Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
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Cette recherche a été financée par les programmes de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Sklodowska-Curie n ° 722609 et 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Cette recherche a été soutenue par BioSPX. WJ-D a reçu un financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) TRR219-projet ID 322900939 et projet ID 403041552

1. Ensemencement cellulaire, entretien et induction de calcification
<ol><li>Pour la culture des cellules primaires, utilisez une armoire à flux d’air laminaire, des gants et du matériel stérile. Désinfectez les mains et l’espace de travail avant et après tout travail. Traiter toutes les cellules primaires et tous les milieux de culture comme présentant un risque biologique potentiel, sauf preuve contraire. De préférence, autoclaver les cellules et les milieux excédentaires avant l’élim...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode semi-automatisée pour la détermination de la calcification in vitro . Pour cette méthode, trois étapes critiques de la calcification hVSMC doivent être optimisées. Premièrement, la densité cellulaire est essentielle au développement de la calcification hVSMC. De faibles densités de VSMC hmc entraîneront une calcification lente ou nulle et la mort cellulaire en raison de l’absence de contact de cellule à cellule et du stress induit dans des conditions ...

La calcification vasculaire (CV) est un facteur de risque indépendant de morbidité et de mortalité cardiovasculaires 1,2,3. Longtemps considéré comme un processus chimique passif de dépôt de minéraux ectopiques, il apparaît aujourd’hui comme une réponse de cicatrisation tissulaire modifiable impliquant la contribution active de diverses cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires activées (hVSMC) comme moteur de la maladie 4,5. In vivo La CV peut être mesurée par tomodensitométrie multicoupes comme évaluation de la charge athéroscléreuse 6,7,8. Actuellement, un changement de paradigme est en cours, dans lequel la gravité de la CV est de plus en plus reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire, de diabète de type II, de maladie rénale chronique et de vieillissement 9,10,11,12,13,14,15.
Les hVSMC sont le type cellulaire le plus abondant dans le système cardiovasculaire et un acteur principal dans le développement de la CV. La calcification in vitro induite par hVSMC est un modèle de maladie largement utilisé pour étudier les maladies cardiovasculaires16,17. Cependant, la plupart des protocoles de détection de la calcification in vitro utilisent des mesures de point final qui peuvent limiter l’acquisition de données, nécessitent une plus grande utilisation de matériel cellulaire et peuvent ralentir la recherche. Les méthodes courantes de détection de la calcification hVSMC in vitro comprennent le test o-crésolphtaléine, qui mesure le dépôt de calcium solubilisé par rapport aux protéines totales et nécessite une lyse cellulaire18. En outre, la coloration Alizarin Red est utilisée, qui se lie directement aux dépôts de calcium sur les cellules fixes ou les tissus19. Pour étudier la calcification de l’hVSMC au fil du temps avec l’o-crésolphtaléine ou le rouge d’Alizarine, il faut des lots de répétitions par point temporel, ce qui augmente la demande de matériel biologique et, par conséquent, augmente le risque de variabilité.
Dans cet article, nous détaillons la méthode d’application d’un nouveau test qui utilise des hVSMC avec une sonde d’imagerie fluorescente pour déterminer la progression in vitro de la CV ainsi que la fonction d’un test de calcification en phase terminale unique. Nous avons précédemment démontré que ce test est directement comparable aux méthodes o-crésolphtaléine et Alizarin Red et peut être utilisé pour distinguer différentes conditions de culture20. En plus des mesures en temps réel, ce test peut être utilisé pour déterminer la propension des échantillons de sérum ou de plasma comme marqueur de substitution pour le développement clinique de CV20. Cela facilitera l’application des stratégies biologiques des sciences cardiovasculaires et de la modélisation des maladies. Une autre application du test peut être en tant que système biohybride translationnel pour évaluer la gravité ou la progression de la CV à partir de constituants sanguins tels que le sérum ou le plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

La calcification vasculaire implique une série de pathologies dégénératives, y compris l’inflammation, les modifications du phénotype cellulaire, la mort cellulaire et l’absence d’inhibiteurs de la calcification, qui entraînent simultanément une perte d’élasticité et de fonction des vaisseaux. La calcification vasculaire est un contributeur important à la morbidité et à la mortalité dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie rénale chronique, le diabète sucré et l’athérosclérose. Les modèles de recherche actuels pour étudier la calcification vasculaire sont limités et ne sont viables qu’aux derniers stades du développement de la calcification in vivo. Les outils in vitro pour étudier la calcification vasculaire utilisent des mesures de point final, ce qui augmente les exigences en matière de matériel biologique et risque d’introduire de la variabilité dans les études de recherche. Nous démontrons l’application d’une nouvelle sonde marquée par fluorescence qui se lie au développement de la calcification in vitro sur les cellules musculaires lisses vasculaires humaines et détermine le développement en temps réel de la calcification in vitro . Dans ce protocole, nous décrivons l’application de notre nouveau test de calcification, un nouvel outil de modélisation des maladies qui a des applications translationnelles potentielles. Nous envisageons que ce test soit pertinent dans un spectre plus large de la recherche sur les dépôts minéraux, y compris les applications dans la recherche sur les os, le cartilage ou les dents.

Le résultat comprend des images originales de noyaux colorés par HOECHST, une calcification marquée par RFP et des images en fond clair. Différents stades de calcification allant de faible (Figure 2) à élevé (Figure 3) peuvent être détectés et analysés. La calcification peut généralement être repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique (Figure 2D et Figure 3B</strong...

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A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.

Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Notre méthode permet de mesurer la propension à la calcification des échantillons de patients à l’aide de cellules musculaires lisses vasculaires humaines. Cela aidera à propulser la recherche sur les troubles de calcification vasculaire, en aidant au développement de nouvelles thérapies. Cette technique utilise une détection par fluorescence, ce qui augmente la sensibilité et permet de mesurer les échantillons au fil du temps, réduisant ainsi le besoin de réplications et augmentant la robustesse.Pour commencer, la culture de cellules musculaires lisses vasculaires humaines sur des flacons de culture cellulaire non enrobés à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Divisez les cellules en atteignant 70 à 90% de confluence. Pour fractionner, lavez les HVSMC deux fois avec du PBS.Ajouter la trypsine et incuber pendant 2 à 5 minutes à 37 degrés Celsius. Inhiber la réaction de trypsine en ajoutant un milieu contenant du sérum. Centrifuger les cellules pendant 4 minutes à 350 RCF et remettre la pastille en suspension dans un milieu d’entretien.Après avoir préparé les cellules pour une scission comme démontré, comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de 48 puits pour commencer l’expérience de calcification. Après une incubation nocturne à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone à 5%, laver doucement les cellules deux fois avec du PBS, en aspirant soigneusement tout le PBS restant après le deuxième lavage. Ajouter doucement le milieu de calcification et incuber davantage à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Vérifiez quotidiennement avec un microscope optique jusqu’à ce que la calcification se produise. Pour détecter la calcification par imagerie, ouvrez le logiciel et sélectionnez Protocoles et Créer nouveau. Sélectionnez Procédure et cliquez sur Définir la température.Réglez la température sur 37 degrés Celsius et le dégradé sur 1 degré Celsius dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur OK. Sélectionnez le type d’assiette de votre choix dans le menu déroulant. Ajoutez l’étape d’imagerie en cliquant sur Image. Sélectionnez l’imageur inversé et cliquez sur OK. Ajoutez trois canaux d’imagerie et réglez-les sur DAPI, RFP et Bright Field.Cochez la case Montage et définissez le nombre et l’emplacement souhaités des images. Modifiez le chevauchement pour représenter une meilleure couverture de chaque puits. Sélectionnez les puits à imager.Une nouvelle fenêtre s’ouvrira où les puits d’intérêt pourront être sélectionnés. Cliquez sur Options de mise au point pour définir le mode de mise au point. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.Définissez chaque canal individuellement. Généralement, les puits sont auto-focalisés sur le canal DAPI. Réglez tous les autres canaux sur Hauteur focale fixe à partir du premier canal et définissez en cliquant sur OK. Fermez la fenêtre.Démarrez les étapes de préréglage de la réduction des données en cliquant sur Réduction des données et sélectionnez Prétraitement d’image. Acceptez les paramètres par défaut en sélectionnant OK. Configurez une étape pour compter les cellules en sélectionnant Analyse cellulaire. Sélectionnez TsF DAPI Images dans le menu déroulant des canaux.Définissez d’autres détails après l’exécution de l’imagerie. Préparez l’analyse du signal RFP en sélectionnant Statistiques dans l’étape Étiquette de la fenêtre contextuelle et sélectionnez TsF RFP comme canal d’entrée. Cochez les cases Valeur supérieure et Valeur inférieure.Cochez la case Surface totale dans la liste inférieure. Sélectionnez Aucun dans la colonne Effet de couleur. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Personnalisé et cochez la case Arrière-plan.Appuyez sur OK. Pour une lecture équitable, normalisez le signal RFP par cellule en appuyant sur Rapport sur le côté gauche. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Quantification de la DP Surface totale. Pour Data Input 1 dans le menu déroulant et sélectionnez Cell Count as Data Input 2.Enfin, sélectionnez un nouveau nom d’ensemble de données et appuyez deux fois sur OK. Sélectionnez Effet de couleur comme illustré précédemment, puis cliquez OK.In le coin supérieur gauche, sélectionnez Fichier et enregistrez le fichier en tant que type de fichier de protocole. Enregistrez les observations pour chaque point temporel suivant la première instance de calcification.Appuyez sur Lire maintenant dans le logiciel de démarrage et cliquez sur Protocole existant. Sélectionnez le protocole créé à l’étape précédente. Le programme vous invitera à enregistrer l’expérience.Cela peut être fait à ce stade ou plus tard manuellement en cliquant sur le bouton Enregistrer en haut à gauche. Une fenêtre pop-up vous demandera d’attendre que le système chauffe. Allumez le contrôleur de gaz de dioxyde de carbone et réglez-le sur 5%Une fois que le système a atteint la température réglée, une invite apparaîtra pour insérer une plaque et lire.Appuyez sur Annuler. Transportez la plaque de l’incubateur à l’imageur dans une boîte sûre pour éviter les bris et les déversements et est conforme aux réglementations locales en matière de biosécurité pour le transport de cellules vivantes en cas d’accident. Placez la plaque dans le lecteur de plaques.Cliquez sur Procédure. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Étape de création d’image prédéfinie. Ajustez d’abord la mise au point et l’exposition sur le canal DAPI.Décochez la case Exposition automatique sur tous les canaux, puis cliquez sur l’icône du microscope en regard du canal DAPI. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Sélectionnez le puits pour diriger la mise au point.Si un signal est déjà visible, cliquez d’abord sur Autofocus, puis sur Auto Exposure. Sinon, augmentez d’abord l’exposition et répétez l’autofocus et l’exposition automatique. L’exposition peut être ajustée manuellement en sélectionnant le menu déroulant Exposition.Vérifiez les paramètres sur plusieurs puits, puis enregistrez les paramètres. Ajustez l’exposition de la même manière pour tous les canaux. Pour le canal RFP, assurez-vous de commencer par un puits avec une calcification moyenne à élevée.Fermez la fenêtre de procédure et sélectionnez le bouton vert Lire maintenant dans la barre des tâches supérieure. Enregistrez l’expérience comme indiqué par le logiciel. Répétez ce processus pour chaque point temporel.Pendant que le système lit la plaque, toutes les images sont automatiquement traitées en arrière-plan. Ajustez les paramètres de nombre de cellules en sélectionnant les images DAPI TsF à afficher. Sélectionnez le puits de votre choix en double-cliquant.Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Sélectionnez l’une des images. Sélectionnez l’onglet Analyse dans la fenêtre contextuelle.Sélectionnez Nombre de cellules d’analyse cellulaire et cliquez sur OK. Désélectionnez les canaux RFP et Champ lumineux. Cochez la case Mettre en surbrillance les objets. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu.Ajustez le seuil de taille et d’intensité pour inclure tous les noyaux, mais excluez les débris, puis cliquez sur OK. Cliquez sur Appliquer les modifications en bas à gauche pour appliquer les paramètres à toutes les images. De même, sélectionnez une image bien fin avec une quantité moyenne à élevée de calcification. Pour régler au mieux le rapport signal/bruit, cliquez sur l’onglet Analyse dans le menu Tâche.Sélectionnez Statistiques d’image. Désélectionnez le canal DAPI et Champ clair. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu.Cochez la case Valeurs aberrantes de seuil. Pour définir la valeur de seuil non subjective du signal au-dessus de l’arrière-plan, sélectionnez l’outil Ligne dans la barre des tâches. Une fenêtre apparaîtra.Tracez une ligne à travers une zone de signal tout en incluant une zone de l’arrière-plan. Ajustez les valeurs supérieures et inférieures des seuils. Ne comptez le signal au-dessus de l’arrière-plan et excluez s’il y a des débris ou des artefacts.Cliquez sur OK et appliquez les modifications pour transférer les paramètres vers tous les autres puits. Confirmer que le seuil est sélectionné avec précision dans les autres puits. Une fois le nombre de cellules et les seuils d’appel d’offres définis, exportez les données.Cliquez sur le bouton Excel en regard du menu déroulant pour exporter les données directement dans une feuille de calcul. Différents stades de calcification allant de bas à haut ont été détectés et analysés. La calcification a été repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique, qui ont été utiles pour l’évaluation primaire et la détermination du moment de commencer l’imagerie.Pour améliorer le rapport signal/bruit, les images RFP traitées ont été analysées pour quantifier la calcification. Les données ont été obtenues en comparant deux conditions ou plus au même moment. Les données ont été normalisées au nombre de cellules en tant que zone de calcification par cellule.Les données ont également été présentées sous la forme d’une série chronologique montrant la même condition à divers moments. Il est important que les résultats après la réduction et l’analyse des données reflètent toujours ce que l’on peut voir avant la transformation de l’image et le seuil.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Recherche

Biochimie

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Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

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Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

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Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

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The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

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Mesure fluorescente semi-automatisée en temps réel du pH liquide de la surface des voies respiratoires des cellules épithéliales des voies respiratoires primaires de l’homme

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

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