Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie stipendavtale No 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskningen ble støttet av BioSPX. WJ-D mottok finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk forskningsstiftelse) TRR219-prosjekt ID 322900939 og prosjekt-ID 403041552

1. Cellesåing, vedlikehold og forkalkningsinduksjon
<ol><li>For dyrking av primære celler, bruk et laminært luftstrømskap, hansker og sterilt utstyr. Desinfiser hender og arbeidsområde før og etter å ha utført noe arbeid. Behandle alle primære celler og kulturmedier som en potensiell biohazard, med mindre det motsatte er bevist. Fortrinnsvis autoklavoverskuddsceller og medier før deponering. Ikke inaktiver og autoklav kjemisk, da dette vil frigjøre giftige røyk.</li>
	<li>Kultur hVSMC på u...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

I dette manuskriptet beskriver vi en halvautomatisert metode for bestemmelse av forkalkning in vitro . For denne metoden bør tre kritiske trinn for hVSMC-forkalkning optimaliseres. For det første er cellulær tetthet kritisk for hVSMC forkalkningsutvikling. Lav tetthet av hVSMCs vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grunn av mangel på celle-til-celle-kontakt og stresset som induseres under kalsifiseringsforhold21. Høye cellulære tettheter resulterer i overf...

Vaskulær forkalkning (VC) er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykelighet og dødelighet 1,2,3. Lenge betraktet som en passiv kjemisk prosess med ektopisk mineralavsetning, ser det nå ut til å være en modifiserbar vevshelingsrespons som involverer det aktive bidraget fra forskjellige celler, inkludert aktiverte vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en driver av sykdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-skanning som en vurdering av aterosklerotisk belastning 6,7,8. For tiden pågår et paradigmeskifte, hvor VC-alvorlighetsgrad blir anerkjent som en risikofaktor for kardiovaskulær sykdom, type II diabetes, kronisk nyresykdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs er den mest tallrike celletypen i kardiovaskulærsystemet og en hovedaktør i utviklingen av VC. In vitro hVSMC-indusert forkalkning er en mye brukt sykdomsmodell for å studere kardiovaskulær sykdom16,17. Imidlertid bruker de fleste protokoller for påvisning av in vitro-forkalkning endepunktsmålinger som kan begrense datainnsamling, krever større bruk av cellulært materiale og kan bremse forskningen. Vanlige metoder for påvisning av in vitro hVSMC forkalkning inkluderer o-cresolphthalein analysen, som måler oppløselig kalsiumavsetning mot totalt protein og krever cellelyse18. Også Alizarin Red-farging brukes, som binder seg direkte til kalkavleiringer på faste celler eller vev19. For å studere hVSMC forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red krever batcher av replikasjoner per tidspunkt, øker etterspørselen på biologisk materiale, og i sin tur øker sjansen for variabilitet.
I dette papiret beskriver vi metoden for anvendelse av en ny analyse som bruker hVSMCs med en fluorescerende bildebehandlingssonde for å bestemme in vitro VC-progresjon, samt fungere som en enestående forkalkningsanalyse i sluttstadiet. Vi har tidligere vist at denne analysen er direkte sammenlignbar med o-cresolphthalein og Alizarin Red-metodene og kan brukes til å skille mellom varierende kulturforhold20. I tillegg til sanntidsmålinger kan denne analysen brukes til å bestemme tilbøyeligheten til serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør for klinisk VC-utvikling20. Dette vil hjelpe til med anvendelsen av biologiske strategier for kardiovaskulær vitenskap og sykdomsmodellering. En ytterligere anvendelse av analysen kan være som et translasjonelt biohybridsystem for å vurdere VC-alvorlighetsgrad eller progresjon fra blodbestanddeler som serum eller plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Vaskulær forkalkning innebærer en rekke degenerative patologier, inkludert betennelse, endringer i cellulær fenotype, celledød og fravær av forkalkningshemmere, som samtidig fører til tap av fartøyets elastisitet og funksjon. Vaskulær forkalkning er en viktig bidragsyter til sykelighet og dødelighet i mange patologier, inkludert kronisk nyresykdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nåværende forskningsmodeller for å studere vaskulær forkalkning er begrenset og er bare levedyktige i de sene stadiene av forkalkningsutvikling in vivo. In vitro-verktøy for å studere vaskulær forkalkning bruker endepunktsmålinger, øker kravene til biologisk materiale og risikerer innføring av variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerer anvendelsen av en ny fluorescerende merket sonde som binder seg til in vitro forkalkningsutvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer sanntidsutviklingen av in vitro forkalkning. I denne protokollen beskriver vi anvendelsen av vår nyutviklede forkalkningsanalyse, et nytt verktøy i sykdomsmodellering som har potensielle translasjonsapplikasjoner. Vi ser for oss at denne analysen er relevant i et bredere spekter av mineralavsetningsforskning, inkludert applikasjoner innen bein-, brusk- eller tannforskning.

