Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי תוכניות המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי סקלודובסקה-קירי No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). מחקר זה נתמך על ידי BioSPX. WJ-D קיבל מימון מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) TRR219-מזהה פרויקט 322900939 ומזהה פרויקט 403041552

1. זריעת תאים, תחזוקה והסתיידות
<ol><li>לגידול תאים ראשוניים, השתמש בארון זרימת אוויר למינרי, כפפות וציוד סטרילי. יש לחטא את הידיים ואת סביבת העבודה לפני ואחרי ביצוע כל עבודה. התייחסו לכל התאים הראשוניים ואמצעי התרבית כאל ביו-האזרד פוטנציאלי, אלא אם כן הוכח אחרת. רצוי אוטוקלאב תאים עו...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חצי אוטומטית לקביעת הסתיידות במבחנה . עבור שיטה זו, יש לייעל שלושה שלבים קריטיים של הסתיידות hVSMC. ראשית, צפיפות התאים היא קריטית להתפתחות הסתיידות hVSMC. צפיפות נמוכה של hVSMCs תגרום להסתיידות איטית או ללא הסתיידות ולמוות של תאים עקב היעדר מגע בין תא לתא והלחץ המוש?...

הסתיידות כלי דם (VC) היא גורם סיכון עצמאי לתחלואה קרדיווסקולרית ותמותה 1,2,3. הוא נחשב זה מכבר לתהליך כימי פסיבי של תצהיר מינרלים חוץ רחמיים, וכעת הוא נראה כתגובת ריפוי רקמות הניתנת לשינוי הכוללת תרומה אקטיבית של תאים שונים, כולל תאי שריר חלק של כלי הדם המופעלים (hVSMC) כגורם למחלה 4,5. In vivo ניתן למדוד VC על ידי סריקות CT מרובות פרוסות כהערכה של עומס טרשת עורקים 6,7,8. כיום, מתרחש שינוי פרדיגמה, שבו חומרת VC הופכת להיות מוכרת כגורם סיכון למחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, מחלת כליות כרונית והזדקנות 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת הלב וכלי הדם ושחקן מרכזי בפיתוח VC. הסתיידות המושרה על-ידי hVMC במבחנה היא מודל מחלות נפוץ לחקר מחלות לב וכלי דם16,17. עם זאת, רוב הפרוטוקולים לזיהוי הסתיידות חוץ גופית משתמשים במדידות נקודת קצה שיכולות להגביל את רכישת הנתונים, דורשות שימוש רב יותר בחומר תאי ויכולות להאט את המחקר. שיטות נפוצות לזיהוי הסתיידות hVSMC במבחנה כוללות את בדיקת o-cresolphthalein, המודדת תצהיר סידן מסיס כנגד סך החלבון ודורשת תזה18. כמו כן, מכתים אדומים Alizarin משמש, אשר נקשר ישירות משקעי סידן על תאים קבועים או רקמות19. כדי לחקור הסתיידות hVSMC לאורך זמן עם o-cresolphthalein או Alizarin אדום דורש קבוצות של שכפולים לכל נקודת זמן, להגדיל את הביקוש על חומר ביולוגי, בתורו, להגדיל את הסיכוי של השתנות.
