Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
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이 연구는 마리 스클로도프스카-퀴리 보조금 계약 722609 및 764474, NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 BioSPX의 지원을 받았습니다. WJ-D는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)로부터 자금을 지원 받았다. TRR219-프로젝트 ID 322900939 및 프로젝트 ID 403041552

1. 세포 파종, 유지 및 석회화 유도
<ol><li>1차 세포를 배양하려면 층류 캐비닛, 장갑 및 멸균 장비를 사용하십시오. 작업을 수행하기 전후에 손과 작업 공간을 소독하십시오. 달리 입증되지 않는 한 모든 일차 세포와 배양 배지를 잠재적인 생물학적 위험으로 취급하십시오. 바람직하게는 폐기 전에 잉여 세포 및 배지를 오토클레이브한다. 유독 가스를 방출하므로 화학적으로 비활성화...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

이 원고에서는 체외 석회화 측정을위한 반자동 방법을 설명합니다. 이 방법의 경우 hVSMC 석회화의 세 가지 중요한 단계를 최적화해야 합니다. 첫째, 세포 밀도는 hVSMC 석회화 발달에 중요합니다. hVSMC의 낮은 밀도는 석회화 조건21 하에서 유도되는 세포 간 접촉 및 스트레스의 부족으로 인해 석회화 및 세포 사멸이 느리거나 전혀 없을 것이다. 높은 세포 밀도는 과도한 합류?...

혈관 석회화 (VC)는 심혈관 이환율 및 사망률 1,2,3에 대한 독립적 인 위험 요소입니다. 오랫동안 이소성 광물 침착의 수동적 화학적 과정으로 간주되었던 이 반응은 이제 질병 4,5의 동인으로서 활성화된 혈관 평활근 세포(hVSMC)를 포함한 다양한 세포의 능동적 기여를 포함하는 수정 가능한 조직 치유 반응으로 나타납니다. 생체 내 VC는 죽상 경화성 부담 6,7,8의 평가로서 다중 슬라이스 CT 스캔으로 측정 할 수 있습니다. 현재, VC 중증도가 심혈관 질환, 제 2 형 당뇨병, 만성 신장 질환 및 노화 9,10,11,12,13,14,15의 위험 인자로 인식되고있는 패러다임 전환이 진행 중이다.
hVSMC는 심혈 관계에서 가장 풍부한 세포 유형이며 VC 개발의 주요 행위자입니다. 시험관내 hVSMC-유도 석회화는 심혈관 질환16,17을 연구하기 위해 널리 사용되는 질환 모델이다. 그러나 체외 석회화 검출을 위한 대부분의 프로토콜은 데이터 수집을 제한하고 세포 물질의 더 많은 사용을 요구하며 연구를 늦출 수 있는 종말점 측정을 사용합니다. 시험관 내 hVSMC 석회화의 검출을 위한 일반적인 방법에는 o-크레솔프탈레인 분석법이 포함되며, 이는 총 단백질에 대한 가용화된 칼슘 침착을 측정하고 세포 용해를 필요로 합니다18. 또한, 고정된 세포 또는 조직 상의 칼슘 침착물에 직접 결합하는 알리자린 레드 염색이 사용된다(19). o-크레솔프탈레인 또는 알리자린 레드를 사용하여 시간 경과에 따른 hVSMC 석회화를 연구하려면 시점당 반복실험 배치가 필요하므로 생물학적 물질에 대한 수요가 증가하고 결과적으로 변동성이 증가합니다.
이 백서에서는 hVSMC를 형광 이미징 프로브와 함께 사용하여 시험관 내 VC 진행을 결정하고 단일 말기 석회화 분석으로 기능하는 새로운 분석의 적용 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 이전에 이 분석이 o-크레솔프탈레인 및 알리자린 레드 방법과 직접 비교할 수 있으며 다양한 배양 조건을 구별하는 데 사용할 수 있음을 입증했습니다20. 실시간 측정에 더하여, 이 분석은 임상 VC 발달(20)을 위한 대용 마커로서 혈청 또는 혈장 샘플의 성향을 결정하는데 사용될 수 있다. 이것은 심혈관 과학 및 질병 모델링의 생물학적 전략의 적용에 도움이 될 것입니다. 분석의 추가 적용은 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 구성으로부터 VC 중증도 또는 진행을 평가하기 위한 번역 BioHybrid 시스템으로서 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