Resultatet inkluderer originale bilder av HOECHST-fargede kjerner, RFP-merket forkalkning og brightfield-bilder. Ulike stadier av forkalkning fra lav (figur 2) til høy (figur 3) kan oppdages og analyseres. Forkalkning kan vanligvis oppdages som svarte flekker ved hjelp av lysmikroskopi (figur 2D og figur 3B, pilene indikerer forkalkning), som er nyttige for primær vurdering og for å bestemme når man...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Hjerte- og karsykdommer er den ledende dødsårsaken over hele verden. Vaskulær forkalkning bidrar vesentlig til byrden av kardiovaskulær sykelighet og dødelighet. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å kvantifisere vaskulær glatt muskelcellemediert kalsiumutfelling in vitro ved fluorescerende avbildning.

En semi-automatisert og reproduserbar biologisk-basert metode for å kvantifisere kalsiumavsetning in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Vår metode gjør det mulig å måle forkalkningstilbøyelighet til pasientprøver ved bruk av humane vaskulære glatte muskelceller. Dette vil bidra til å drive forskning på vaskulære forkalkningsforstyrrelser, som bistår i utviklingen av nye terapier. Denne teknikken bruker en fluorescerende basert deteksjon, noe som øker følsomheten og gjør det mulig å måle prøver over tid, og dermed redusere behovet for repliker og øke robustheten.Til å begynne med dyrker humane vaskulære glatte muskelceller på ubelagte cellekulturflasker ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Del cellene når de når 70 til 90% sammenløp. For å dele, vask HVSMCs to ganger med PBS.Tilsett trypsin og inkuber i 2 til 5 minutter ved 37 grader Celsius. Hemmer trypsinreaksjonen ved å tilsette et serumholdig medium. Sentrifuge cellene i 4 minutter ved 350 RCF og resuspendere pelleten i et vedlikeholdsmedium.Etter å ha forberedt cellene for en splitt som demonstrert, teller og frø cellene i en 48-brønns plate for å starte forkalkningseksperimentet. Etter nattlig inkubasjon ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, vask forsiktig cellene to ganger med PBS, forsiktig aspirer alle gjenværende PBS etter den andre vasken. Tilsett forsiktig forkalkningsmedium og inkuber ytterligere ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Sjekk daglig med et lett mikroskop til forkalkning oppstår. For å oppdage forkalkning via bildebehandling, åpne programvaren og velg Protokoller og Opprett ny. Velg Prosedyre og klikk Still inn temperatur.Sett temperaturen til 37 grader Celsius og gradienten til 1 grad Celsius i popup-vinduet og klikk OK. Velg platetypen du ønsker fra rullegardinmenyen. Legg til bildetrinnet ved å klikke på Bilde. Velg Inverted Imager og klikk OK. Legg til tre bildekanaler og sett dem til DAPI, RFP og Bright Field.Merk av Montage-boksen og angi ønsket nummer og plassering av bildene. Endre overlappingen for å representere en bedre dekning av hver brønn. Velg hvilke brønner som skal avbildes.Et nytt vindu åpnes der brønnene av interesse kan velges. Klikk Fokusalternativer for å angi fokusmodus. Et nytt vindu åpnes.Angi hver kanal individuelt. Vanligvis er brønner automatisk fokusert på