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...