혈관 석회화는 염증, 세포 표현형의 변화, 세포 사멸 및 석회화 억제제의 부재를 포함한 일련의 퇴행성 병리를 수반하여 혈관 탄력 및 기능의 상실로 이어집니다. 혈관 석회화는 만성 신장 질환, 당뇨병 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 많은 병리학에서 이환율과 사망률에 중요한 기여를합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 현재의 연구 모델은 제한적이며 생체 내 석회화 발달의 후기 단계에서만 실행 가능합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 시험관 내 도구는 종말점 측정을 사용하여 생물학적 물질에 대한 요구를 증가시키고 연구 연구에 가변성을 도입할 위험이 있습니다. 우리는 인간 혈관 평활근 세포에서 시험관 내 석회화 발달에 결합하고 시험관 내 석회화의 실시간 발달을 결정하는 새로운 형광 표지 프로브의 적용을 시연합니다. 이 프로토콜에서는 잠재적인 번역 응용 프로그램이 있는 질병 모델링의 새로운 도구인 새로 개발된 석회화 분석의 적용을 설명합니다. 우리는 이 분석이 뼈, 연골 또는 치과 연구의 응용을 포함하여 광범위한 광물 침착 연구와 관련이 있을 것으로 예상합니다.

결과에는 HOECHST 염색 핵의 원본 이미지, RFP 표지 석회화 및 명시야 이미지가 포함됩니다. 낮음(그림 2)에서 높음(그림 3)에 이르는 다양한 석회화 단계를 감지하고 분석할 수 있습니다. 석회화는 일반적으로 광학 현미경(그림 2D 및 그림 3B, 화살표는 석회화를 나타냄)을 사용하여 검은색 얼룩으로 발견할 수 있...

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A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 혈관 석회화는 심혈관 이환율 및 사망률의 부담에 실질적으로 기여합니다. 이 프로토콜은 형광 영상화에 의해 시험관내에서 혈관 평활근 세포 매개 칼슘 침전을 정량화하는 간단한 방법을 설명합니다.