DAPI-kanalen. Sett alle andre kanaler til Fast brennvidde fra første kanal og angi ved å klikke OK. Lukk vinduet.Start trinnene for forhåndsinnstilling av datareduksjon ved å klikke Datareduksjon og velge Forhåndsbehandling av bilder. Godta standardinnstillingene ved å velge OK. Konfigurer et trinn for å telle cellene ved å velge Cellulær analyse. Velg TsF DAPI Images fra rullegardinmenyen for kanalen.Angi ytterligere detaljer etter at bildebehandlingen er utført. Forbered analysen av RFP-signalet ved å velge Statistikk i popup-vinduet Etiketttrinn og velg TsF RFP som inngangskanal. Merk av for Øvre verdi og Nedre verdi.Merk av i boksen for Totalt areal i den nedre listen. Velg Ingen i Fargeeffekt-kolonnen. I popup-vinduet klikker du på Egendefinert og merker av for Bakgrunn.Trykk på OK. For en rettferdig avlesning, normaliser RFP-signalet per celle ved å trykke Ratio på venstre side. I popup-vinduet velger du RFP-kvantifisering totalt areal. For Data Input 1 fra rullegardinmenyen og velg Cell Count as Data Input 2.Til slutt velger du et nytt datasettnavn og trykker OK to ganger. Velg Fargeeffekt som vist tidligere, og klikk OK.In øvre venstre hjørne, velg Fil og lagre filen som en protokollfiltype. Registrer observasjoner for hvert tidspunkt etter at den første forekomsten av forkalkning oppstår.Trykk Les nå i oppstartsprogramvaren og klikk på Eksisterende protokoll. Velg protokollen som ble opprettet i forrige trinn. Programmet vil be om å lagre eksperimentet.Dette kan gjøres på dette stadiet eller senere manuelt ved å klikke på Lagre-knappen øverst til venstre. Et popup-vindu vil be om å vente på at systemet skal varmes opp. Slå på karbondioksidgassregulatoren og sett den til 5% Når systemet har nådd den innstilte temperaturen, vises en melding om å sette inn en plate og lese.Trykk på Avbryt. Transport platen fra inkubatoren til bildebehandleren i en safe for å unngå brudd og søl og er i tråd med lokale biosikkerhetsforskrifter for transport av levende celler i tilfelle en ulykke. Plasser platen i plateleseren.Klikk på Prosedyre. I popup-vinduet velger du Forhåndsinnstilt bildetrinn. Juster fokus og eksponering på DAPI-kanalen først.Fjern merket for Auto Exposure-boksen på alle kanaler, og klikk deretter på mikroskopikonet ved siden av DAPI-kanalen. Et nytt vindu åpnes. Velg brønnen for å rette fokuset.Hvis et signal allerede er synlig, klikker du først på Autofokus og deretter Automatisk eksponering. Hvis ikke, må du først øke eksponeringen og gjenta autofokus og automatisk eksponering. Eksponeringen kan justeres manuelt ved å velge rullegardinmenyen Eksponering.Kontroller innstillingene på flere brønner, og lagre deretter innstillingene. Juster eksponeringen på samme måte for alle kanaler. For RFP-kanalen, sørg for å starte med en brønn med middels til høy forkalkning.Lukk prosedyrevinduet og velg den grønne Les nå-knappen på den øverste oppgavelinjen. Lagre eksperimentet som angitt av programvaren. Gjenta denne prosessen for hvert tidspunkt.Mens systemet leser platen, blir alle bildene automatisk behandlet i bakgrunnen. Juster innstillingene for celleantall ved å velge TsF DAPI-bilder som skal vises. