Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma's van de Europese Unie onder de Marie Sklodowska-Curie subsidieovereenkomst nr. 722609 en 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Dit onderzoek werd ondersteund door BioSPX. WJ-D ontving financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-project ID 322900939 en project ID 403041552

1. Celzaaien, onderhoud en verkalkingsinductie
<ol><li>Gebruik voor het kweken van primaire cellen een laminaire luchtstroomkast, handschoenen en steriele apparatuur. Desinfecteer handen en werkruimte voor en na het uitvoeren van werkzaamheden. Behandel alle primaire cellen en kweekmedia als een potentieel biorisico, tenzij het tegendeel wordt bewezen. Bij voorkeur overtollige cellen en media autoclaaferen voordat ze worden verwijderd. Niet chemisch inactiveren en autoclaaf, omdat hierdoor giftige damp...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we een semi-geautomatiseerde methode voor in vitro verkalkingsbepaling. Voor deze methode moeten drie kritieke stappen van hVSMC-verkalking worden geoptimaliseerd. Ten eerste is cellulaire dichtheid van cruciaal belang voor de ontwikkeling van hVSMC-verkalking. Lage dichtheden van hVSMC's zullen resulteren in langzame of geen verkalking en celdood als gevolg van het ontbreken van cel-tot-cel contact en de stress die wordt geïnduceerd onder verkalkende omstandigheden<sup class="xref...

Vasculaire verkalking (VC) is een onafhankelijke risicofactor voor cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit 1,2,3. Lang beschouwd als een passief chemisch proces van ectopische minerale afzetting, lijkt het nu een aanpasbare weefselgenezingsrespons met de actieve bijdrage van verschillende cellen, waaronder geactiveerde vasculaire gladde spiercellen (hVSMC) als een aanjager van de ziekte 4,5. In vivo VC kan worden gemeten door multislice CT-scans als een beoordeling van atherosclerotische belasting 6,7,8. Momenteel is er een paradigmaverschuiving aan de gang, waarbij de ernst van VC wordt erkend als een risicofactor bij hart- en vaatziekten, diabetes type II, chronische nierziekte en veroudering 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC's zijn het meest voorkomende celtype in het cardiovasculaire systeem en een belangrijke actor in de ontwikkeling van VC. In vitro hVSMC-geïnduceerde verkalking is een veelgebruikt ziektemodel om hart- en vaatziekten te bestuderen16,17. De meeste protocollen voor de detectie van in vitro verkalking maken echter gebruik van eindpuntmetingen die data-acquisitie kunnen beperken, meer gebruik van cellulair materiaal vereisen en onderzoek kunnen vertragen. Veelgebruikte methoden voor de detectie van in vitro hVSMC-verkalking omvatten de o-cresolphthaleïne-assay, die opgeloste calciumafzetting meet tegen totaal eiwit en cellyse vereist18. Ook wordt Alizarine Rode kleuring gebruikt, die zich rechtstreeks bindt aan calciumafzettingen op vaste cellen of weefsel19. Om hVSMC-verkalking in de loop van de tijd te bestuderen met o-cresolphthaleïne of Alizarin Red, zijn batches van replicaties per tijdspunt vereist, waardoor de vraag naar biologisch materiaal toeneemt en op zijn beurt de kans op variabiliteit toeneemt.
