Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
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Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Innovationsprogramme Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Sklodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 722609 und 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007), finanziert. Diese Forschung wurde von BioSPX unterstützt. WJ-D erhielt Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-Projekt-ID 322900939 und Projekt-ID 403041552

1. Zellaussaat, -erhaltung und -induktion
<ol><li>Verwenden Sie für die Kultivierung von Primärzellen einen Laminar-Airflow-Schrank, Handschuhe und sterile Geräte. Desinfizieren Sie Hände und Arbeitsbereich vor und nach der Durchführung von Arbeiten. Behandeln Sie alle Primärzellen und Kulturmedien als potenzielle biologische Gefahr, sofern nicht das Gegenteil bewiesen wird. Vorzugsweise überschüssige Zellen und Medien vor der Entsorgung autoklavieren. Nicht chemisch inaktivieren und autoklavie...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

In diesem Manuskript beschreiben wir eine halbautomatische Methode zur in vitro Verkalkungsbestimmung. Für diese Methode sollten drei kritische Schritte der hVSMC-Verkalkung optimiert werden. Erstens ist die Zelldichte entscheidend für die Entwicklung der hVSMC-Verkalkung. Niedrige Dichten von hVSMCs führen zu langsamer oder keiner Verkalkung und Zelltod aufgrund des fehlenden Zell-zu-Zell-Kontakts und des Stresses, der unter kalzifizierenden Bedingungen induziert wird21. Hohe Zelldich...

Vaskuläre Verkalkung (VC) ist ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität 1,2,3. Lange Zeit als passiver chemischer Prozess der ektopischen Mineralablagerung betrachtet, erscheint es nun als modifizierbare Gewebeheilungsreaktion, die den aktiven Beitrag verschiedener Zellen einschließlich aktivierter vaskulärer glatter Muskelzellen (hVSMC) als Treiber der Krankheit beinhaltet 4,5. Im lebenden Organismus VC kann durch Multislice-CT-Scans als Beurteilung der atherosklerotischen Belastung gemessen werden 6,7,8. Derzeit ist ein Paradigmenwechsel im Gange, bei dem der Schweregrad von VC als Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-II-Diabetes, chronische Nierenerkrankungen und das Altern anerkannt wird 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs sind der häufigste Zelltyp im Herz-Kreislauf-System und ein Hauptakteur bei der Entwicklung von VC. In-vitro-hVSMC-induzierte Verkalkung ist ein weit verbreitetes Krankheitsmodell zur Untersuchung kardiovaskulärer Erkrankungen16,17. Die meisten Protokolle zum Nachweis von In-vitro-Verkalkung verwenden jedoch Endpunktmessungen, die die Datenerfassung einschränken, eine stärkere Verwendung von Zellmaterial erfordern und die Forschung verlangsamen können. Gängige Methoden zum Nachweis von in vitro hVSMC-Verkalkung umfassen den o-Cresolphthalein-Assay, der die solubilisierte Calciumablagerung gegen das Gesamtprotein misst und eine Zelllyse erfordert18. Außerdem wird Alizarin-Rot-Färbung verwendet, die direkt an Kalziumablagerungen auf festen Zellen oder Gewebe bindet19. Um die hVSMC-Verkalkung im Laufe der Zeit mit o-Cresolphthalein oder Alizarinrot zu untersuchen, sind Chargen von Replikaten pro Zeitpunkt erforderlich, was den Bedarf an biologischem Material erhöht und damit die Wahrscheinlichkeit einer Variabilität erhöht.
In diesem Artikel beschreiben wir die Methode für die Anwendung eines neuartigen Assays, der hVSMCs mit einer fluoreszierenden Bildgebungssonde verwendet, um die In-vitro-VC-Progression zu bestimmen und als singulärer Verkalkungsassay im Endstadium zu fungieren. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Assay direkt mit den o-Cresolphthalein- und Alizarin-Rot-Methoden vergleichbar ist und zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Kulturbedingungen verwendet werden kann20. Zusätzlich zu Echtzeitmessungen kann dieser Assay verwendet werden, um die Neigung von Serum- oder Plasmaproben als Surrogatmarker für die klinische VC-Entwicklung zu bestimmen20. Dies wird bei der Anwendung biologischer Strategien der kardiovaskulären Wissenschaften und der Krankheitsmodellierung helfen. Eine weitere Anwendung des Assays kann als translationales BioHybrid-System zur Beurteilung des Schweregrads oder der Progression von VC aus Blutbestandteilen wie Serum oder Plasma erfolgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Gefäßverkalkung beinhaltet eine Reihe von degenerativen Pathologien, einschließlich Entzündungen, Veränderungen des zellulären Phänotyps, Zelltod und das Fehlen von Verkalkungsinhibitoren, die gleichzeitig zu einem Verlust der Gefäßelastizität und -funktion führen. Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Faktor für Morbidität und Mortalität in vielen Pathologien, einschließlich chronischer Nierenerkrankungen, Diabetes mellitus und Atherosklerose. Aktuelle Forschungsmodelle zur Untersuchung der Gefäßverkalkung sind begrenzt und nur in den späten Stadien der Verkalkungsentwicklung in vivo realisierbar. In-vitro-Werkzeuge zur Untersuchung von Gefäßverkalkungen verwenden Endpunktmessungen, was die Anforderungen an biologisches Material erhöht und die Einführung von Variabilität in Forschungsstudien riskiert. Wir demonstrieren die Anwendung einer neuartigen fluoreszenzmarkierten Sonde, die an die In-vitro-Verkalkungsentwicklung an menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen bindet und die Echtzeitentwicklung der In-vitro-Verkalkung bestimmt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung unseres neu entwickelten Verkalkungsassays, eines neuartigen Werkzeugs in der Krankheitsmodellierung, das potenzielle translationale Anwendungen hat. Wir gehen davon aus, dass dieser Assay in einem breiteren Spektrum der Mineralablagerungsforschung relevant ist, einschließlich Anwendungen in der Knochen-, Knorpel- oder Zahnforschung.

Das Ergebnis umfasst Originalbilder von HOECHST-gefärbten Kernen, RFP-markierter Verkalkung und Hellfeldbildern. Verschiedene Verkalkungsstadien von niedrig (Abbildung 2) bis hoch (Abbildung 3) können erkannt und analysiert werden. Verkalkungen können normalerweise als schwarze Sprenkel mittels Lichtmikroskopie erkannt werden (Abbildung 2D und Abbildung 3B, Pfeile zeigen Verkalkung an), die für die ...

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A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Gefäßverkalkungen tragen wesentlich zur Belastung durch kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der durch vaskuläre glatte Muskelzellen vermittelten Kalziumfällung in vitro durch fluoreszierende Bildgebung.

Eine halbautomatische und reproduzierbare biologisch basierte Methode zur Quantifizierung der Kalziumablagerung in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Unsere Methode ermöglicht es, die Verkalkungsneigung von Patientenproben mit humanen vaskulären glatten Muskelzellen zu messen. Dies wird dazu beitragen, die Erforschung von Gefäßverkalkungsstörungen voranzutreiben und die Entwicklung neuer Therapien zu unterstützen. Diese Technik verwendet eine fluoreszierende Detektion, die die Empfindlichkeit erhöht und es ermöglicht, Proben im Laufe der Zeit zu messen, wodurch der Bedarf an Replikaten reduziert und die Robustheit erhöht wird.Zu Beginn kultivieren Sie menschliche glatte Gefäßmuskelzellen auf unbeschichteten Zellkulturkolben bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Teilen Sie die Zellen bei Erreichen von 70 bis 90%Konfluenz. Zum Spalten die HVSMCs zweimal mit PBS waschen.Trypsin hinzufügen und 2 bis 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Hemmen Sie die Trypsinreaktion, indem Sie ein serumhaltiges Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 4 Minuten bei 350 RCF und resuspendieren Sie das Pellet in einem Wartungsmedium.Nachdem Sie die Zellen wie gezeigt für eine Spaltung vorbereitet haben, zählen und säen Sie die Zellen in eine 48-Well-Platte, um das Verkalkungsexperiment zu starten. Nach nächtlicher Inkubation bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen und nach der zweiten Wäsche alle verbleibenden PBS vorsichtig absaugen. Verkalkungsmedium vorsichtig zugeben und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid weiter inkubieren.