Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
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Questa ricerca è stata finanziata dai programmi di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie n. 722609 e 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Questa ricerca è stata supportata da BioSPX. WJ-D ha ricevuto finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) TRR219-ID 322900939 e ID progetto 403041552

1. Induzione di semina, mantenimento e calcificazione cellulare
<ol><li>Per la coltura delle cellule primarie, utilizzare un armadio per il flusso d'aria laminare, guanti e attrezzature sterili. Disinfettare le mani e lo spazio di lavoro prima e dopo aver eseguito qualsiasi lavoro. Trattare tutte le cellule primarie e i terreni di coltura come un potenziale rischio biologico, salvo prova contraria. Preferibilmente celle e terreni in eccedenza in autoclave prima dello smaltimento. Non inattivare chimica...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

In questo manoscritto, descriviamo un metodo semi-automatico per la determinazione della calcificazione in vitro . Per questo metodo, è necessario ottimizzare tre fasi critiche della calcificazione di hVSMC. In primo luogo, la densità cellulare è fondamentale per lo sviluppo della calcificazione di hVSMC. Basse densità di hVSMC si tradurranno in una calcificazione lenta o assente e nella morte cellulare a causa della mancanza di contatto cellula-cellula e dello stress indotto in condizioni calcificanti<sup c...

La calcificazione vascolare (VC) è un fattore di rischio indipendente per la morbilità e mortalità cardiovascolare 1,2,3. A lungo considerato un processo chimico passivo di deposizione di minerali ectopici, ora appare una risposta di guarigione tissutale modificabile che coinvolge il contributo attivo di varie cellule tra cui le cellule muscolari lisce vascolari attivate (hVSMC) come driver della malattia 4,5. In vivo La VC può essere misurata mediante TAC multislice come valutazione del carico aterosclerotico 6,7,8. Attualmente, è in corso un cambiamento di paradigma, in cui la gravità VC viene riconosciuta come un fattore di rischio nelle malattie cardiovascolari, nel diabete di tipo II, nella malattia renale cronica e nell'invecchiamento 9,10,11,12,13,14,15.
Le hVSMC sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema cardiovascolare e un attore principale nello sviluppo della VC. La calcificazione indotta da hVSMC in vitro è un modello di malattia ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari16,17. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli per il rilevamento della calcificazione in vitro utilizza misurazioni end-point che possono limitare l'acquisizione dei dati, richiedere un maggiore uso di materiale cellulare e possono rallentare la ricerca. I metodi comuni per il rilevamento della calcificazione in vitro di hVSMC includono il saggio o-cresolphthalein, che misura la deposizione di calcio solubilizzato rispetto alle proteine totali e richiede la lisi cellulare18. Inoltre, viene utilizzata la colorazione Alizarin Red, che si lega direttamente ai depositi di calcio su cellule fisse o tessuto19. Per studiare la calcificazione di hVSMC nel tempo con o-cresolphthalein o Alizarin Red richiede lotti di repliche per punto temporale, aumentando la domanda di materiale biologico e, a sua volta, aumentando la possibilità di variabilità.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio il metodo per l'applicazione di un nuovo test che utilizza hVSMC con una sonda di imaging fluorescente per determinare la progressione VC in vitro e funzionare come un singolo test di calcificazione allo stadio terminale. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test è direttamente paragonabile ai metodi o-cresolphthalein e Alizarin Red e può essere utilizzato per distinguere tra diverse condizioni di coltura20. Oltre alle misurazioni in tempo reale, questo test può essere utilizzato per determinare la propensione dei campioni di siero o plasma come marcatore surrogato per lo sviluppo clinico di VC20. Ciò aiuterà nell'applicazione di strategie biologiche delle scienze cardiovascolari e nella modellizzazione delle malattie. Un'ulteriore applicazione del test può essere come sistema bioibrido traslazionale per valutare la gravità o la progressione della VC da costituenti del sangue come siero o plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

La calcificazione vascolare comporta una serie di patologie degenerative, tra cui l'infiammazione, i cambiamenti del fenotipo cellulare, la morte cellulare e l'assenza di inibitori della calcificazione, che portano contemporaneamente a una perdita di elasticità e funzionalità dei vasi. La calcificazione vascolare è un importante contributo alla morbilità e alla mortalità in molte patologie, tra cui la malattia renale cronica, il diabete mellito e l'aterosclerosi. Gli attuali modelli di ricerca per studiare la calcificazione vascolare sono limitati e sono praticabili solo nelle ultime fasi dello sviluppo della calcificazione in vivo. Gli strumenti in vitro per lo studio della calcificazione vascolare utilizzano misurazioni end-point, aumentando le richieste di materiale biologico e rischiando l'introduzione di variabilità negli studi di ricerca. Dimostriamo l'applicazione di una nuova sonda marcata con fluorescenza che si lega allo sviluppo della calcificazione in vitro sulle cellule muscolari lisce vascolari umane e determina lo sviluppo in tempo reale della calcificazione in vitro . In questo protocollo, descriviamo l'applicazione del nostro test di calcificazione di nuova concezione, un nuovo strumento nella modellazione delle malattie che ha potenziali applicazioni traslazionali. Prevediamo che questo test sia rilevante in uno spettro più ampio di ricerca sulla deposizione minerale, comprese le applicazioni nelle ossa, nella cartilagine o nella ricerca dentale.