In dit artikel beschrijven we de methode voor de toepassing van een nieuwe test die hVSMC's gebruikt met een fluorescerende beeldvormingsonde om in vitro VC-progressie te bepalen en te functioneren als een enkelvoudige eindstadiumverkalkingstest. We hebben eerder aangetoond dat deze test direct vergelijkbaar is met de o-cresolphthaleïne en Alizarin Red-methoden en kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende kweekomstandigheden20. Naast real-time metingen kan deze test worden gebruikt om de neiging van serum- of plasmamonsters te bepalen als surrogaatmarker voor klinische VC-ontwikkeling20. Dit zal helpen bij de toepassing van biologische strategieën van cardiovasculaire wetenschappen en ziektemodellering. Een verdere toepassing van de test kan zijn als een translationeel BioHybrid-systeem om de ernst of progressie van VC van bloedbestanddelen zoals serum of plasma te beoordelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Vasculaire verkalking omvat een reeks degeneratieve pathologieën, waaronder ontsteking, veranderingen in cellulair fenotype, celdood en de afwezigheid van verkalkingsremmers, die tegelijkertijd leiden tot een verlies van vaatelasticiteit en functie. Vasculaire verkalking is een belangrijke bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit in veel pathologieën, waaronder chronische nierziekte, diabetes mellitus en atherosclerose. De huidige onderzoeksmodellen om vasculaire verkalking te bestuderen zijn beperkt en zijn alleen levensvatbaar in de late stadia van de ontwikkeling van calcificatie in vivo. In vitro hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire verkalking maken gebruik van eindpuntmetingen, waardoor de eisen aan biologisch materiaal toenemen en de introductie van variabiliteit in onderzoeksstudies riskeert. We demonstreren de toepassing van een nieuwe fluorescerend gelabelde sonde die zich bindt aan in vitro verkalkingsontwikkeling op menselijke vasculaire gladde spiercellen en de real-time ontwikkeling van in vitro verkalking bepaalt. In dit protocol beschrijven we de toepassing van onze nieuw ontwikkelde verkalkingstest, een nieuw hulpmiddel in ziektemodellering dat potentiële translationele toepassingen heeft. We denken dat deze test relevant is in een breder spectrum van mineraaldepositieonderzoek, inclusief toepassingen in bot-, kraakbeen- of tandheelkundig onderzoek.

Het resultaat omvat originele afbeeldingen van HOECHST-gekleurde kernen, RFP-gelabelde verkalking en brightfield-afbeeldingen. Verschillende stadia van verkalking, variërend van laag (figuur 2) tot hoog (figuur 3), kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd. Verkalking kan meestal worden gezien als zwarte spikkels met behulp van lichtmicroscopie (figuur 2D en figuur 3B, pijlen geven verkalking aan), di...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.

Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Onze methode maakt het mogelijk om de verkalkingsneiging van patiëntmonsters te meten met behulp van menselijke vasculaire gladde spiercellen. Dit zal helpen bij het stimuleren van onderzoek naar vasculaire verkalkingsstoornissen, wat helpt bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Deze techniek maakt gebruik van een fluorescerende detectie, die de gevoeligheid verhoogt en het mogelijk maakt om monsters in de loop van de tijd te meten, waardoor de behoefte aan replicaties wordt verminderd en de robuustheid wordt verhoogd.Om te beginnen kweek menselijke vasculaire gladde spiercellen op ongecoate celkweekkolven bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Splits de cellen bij het bereiken van 70 tot 90% confluency. Om te splitsen, wast u de HVSMC's twee keer met PBS.Voeg trypsine toe en incubeer gedurende 2 tot 5 minuten bij 37 graden Celsius. Rem de trypsinereactie door een serum met medium toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende 4 minuten bij 350 RCF en resuspenseer de