시험관 내에서 칼슘 침착을 정량화하기 위한 반자동화되고 재현 가능한 생물학적 기반 방법

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

우리의 방법은 인간 혈관 평활근 세포를 사용하여 환자 샘플의 석회화 성향을 측정 할 수 있습니다. 이것은 혈관 석회화 장애에 대한 연구를 추진하여 새로운 치료법 개발을 지원하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 형광 기반 검출을 사용하여 감도를 높이고 시간이 지남에 따라 샘플을 측정할 수 있으므로 반복의 필요성을 줄이고 견고성을 높일 수 있습니다.시작하려면 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 인간 혈관 평활근 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 70 내지 90%컨플루언시에 도달하는 즉시 세포를 분할한다. 분할하려면 HVSMC를 PBS로 두 번 세척하십시오.트립신을 넣고 섭씨 37도에서 2-5 분 동안 배양하십시오. 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 억제한다. 세포를 350 RCF에서 4분 동안 원심분리하고 유지 배지에 펠릿을 재현탁시킨다.입증된 바와 같이 분할을 위해 세포를 준비한 후, 세포를 계수하고 48-웰 플레이트에 시드하여 석회화 실험을 시작하였다. 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 두 번 부드럽게 세척하고, 두 번째 세척 후 나머지 모든 PBS를 조심스럽게 흡인합니다. 석회화 배지를 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 더 배양하십시오.석회화가 발생할 때까지 광학 현미경으로 매일 확인하십시오. 이미징을 통해 석회화를 감지하려면 소프트웨어를 열고 프로토콜 및 새로 만들기를 선택합니다. 절차를 선택하고 온도 설정을 클릭합니다.팝업 창에서 온도를 섭씨 37도로 설정하고 그라데이션을 섭씨 1도로 설정하고 확인을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 원하는 플레이트 유형을 선택합니다. 이미지를 클릭하여 이미징 단계를 추가합니다. 반전된 이미저를 선택하고 확인을 클릭합니다. 세 개의 이미징 채널을 추가하고 DAPI, RFP 및 명시야로 설정합니다.체크 몽타주 상자를 선택하고 이미지의 원하는 수와 위치를 설정합니다. 각 웰의 더 나은 적용 범위를 나타내도록 겹침을 변경합니다. 이미징할 웰을 선택합니다.관심있는 우물을 선택할 수있는 새 창이 열립니다. 초점 옵션을 클릭하여 초점 모드를 설정합니다. 새 창이 열립니다.각 채널을 개별적으로 설정합니다. 일반적으로 웰은 DAPI 채널에 자동으로 초점을 맞춥니다. 다른 모든 채널을 첫 번째 채널에서 고정 초점 높이로 설정하고 확인을 클릭하여 설정합니다. 창을 닫습니다.데이터 축소를 클릭하여 데이터 축소 사전 설정 단계를 시작하고 이미지 전처리를 선택합니다. 확인을 선택하여 기본 설정을 적용합니다. 세포 분석을 선택하여 세포 수를 계산하는 단계를 설정합니다. 채널 드롭다운 메뉴에서 TsF DAPI 이미지를 선택합니다.이미징을 수행한 후 추가 세부 정보를 설정합니다. 팝업 창 레이블 단계에서 통계를 선택하고 입력 채널로 TsF RFP를 선택하여 RFP 신호 분석을 준비합니다. 체크 상위 값 및 하위 값 상자.하단 목록에서 전체 면적 상자를 선택합니다. 색상 효과 열에서 없음을 선택합니다. 팝업 창에서 사용자 지정을 클릭하고 배경 상자를 선택합니다.확인을 누릅니다. 공정한 판독을 위해 왼쪽의 Ratio를 눌러 셀당 RFP 신호를 정규화합니다. 팝업 창에서 RFP 정량화 총 면적을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 데이터 입력 1의 경우 셀 수를 데이터 입력 2로 선택합니다.마지막으로 새 데이터 세트 이름을 선택하고 확인을 두 번 누릅니다. 앞에서 설명한 대로 Color Effect를 선택하고 왼쪽 위 모서리 OK.In 클릭한 다음 파일을 선택하고 파일을 프로토콜 파일 형식으로 저장합니다. 석회화의 첫 번째 인스턴스가 발생한 후 모든 시점에 대한 관찰을 기록합니다.시작 소프트웨어에서 지금 읽기를 누르고 기존 프로토콜을 클릭합니다. 이전 단계에서 만든 프로토콜을 선택합니다. 