Il risultato include immagini originali di nuclei colorati con HOECHST, calcificazione marcata RFP e immagini in campo chiaro. Possono essere rilevate e analizzate diverse fasi della calcificazione che vanno da basse (Figura 2) ad alte (Figura 3). La calcificazione di solito può essere individuata come macchie nere usando la microscopia ottica (Figura 2D e Figura 3B, le frecce indicano la calcificazion...

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A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.

Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Il nostro metodo consente di misurare la propensione alla calcificazione dei campioni di pazienti utilizzando cellule muscolari lisce vascolari umane. Ciò contribuirà a spingere la ricerca sui disturbi della calcificazione vascolare, assistendo nello sviluppo di nuove terapie. Questa tecnica utilizza un rilevamento basato su fluorescenza, che aumenta la sensibilità e consente di misurare i campioni nel tempo, riducendo così la necessità di repliche e aumentando la robustezza.Per iniziare, colture di cellule muscolari lisce vascolari umane su palloni di coltura cellulare non rivestiti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dividere le celle al raggiungimento del 70-90% di confluenza. Per dividere, lavare gli HVSMC due volte con PBS.Aggiungere tripsina e incubare per 2-5 minuti a 37 gradi Celsius. Inibire la reazione della tripsina aggiungendo un siero contenente mezzo. Centrifugare le celle per 4 minuti a 350 RCF e risospendere il pellet in un mezzo di mantenimento.Dopo aver preparato le cellule per una divisione come dimostrato, contare e seminare le cellule in una piastra a 48 pozzetti per iniziare l'esperimento di calcificazione. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, lavare delicatamente le cellule due volte con PBS, aspirando accuratamente tutto il PBS rimanente dopo il secondo lavaggio. Aggiungere delicatamente il mezzo di calcificazione e incubare ulteriormente a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Controllare quotidianamente con un microscopio ottico fino a quando non si verifica la calcificazione. Per rilevare la calcificazione tramite imaging, aprire il software e selezionare Protocolli e Crea nuovo. Selezionare Procedura e fare clic su Imposta temperatura.Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e la sfumatura su 1 grado Celsius nella finestra pop-up e fare clic su OK. Selezionare il tipo di piatto scelto dal menu a discesa. Aggiungere il passaggio dell'immagine facendo clic su Immagine. Selezionare l'Inverted Imager e fare clic su OK. Aggiungere tre canali di imaging e impostarli su DAPI, RFP e Bright Field.Spuntare la casella Montaggio e impostare il numero desiderato e la posizione delle immagini. Modificate la sovrapposizione per rappresentare una migliore copertura di ciascun pozzo. Selezionare i pozzi da fotografare.Si aprirà una nuova finestra dove è possibile selezionare i pozzi di interesse. Fare clic su Opzioni di messa a fuoco per impostare la modalità di messa a fuoco. Si aprirà una nuova finestra.Imposta ogni canale singolarmente. Comunemente, i pozzi sono auto-focalizzati sul canale DAPI. Impostate tutti gli altri canali su Altezza focale fissa dal primo canale e impostate facendo clic su OK. Chiudere la finestra.Avviare i passaggi di riduzione dei dati di preimpostazione facendo clic su Riduzione dati e selezionare Pre-elaborazione immagini. Accettare le impostazioni predefinite selezionando OK. Impostare un passaggio per contare le celle selezionando Analisi cellulare. Selezionare TsF DAPI Images dal menu a discesa del canale.Impostare ulteriori dettagli dopo l'esecuzione dell'imaging. Preparare l'analisi del segnale RFP selezionando Statistiche nel passaggio Etichetta della finestra pop-up e selezionare TsF RFP come canale di ingresso. Selezionare le caselle Valore superiore e Valore inferiore.Spuntare la casella per Area totale nell'elenco inferiore. Selezionate Nessuno nella colonna Effetto colore. Nella finestra pop-up, fai clic su Personalizzato e seleziona la casella Sfondo.Premere OK. Per una lettura corretta, normalizzare il segnale RFP per cella premendo Ratio sul lato sinistro. Nella finestra pop-up, selezionare Area totale quantificazione RFP. Per Input dati 1 dal menu a discesa e selezionare Conteggio celle come Input dati 2.Infine, selezionare un nuovo nome set di dati e premere OK due volte. Selezionare Effetto colore come illustrato in precedenza e fare clic OK.In'angolo superiore sinistro, selezionare File e salvare il file come tipo di file di protocollo. Registrare le osservazioni per ogni punto temporale dopo che si è verificata la prima istanza di calcificazione.Premere Leggi ora nel software di