במאמר זה אנו מפרטים את השיטה ליישום בדיקה חדשנית המשתמשת ב- hVSMCs עם בדיקת הדמיה פלואורסצנטית כדי לקבוע התקדמות VC במבחנה , כמו גם לתפקד כבדיקת הסתיידות חד-שלבית סופית. הוכחנו בעבר כי בדיקה זו דומה באופן ישיר לשיטות o-cresolphthalein ו- Alizarin Red וניתן להשתמש בה כדי להבחין בין תנאי תרבית משתנים20. בנוסף למדידות בזמן אמת, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את הנטייה של דגימות סרום או פלזמה כסמן פונדקאי לפיתוח VC קליני20. זה יסייע ביישום אסטרטגיות ביולוגיות של מדעי הלב וכלי הדם ומידול מחלות. יישום נוסף של הבדיקה עשוי להיות כמערכת BioHybrid תרגומית להערכת חומרת VC או התקדמות ממרכיבי דם כגון סרום או פלזמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

הסתיידות כלי הדם כוללת סדרה של פתולוגיות ניווניות, כולל דלקת, שינויים בפנוטיפ התאים, מוות של תאים והיעדר מעכבי הסתיידות, שמובילים במקביל לאובדן גמישות ותפקוד כלי הדם. הסתיידות כלי הדם תורמת תרומה חשובה לתחלואה ולתמותה בפאתולוגיות רבות, כולל מחלת כליות כרונית, סוכרת וטרשת עורקים. מודלי המחקר הנוכחיים לחקר הסתיידות כלי הדם מוגבלים וניתנים ליישום רק בשלבים מאוחרים של התפתחות ההסתיידות in vivo. כלים במבחנה לחקר הסתיידות כלי דם משתמשים במדידות נקודת קצה, מגדילים את הדרישות מחומר ביולוגי ומסתכנים בהכנסת שונות למחקרים. אנו מדגימים את היישום של בדיקה חדשנית המסומנת באופן פלואורסצנטי הנקשרת להתפתחות הסתיידות במבחנה על תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים וקובעת את ההתפתחות בזמן אמת של הסתיידות חוץ גופית . בפרוטוקול זה אנו מתארים את היישום של בדיקת ההסתיידות החדשה שפיתחנו, כלי חדשני במידול מחלות שיש לו יישומים תרגומיים פוטנציאליים. אנו צופים כי בדיקה זו תהיה רלוונטית במגוון רחב יותר של מחקרי תצהיר מינרלים, כולל יישומים במחקר עצמות, סחוס או שיניים.

התוצאה כוללת תמונות מקוריות של גרעינים מוכתמים ב-HOECHST, הסתיידות עם תווית RFP ותמונות שדה בהיר. ניתן לזהות ולנתח שלבים שונים של הסתיידות הנעים בין נמוך (איור 2) לגבוה (איור 3). בדרך כלל ניתן לזהות הסתיידות ככתמים שחורים באמצעות מיקרוסקופיית אור (איור 2...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם. הסתיידות כלי הדם תורמת באופן משמעותי לנטל התחלואה והתמותה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לכימות משקעי סידן בתיווך תאי שריר חלקים במבחנה על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן במבחנה

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

השיטה שלנו מאפשרת למדוד נטייה להסתיידות של דגימות מטופלים באמצעות תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים. זה יעזור להניע מחקר על הפרעות הסתיידות כלי הדם, סיוע בפיתוח של טיפולים חדשים. טכניקה זו משתמשת בזיהוי מבוסס פלואורסצנט, אשר מגביר את הרגישות ומאפשר למדוד דגימות לאורך זמן, ובכך להפחית את הצורך בשכפולים ולהגדיל את החוסן.בתור התחלה, תרבית תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים על תרבית תאים לא מצופים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. פצלו את התאים כדי להגיע ל-70% עד 90% מפגש. כדי לפצל, לשטוף את HVSMCs פעמיים עם PBS.יש להוסיף טריפסין ולדגירה במשך 2 עד 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לעכב את תגובת הטריפסין על ידי הוספת סרום המכיל מדיום. צנטריפוגה של התאים במשך 4 דקות ב 350 RCF ולתלות את הכדור במדיום תחזוקה.לאחר הכנת התאים לפיצול כפי שהודגם, ספרו וזרעו את התאים לצלחת של 48 בארות כדי להתחיל בניסוי ההסתיידות. לאחר דגירה לילית ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, יש לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS, תוך שאיפה זהירה של כל ה-PBS הנותרים לאחר השטיפה השנייה. מוסיפים בעדינות מדיום הסתיידות ומדגרים עוד יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.יש לבדוק מדי יום במיקרוסקופ אור עד להתרחשות ההסתיידות. כדי לזהות הסתיידות באמצעות הדמיה, פתח את התוכנה ובחר פרוטוקולים וצור חדש. בחר הליך ולחץ על הגדר טמפרטורה.הגדר את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס ואת השיפוע ל- 1 מעלות צלזיוס בחלון המוקפץ ולחץ על אישור. בחר את סוג הצלחת לבחירה מהתפריט הנפתח. הוסף את שלב ההדמיה על-ידי לחיצה על תמונה. בחרו בתמונה ההפוכה ולחצו על הלחצן 'אשר'. הוסף שלושה ערוצי הדמיה והגדר אותם ל- DAPI, RFP ו- Bright Field.סמן את תיבת מונטאז 'והגדר את המספר והמיקום הרצויים של התמונות. שנה את החפיפה כדי לייצג כיסוי טוב יותר של כל באר. בחר אילו בארות יש לדמות.ייפתח חלון חדש שבו ניתן יהיה לבחור את הבארות המעניינות. לחצו על 'אפשרויות מיקוד' כדי להגדיר את מצב המיקוד. חלון חדש ייפתח.הגדר כל ערוץ בנפרד. בדרך כלל, בארות ממוקדות אוטומטית בערוץ DAPI. הגדר את כל הערוצים האחרים לגובה מוקד קבוע מהערוץ הראשון והגדר על-ידי לחיצה על אישור. סגור את החלון.התחל את שלבי הפחתת הנתונים המוגדרים מראש על-ידי לחיצה על הפחתת נתונים ובחר עיבוד מקדים של תמונה. קבל את הגדרות ברירת המחדל על-ידי בחירה באפשרות אישור. הגדר שלב לספירת התאים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח סלולארי. בחר תמונות TsF DAPI מהתפריט הנפתח של הערוץ.הגדר פרטים נוספים לאחר ביצוע ההדמיה. הכן את הניתוח של אות ה- RFP על-ידי בחירה באפשרות סטטיסטיקה בחלון המוקפץ שלב תווית ובחר TsF RFP כערוץ הקלט. סמן את התיבות ערך עליון וערך תחתון.סמן את התיבה עבור שטח כולל ברשימה התחתונה. בחרו 'ללא' בעמודה 'אפקט צבע'. בחלון המוקפץ, לחץ על מותאם אישית וסמן את התיבה רקע.לחץ על OK. לקריאה הוגנת, נרמל את אות ה- RFP לכל תא על-ידי לחיצה על Ratio בצד שמאל. בחלון המוקפץ, בחר שטח כולל של כימות RFP. עבור קלט נתונים 1 מהתפריט הנפתח ובחר ספירת תאים כקלט נתונים 2.לבסוף, בחר שם ערכת נתונים חדש ולחץ על אישור פעמיים. בחרו 'אפקט צבע' כפי שהודגם קודם לכן, לחצו OK.In בפינה השמאלית העליונה, בחרו 'קובץ' ושמרו את הקובץ כסוג קובץ Protocol. רשום תצפיות עבור כל נקודת זמן לאחר התרחשות המופע הראשון של הסתיידות.לחץ על קרא עכשיו בתוכנת ההפעלה ולחץ על פרוטוקול קיים. בחר את הפרוטוקול שנוצר בשלב הקודם. התוכנית תבקש לשמור את הניסוי.ניתן לעשות זאת בשלב זה או מאוחר יותר באופן ידני על ידי לחיצה על להציל כפתור בפינה השמאלית העליונה. חלון קופץ יבקש להמתין עד שהמערכת תתחמם. הפעל את בקר גז הפחמן הדו חמצני והגדר אותו ל -5% לאחר שהמערכת הגיעה לטמפרטורה שנקבעה, תופיע הנחיה להכניס צלחת ולקרוא.