Überprüfen Sie täglich mit einem Lichtmikroskop, bis eine Verkalkung auftritt. Um Verkalkungen durch Bildgebung zu erkennen, öffnen Sie die Software und wählen Sie Protokolle und Neu erstellen. Wählen Sie Verfahren und klicken Sie auf Temperatur einstellen.Stellen Sie die Temperatur im Popup-Fenster auf 37 Grad Celsius und den Farbverlauf auf 1 Grad Celsius ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie den gewünschten Plattentyp aus dem Dropdown-Menü aus. Fügen Sie den Imaging-Schritt hinzu, indem Sie auf Image klicken. Wählen Sie den Inverted Imager aus und klicken Sie auf OK. Fügen Sie drei Bildkanäle hinzu und stellen Sie sie auf DAPI, RFP und Hellfeld ein.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Montage und legen Sie die gewünschte Anzahl und Position der Bilder fest. Ändern Sie die Überlappung, um eine bessere Abdeckung jedes Bohrlochs darzustellen. Wählen Sie aus, welche Vertiefungen abgebildet werden sollen.Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die interessierenden Brunnen ausgewählt werden können. Klicken Sie auf Fokusoptionen, um den Fokusmodus festzulegen. Es öffnet sich ein neues Fenster.Stellen Sie jeden Kanal einzeln ein. Im Allgemeinen werden Wells automatisch auf den DAPI-Kanal fokussiert. Stellen Sie alle anderen Kanäle vom ersten Kanal auf Festbrennweite ein und legen Sie sie fest, indem Sie auf OK klicken. Schließen Sie das Fenster.Starten Sie die Schritte zur Voreinstellung der Datenreduktion, indem Sie auf Datenreduktion klicken und Bildvorverarbeitung auswählen. Übernehmen Sie die Standardeinstellungen, indem Sie OK auswählen. Richten Sie einen Schritt zum Zählen der Zellen ein, indem Sie Zellanalyse auswählen. Wählen Sie TsF DAPI Images aus dem Kanal-Dropdown-Menü aus.Stellen Sie weitere Details ein, nachdem die Bildgebung durchgeführt wurde. Bereiten Sie die Analyse des RFP-Signals vor, indem Sie im Popup-Fenster Beschriftungsschritt Statistik auswählen und TsF RFP als Eingangskanal auswählen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Oberer Wert und Unterer Wert.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Gesamtfläche in der unteren Liste. Wählen Sie in der Spalte Farbeffekt die Option Keine aus. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Benutzerdefiniert und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hintergrund.Drücken Sie OK. Für eine faire Anzeige normalisieren Sie das RFP-Signal pro Zelle, indem Sie Ratio auf der linken Seite drücken. Wählen Sie im Popup-Fenster RFP-Quantifizierungsgesamtfläche aus. Wählen Sie für Dateneingabe 1 aus dem Dropdown-Menü Zellenanzahl als Dateneingabe 2 aus.Wählen Sie abschließend einen neuen Datensatznamen aus und drücken Sie zweimal OK. Wählen Sie Farbeffekt wie zuvor gezeigt, klicken Sie OK.In der oberen linken Ecke, wählen Sie Datei und speichern Sie die Datei als Protokolldateityp. Zeichnen Sie Beobachtungen für jeden Zeitpunkt nach dem ersten Verkalkungsfall auf.Drücken Sie in der Startsoftware auf Jetzt lesen und klicken Sie auf Vorhandenes Protokoll. Wählen Sie das im vorherigen Schritt erstellte Protokoll aus. Das Programm fordert Sie auf, das Experiment zu speichern.Dies kann zu diesem Zeitpunkt oder später manuell erfolgen, indem Sie oben links auf die Schaltfläche Speichern klicken. Ein Popup-Fenster fordert Sie auf, zu warten, bis sich das System erwärmt hat. Schalten Sie den Kohlendioxid-Gasregler ein und stellen Sie ihn auf 5% einSobald das System die eingestellte Temperatur erreicht hat, wird eine Aufforderung angezeigt, eine Platte einzulegen und zu lesen.Drücken Sie Abbrechen. Transportieren Sie die Platte vom Inkubator zum Imager in einem Safe, um Bruch und Verschütten zu vermeiden, und entspricht den lokalen Biosicherheitsvorschriften für den Transport lebender Zellen im Falle eines Unfalls. Legen Sie die Platte in das Plattenlesegerät.Klicken Sie auf Verfahren. Wählen Sie im Popup-Fenster Preset Imaging Step aus. Passen Sie zuerst den Fokus und die Belichtung auf dem DAPI-Kanal an.Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Automatische Belichtung" bei allen Kanälen, und klicken Sie dann auf das Mikroskopsymbol neben dem DAPI-Kanal. Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie die Vertiefung aus, um den Fokus zu lenken.Wenn bereits ein Signal sichtbar ist, klicken Sie zuerst auf Autofokus und dann auf Automatische Belichtung. Wenn nicht, erhöhen Sie zuerst die Belichtung und wiederholen Sie den Autofokus und die automatische Belichtung. Die Belichtung kann manuell angepasst werden, indem Sie das Dropdown-Menü Belichtung auswählen.Überprüfen Sie die Einstellungen für mehrere Bohrlöcher und speichern Sie dann die Einstellungen. Stellen Sie die Belichtung für alle Kanäle auf die gleiche Weise ein. Stellen Sie für den RFP-Kanal sicher, dass Sie mit einem Bohrloch mit mittlerer bis hoher Verkalkung beginnen.Schließen Sie das Prozedurfenster und wählen Sie die grüne Schaltfläche Jetzt lesen in der oberen Taskleiste. Speichern Sie das Experiment wie von der Software angegeben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt.Während das System die Platte liest, werden alle Bilder automatisch im Hintergrund verarbeitet. Passen Sie die Einstellungen für die Zellanzahl an, indem Sie TsF-DAPI-Bilder auswählen, die angezeigt werden sollen. Wählen Sie den Brunnen Ihrer Wahl durch Doppelklick aus.Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie eines der Bilder aus. Wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte Analyse aus.Wählen Sie Cell Analysis Cell Count (Zellanalyse-Zellanzahl) und klicken Sie auf OK. Deaktivieren Sie die Kanäle RFP und Hellfeld. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Objekte hervorheben. Klicken Sie auf Optionen, um das Menü zu öffnen.Passen Sie den Schwellenwert für Größe und Intensität an, um alle Kerne einzubeziehen, aber Schmutz auszuschließen, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie unten links auf Änderungen übernehmen, um die Einstellungen auf alle Bilder anzuwenden. Wählen Sie auf ähnliche Weise ein Well-End-Bild mit einer mittleren bis hohen Menge an Verkalkung. Um das Signal-Rausch-Verhältnis optimal anzupassen, klicken Sie im Menü Task auf die Registerkarte Analyse.Wählen Sie Bildstatistik aus. Deaktivieren Sie den DAPI- und Hellfeldkanal. Klicken Sie auf Optionen, um das Menü zu öffnen.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Schwellenwertausreißer. Um den nicht subjektiven Schwellenwert für das Signal über dem Hintergrund festzulegen, wählen Sie in der Taskleiste das Linienwerkzeug aus. Es öffnet sich ein Fenster.Zeichnen Sie eine Linie durch ein Signalfeld, während Sie einen Bereich des Hintergrunds einschließen. Passen Sie die oberen und unteren Werte der Schwellenwerte an. Zählen Sie nur das Signal über dem Hintergrund und schließen Sie aus, wenn Trümmer oder Artefakte vorhanden sind.Klicken Sie auf OK und übernehmen Sie die Änderungen, um die Einstellungen auf alle anderen Bohrlöcher zu übertragen. Vergewissern Sie sich, dass der Schwellenwert in den anderen Vertiefungen genau ausgewählt ist. Sobald die Zellzahl und die RFP-Schwellenwerte festgelegt sind, exportieren Sie die Daten.Klicken Sie auf die Excel-Schaltfläche neben dem Dropdown-Menü, um die Daten direkt in eine Tabelle zu exportieren. Verschiedene Verkalkungsstadien von niedrig bis hoch wurden detektiert und analysiert. Verkalkungen wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie als schwarze Sprenkel entdeckt, die für die primäre Beurteilung und die Bestimmung des Zeitpunkts für den Beginn der Bildgebung nützlich waren.Für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis wurden die verarbeiteten RFP-Bilder analysiert, um die Verkalkung zu quantifizieren. Die Daten wurden durch den Vergleich von zwei oder mehr Bedingungen zum gleichen Zeitpunkt erhalten. Die Daten wurden auf die Zellzahl als Verkalkungsfläche pro Zelle normalisiert.Die Daten wurden auch als Zeitreihe dargestellt, die den gleichen Zustand zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt. Es ist wichtig, dass die Ergebnisse nach Datenreduktion und Analyse immer noch das widerspiegeln, was man vor der Bildtransformation und Schwellenwertbildung sehen kann.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...