avvio e fare clic su Protocollo esistente. Selezionare il protocollo creato nel passaggio precedente. Il programma chiederà di salvare l'esperimento.Questo può essere fatto in questa fase o successivamente manualmente facendo clic sul pulsante Salva in alto a sinistra. Una finestra pop-up chiederà di attendere che il sistema si riscaldi. Accendere il controller del gas anidride carbonica e impostarlo su 5%Una volta che il sistema ha raggiunto la temperatura impostata, apparirà un prompt per inserire una piastra e leggere.Premere Annulla. Trasportare la piastra dall'incubatore all'imager in una cassetta di sicurezza per evitare rotture e fuoriuscite ed è in linea con le normative locali sulla biosicurezza per il trasporto di cellule vive in caso di incidente. Inserire la piastra nel lettore di piastre.Fare clic su Procedura. Nella finestra pop-up, selezionare Preset Imaging Step (Passaggio imaging predefinito). Regolare prima la messa a fuoco e l'esposizione sul canale DAPI.Deseleziona la casella Esposizione automatica su tutti i canali, quindi fai clic sull'icona del microscopio accanto al canale DAPI. Si aprirà una nuova finestra. Selezionare il riquadro per dirigere lo stato attivo.Se un segnale è già visibile, fare clic su Autofocus e quindi su Auto Exposure. In caso contrario, aumentare prima l'esposizione e ripetere Autofocus e Auto Exposure. L'esposizione può essere regolata manualmente selezionando il menu a discesa Esposizione.Controllare le impostazioni su più pozzi, quindi salvare le impostazioni. Regolare l'esposizione nello stesso modo per tutti i canali. Per il canale RFP, assicurati di iniziare con un pozzo con calcificazione medio-alta.Chiudere la finestra della procedura e selezionare il pulsante verde Leggi ora nella barra delle applicazioni superiore. Salvare l'esperimento come indicato dal software. Ripetere questo processo per ogni punto temporale.Mentre il sistema legge la lastra, tutte le immagini vengono elaborate automaticamente in background. Regolare le impostazioni per il conteggio delle celle selezionando le immagini DAPI TsF da visualizzare. Selezionare il pozzo di scelta facendo doppio clic.Apparirà una nuova finestra. Seleziona una delle immagini. Selezionare la scheda Analisi nella finestra pop-up.Selezionare Cellular Analysis Cell Count (Conteggio celle analisi cellulare) e fare clic su OK. Deselezionate i canali RFP e Bright Field. Selezionare la casella Evidenzia oggetti. Fare clic su Opzioni per aprire il menu.Regolare la soglia di dimensione e intensità per includere tutti i nuclei, ma escludere i detriti, quindi fare clic su OK. Fai clic su Applica modifiche in basso a sinistra per applicare le impostazioni a tutte le immagini. Allo stesso modo, seleziona un'immagine ben fine con una quantità medio-alta di calcificazione. Per regolare al meglio il rapporto segnale/rumore, fare clic sulla scheda Analisi nel menu Attività.Seleziona Statistiche immagine. Deselezionate il canale DAPI e Bright Field. Fare clic su Opzioni per aprire il menu.Spuntare la casella Soglia valori anomali. Per impostare il valore di soglia non soggettivo per il segnale sopra lo sfondo, selezionate lo strumento Linea dalla barra delle applicazioni. Apparirà una finestra.Disegna una linea attraverso una macchia di segnale includendo un'area dello sfondo. Regolare i valori superiori e inferiori delle soglie. Conta solo il segnale sopra lo sfondo ed escludi se ci sono detriti o artefatti.Fare clic su OK e applicare le modifiche per trasferire le impostazioni a tutti gli altri pozzi. Verificare che la soglia sia selezionata accuratamente negli altri pozzi. Una volta impostate le soglie di conteggio delle celle e RFP, esportare i dati.Fai clic sul pulsante Excel accanto al menu a discesa per esportare i dati direttamente in un foglio di calcolo. Sono state rilevate e analizzate diverse fasi di calcificazione che vanno dal basso all'alto. La calcificazione è stata individuata come macchie nere utilizzando la microscopia ottica, che sono state utili per la valutazione primaria e determinare quando iniziare l'imaging.Per un migliore rapporto segnale-rumore, le immagini RFP elaborate sono state analizzate per quantificare la calcificazione. I dati sono stati ottenuti confrontando due o più condizioni nello stesso punto temporale. I dati sono stati normalizzati al conteggio delle cellule come area di calcificazione per cellula.I dati sono stati anche rappresentati come una serie temporale che mostra la stessa condizione in vari punti temporali. È importante che i risultati dopo la riduzione e l'analisi dei dati riflettano ancora ciò che si può vedere prima della trasformazione e della soglia dell'immagine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...