לחץ על ביטול. העבירו את הצלחת מהאינקובטור אל ההדמיה בכספת כדי למנוע שבירה ושפיכה, והיא עולה בקנה אחד עם תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות להובלת תאים חיים במקרה של תאונה. הכניסו את הצלחת לקורא הצלחות.לחץ על נוהל. בחלון המוקפץ, בחרו 'שלב הדמיה מוגדר מראש'. התאם תחילה את המיקוד והחשיפה בערוץ DAPI.נקה את התיבה חשיפה אוטומטית בכל הערוצים ולאחר מכן לחץ על סמל המיקרוסקופ לצד ערוץ DAPI. חלון חדש ייפתח. בחר את הבאר כדי לכוון את המיקוד.אם אות כבר גלוי, תחילה, לחץ על מיקוד אוטומטי ולאחר מכן על חשיפה אוטומטית. אם לא, תחילה, הגדל את החשיפה וחזור על המיקוד האוטומטי ועל החשיפה האוטומטית. ניתן לכוונן את החשיפה באופן ידני על-ידי בחירה בתפריט הנפתח חשיפה.בדוק את ההגדרות במספר בארות ולאחר מכן שמור את ההגדרות. התאם את החשיפה באותו אופן לכל הערוצים. עבור ערוץ RFP, הקפד להתחיל עם באר עם הסתיידות בינונית עד גבוהה.סגור את חלון ההליך ובחר בלחצן הירוק קרא עכשיו בשורת המשימות העליונה. שמור את הניסוי כפי שצוין על ידי התוכנה. חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן.בזמן שהמערכת קוראת את הצלחת, כל התמונות מעובדות באופן אוטומטי ברקע. התאם את ההגדרות עבור ספירת תאים על-ידי בחירת תמונות TsF DAPI להצגה. בחר את הבאר המועדפת על-ידי לחיצה כפולה.חלון חדש יופיע. בחרו אחת מהתמונות. בחר בכרטיסיה ניתוח בחלון המוקפץ.בחר ספירת תאים של ניתוח סלולרי ולחץ על אישור. בטלו את הבחירה בערוצים RFP ו-Bright Field. סמן את התיבה סמן אובייקטים. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט.התאם את סף הגודל והעוצמה כך שיכלול את כל הגרעינים, אך אל תכלול לכלוך, ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על החל שינויים בפינה הימנית התחתונה כדי להחיל את ההגדרות על כל התמונות. באופן דומה, בחר תמונה סופית היטב עם כמות בינונית עד גבוהה של הסתיידות. כדי לכוונן בצורה הטובה ביותר את יחס האות לרעש, לחץ על הכרטיסיה ניתוח בתפריט משימה.בחר סטטיסטיקת תמונות. בטלו את הבחירה בערוץ DAPI ובערוץ שדה בהיר. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט.סמן את התיבה חריגות סף. כדי להגדיר את ערך הסף הלא סובייקטיבי עבור האות מעל הרקע, בחר בכלי קו משורת המשימות. חלון יופיע.צייר קו דרך טלאי של אות תוך הכללת אזור ברקע. התאם את ערכי הסף העליונים והתחתונים. ספרו רק את האות מעל הרקע ואל תכלול אם יש פסולת או חפצים.לחץ על אישור והחל שינויים כדי להעביר את ההגדרות לכל הבארות האחרות. ודא כי הסף נבחר במדויק בבארות האחרות. לאחר הגדרת ספירת התאים וסף ה- RFP, יצא את הנתונים.לחץ על לחצן Excel לצד התפריט הנפתח כדי לייצא את הנתונים ישירות לגיליון אלקטרוני. שלבי הסתיידות שונים, הנעים בין נמוך לגבוה, אותרו ונותחו. ההסתיידות זוהתה ככתמים שחורים באמצעות מיקרוסקופיית אור, שהיו שימושיים להערכה ראשונית ולקביעת מתי להתחיל בהדמיה.לקבלת יחס אות לרעש משופר, תמונות ה-RFP המעובדות נותחו כדי לכמת את ההסתיידות. הנתונים התקבלו על ידי השוואת שני תנאים או יותר באותה נקודת זמן. הנתונים נורמלו לספירת תאים כאזור הסתיידות לכל תא.הנתונים תוארו גם כסדרת זמן המציגה את אותו מצב בנקודות זמן שונות. חשוב שהתוצאות לאחר צמצום וניתוח הנתונים עדיין ישקפו את מה שניתן לראות לפני שינוי התמונה וסף.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...