프로그램에서 실험을 저장하라는 메시지를 표시합니다.이 단계에서 수행하거나 나중에 왼쪽 상단의 저장 버튼을 클릭하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 팝업 창에 시스템이 가열 될 때까지 기다리라는 메시지가 표시됩니다. 이산화탄소 가스 컨트롤러를 켜고 5%시스템이 설정 온도에 도달하면 플레이트를 삽입하고 읽으라는 메시지가 나타납니다.취소를 누릅니다. 파손 및 유출을 방지하기 위해 인큐베이터에서 이미 저로 플레이트를 안전한 상자에 담아 운반하며 사고 발생시 살아있는 세포를 운반하기위한 현지 생물 안전 규정을 준수합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다.절차를 클릭합니다. 팝업 창에서 사전 설정 이미징 단계를 선택합니다. 먼저 DAPI 채널의 초점과 노출을 조정합니다.모든 채널에서 자동 노출 상자를 선택 취소한 다음 DAPI 채널 옆에 있는 현미경 아이콘을 클릭합니다. 새 창이 열립니다. 초점을 지시할 우물을 선택합니다.신호가 이미 보이는 경우 먼저 자동 초점을 클릭한 다음 자동 노출을 클릭합니다. 그렇지 않은 경우 먼저 노출을 높이고 자동 초점 및 자동 노출을 반복합니다. 노출은 노출 드롭다운 메뉴를 선택하여 수동으로 조정할 수 있습니다.여러 웰의 설정을 확인한 다음 설정을 저장하십시오. 모든 채널에 대해 동일한 방식으로 노출을 조정합니다. RFP 채널의 경우 석회화가 중간에서 높은 웰로 시작해야 합니다.절차 창을 닫고 상단 작업 표시줄에서 녹색 Read Now 단추를 선택합니다. 소프트웨어에 표시된 대로 실험을 저장합니다. 각 시점에 대해 이 프로세스를 반복합니다.시스템이 플레이트를 읽는 동안 모든 이미지가 백그라운드에서 자동으로 처리됩니다. 표시할 TsF DAPI 이미지를 선택하여 셀 수 설정을 조정합니다. 두 번 클릭하여 원하는 웰을 선택합니다.새 창이 나타납니다. 이미지 중 하나를 선택합니다. 팝업 창에서 분석 탭을 선택합니다.세포 분석 세포 수를 선택하고 확인을 클릭합니다. RFP 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 개체 강조 상자를 선택합니다. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다.크기 및 강도 임계값을 조정하여 모든 핵을 포함하되 파편을 제외한 다음 확인을 클릭합니다. 왼쪽 하단의 변경 사항 적용을 클릭하여 모든 이미지에 설정을 적용합니다. 마찬가지로, 석회화가 중간에서 높은 양이 있는 웰엔드 이미지를 선택합니다. 신호 대 잡음비를 가장 잘 조정하려면 작업 메뉴에서 분석 탭을 클릭합니다.이미지 통계를 선택합니다. DAPI 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다.임계값 이상값 상자를 선택합니다. 신호에 대한 비주관적 임계값을 배경 위로 설정하려면 작업 표시줄에서 라인 도구를 선택합니다. 창이 나타납니다.배경 영역을 포함하면서 신호 패치를 통해 선을 그립니다. 임계값 상한 및 하한 값을 조정합니다. 배경 위의 신호만 계산하고 파편이나 아티팩트가 있는 경우 제외합니다.확인을 클릭하고 변경 사항을 적용하여 설정을 다른 모든 웰로 전송합니다. 임계값이 다른 웰에서 정확하게 선택되었는지 확인합니다. 셀 수 및 RFP 임계값이 설정되면 데이터를 내보냅니다.드롭다운 메뉴 옆에 있는 Excel 버튼을 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 직접 내보냅니다. 낮은 것부터 높은 것까지 다양한 석회화 단계가 감지되고 분석되었습니다. 석회화는 광학 현미경을 사용하여 검은색 반점으로 발견되었으며, 이는 1차 평가 및 이미징 시작 시기 결정에 유용했습니다.향상된 신호 대 잡음비를 위해 처리된 RFP 이미지를 분석하여 석회화를 정량화했습니다. 데이터는 동시에 두 개 이상의 조건을 비교하여 얻어졌다. 데이터는 세포 당 석회화 면적으로서 세포 카운트로 정규화되었다.데이터는 또한 다양한 시점에서 동일한 조건을 보여주는 시계열로 묘사되었습니다. 데이터 축소 및 분석 후 결과는 이미지 변환 및 임계 값 전에 볼 수있는 것을 반영하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

칼슘 이오노포어를 사용하여 적혈구에 있는 에리녹증의 유도

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...