pellet in een onderhoudsmedium.Nadat de cellen zijn voorbereid op een splitsing zoals aangetoond, telt en zaait u de cellen in een 48-well plaat om het verkalkingsexperiment te starten. Na nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, wast u de cellen voorzichtig twee keer met PBS en zuigt u zorgvuldig alle resterende PBS op na de tweede wasbeurt. Voeg voorzichtig het verkalkingsmedium toe en incubeer verder bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Controleer dagelijks met een lichtmicroscoop totdat verkalking optreedt. Als u verkalking via imaging wilt detecteren, opent u de software en selecteert u Protocollen en Nieuw maken. Selecteer Procedure en klik op Temperatuur instellen.Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en het verloop op 1 graad Celsius in het pop-upvenster en klik op OK. Selecteer het type plaat naar keuze in het vervolgkeuzemenu. Voeg de afbeeldingsstap toe door op Afbeelding te klikken. Selecteer de omgekeerde imager en klik op OK. Voeg drie beeldkanalen toe en stel ze in op DAPI, RFP en Bright Field.Vink het vakje Montage aan en stel het gewenste aantal en de gewenste locatie van de afbeeldingen in. Wijzig de overlap om een betere dekking van elke put weer te geven. Selecteer welke putten moeten worden afgebeeld.Er wordt een nieuw venster geopend waarin de bronnen van belang kunnen worden geselecteerd. Klik op Focusopties om de focusmodus in te stellen. Er wordt een nieuw venster geopend.Stel elk kanaal afzonderlijk in. Gewoonlijk zijn putten automatisch gericht op het DAPI-kanaal. Stel alle andere kanalen in op Vaste brandpuntshoogte vanaf het eerste kanaal en stel in door op OK te klikken. Sluit het venster.Start de stappen voor het vooraf instellen van gegevensreductie door op Gegevensreductie te klikken en Afbeeldingsvoorbewerking te selecteren. Accepteer de standaardinstellingen door OK te selecteren. Stel een stap in om de cellen te tellen door Cellulaire analyse te selecteren. Selecteer TsF DAPI-afbeeldingen in het vervolgkeuzemenu kanaal.Stel verdere details in nadat de beeldvorming is uitgevoerd. Bereid de analyse van het RFP-signaal voor door Statistieken te selecteren in het pop-upvenster Labelstap en selecteer TsF RFP als invoerkanaal. Vink de selectievakjes Bovenwaarde en Onderwaarde aan.Vink het vakje voor Totale oppervlakte in de onderste lijst aan. Selecteer Geen in de kolom Kleureffect. Klik in het pop-upvenster op Aangepast en vink het vakje Achtergrond aan.Druk op OK. Voor een eerlijke uitlezing normaliseert u het RFP-signaal per cel door op Ratio aan de linkerkant te drukken. Selecteer in het pop-upvenster RFP Quantification Total Area. Voor Gegevensinvoer 1 in het vervolgkeuzemenu en selecteert u Celgetal als gegevensinvoer 2.Selecteer ten slotte een nieuwe gegevenssetnaam en druk tweemaal op OK. Selecteer Kleureffect zoals eerder gedemonstreerd en klik OK.In de linkerbovenhoek, selecteer Bestand en sla het bestand op als een Protocol-bestandstype. Noteer waarnemingen voor elk tijdstip nadat het eerste geval van verkalking optreedt.Druk op Nu lezen in de opstartsoftware en klik op Bestaand protocol. Selecteer het protocol dat in de vorige stap is gemaakt. Het programma zal vragen om het experiment op te slaan.Dit kan in dit stadium of later handmatig worden gedaan door linksboven op de knop Opslaan te klikken. Een pop-upvenster vraagt om te wachten tot het systeem is verwarmd. Schakel de kooldioxidegasregelaar in en stel deze in op 5% Zodra het systeem de ingestelde temperatuur heeft bereikt, verschijnt er een prompt om een plaat in te brengen en te lezen.Druk op Annuleren. Transporteer de plaat van de incubator naar de imager in een kluis om breuk en morsen te voorkomen en is in overeenstemming met de lokale bioveiligheidsvoorschriften voor het transport van levende cellen in geval van een ongeval. Plaats de plaat in de plaatlezer.Klik op Procedure. Selecteer in het pop-upvenster Vooraf ingestelde beeldbewerkingsstap. Pas eerst de focus en belichting op het DAPI-kanaal aan.Verwijder het vinkje uit het vak Automatische belichting op alle kanalen en klik vervolgens op het microscooppictogram naast het DAPI-kanaal. Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer het putje om de focus te richten.Als een signaal al zichtbaar is, klikt u eerst op Autofocus en vervolgens op Automatische belichting. Zo niet, verhoog dan eerst de belichting en herhaal autofocus en automatische belichting. De belichting kan handmatig worden aangepast door het vervolgkeuzemenu Belichting te selecteren.Controleer de instellingen op meerdere putten en sla de instellingen op. Pas de belichting op dezelfde manier aan voor alle kanalen. Zorg er voor het RFP-kanaal voor dat u begint met een put met gemiddelde tot hoge verkalking.Sluit het procedurevenster en selecteer de groene knop Nu lezen in de bovenste taakbalk. Sla het experiment op zoals aangegeven door de software. Herhaal dit proces voor elk tijdstip.Terwijl het systeem de plaat leest, worden alle afbeeldingen automatisch op de achtergrond verwerkt. Pas de instellingen voor het aantal cellen aan door TsF DAPI-afbeeldingen te selecteren om weer te geven. Selecteer het putje naar keuze door te dubbelklikken.Er verschijnt een nieuw venster. Selecteer een van de afbeeldingen. Selecteer het tabblad Analyse in het pop-upvenster.Selecteer Celaantal mobiele analyse en klik op OK. Hef de selectie van de RFP- en Bright Field-kanalen op. Schakel het selectievakje Objecten markeren in. Klik op Opties om het menu te openen.Pas de grootte- en intensiteitsdrempel aan om alle kernen op te nemen, maar sluit vuil uit en klik vervolgens op OK. Klik linksonder op Wijzigingen toepassen om de instellingen op alle afbeeldingen toe te passen. Selecteer op dezelfde manier een well-end afbeelding met een gemiddelde tot hoge hoeveelheid verkalking. Als u de signaal-ruisverhouding het beste wilt aanpassen, klikt u op het tabblad Analyse in het menu Taak.Selecteer Afbeeldingsstatistieken. Hef de selectie van het DAPI- en Bright Field-kanaal op. Klik op Opties om het menu te openen.Vink het vakje Drempeluitschieters aan. Als u de niet-subjectieve drempelwaarde voor het signaal boven de achtergrond wilt instellen, selecteert u het gereedschap Lijn op de taakbalk. Er verschijnt een venster.Teken een lijn door een signaalpatch terwijl u een gebied van de achtergrond opneemt. Pas de bovenste en onderste drempels aan. Tel alleen het signaal boven de achtergrond en sluit uit als er puin of artefacten zijn.Klik op OK en pas wijzigingen toe om de instellingen over te zetten naar alle andere bronnen. Controleer of de drempel nauwkeurig is geselecteerd in de andere putten. Zodra het aantal cellen en de RFP-drempels zijn ingesteld, exporteert u de gegevens.Klik op de Excel-knop naast het vervolgkeuzemenu om de gegevens rechtstreeks naar een spreadsheet te exporteren. Verschillende verkalkingsfasen, variërend van laag tot hoog, werden gedetecteerd en geanalyseerd. Verkalking werd gespot als zwarte spikkels met behulp van lichtmicroscopie, die nuttig waren voor primaire beoordeling en het bepalen wanneer met beeldvorming moest worden begonnen.Voor een verbeterde signaal-ruisverhouding werden de verwerkte RFP-beelden geanalyseerd om verkalking te kwantificeren. De gegevens werden verkregen door twee of meer omstandigheden op hetzelfde tijdstip te vergelijken. Gegevens werden genormaliseerd naar celtelling als verkalkingsgebied per cel.De gegevens werden ook weergegeven als een tijdreeks die dezelfde toestand op verschillende tijdstippen liet zien. Het is belangrijk dat de resultaten na datareductie en -analyse nog steeds weerspiegelen wat men kan zien vóór de beeldtransformatie en drempel.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Inductie van Eryptosis in rode bloedcellen met behulp van een calcium-Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...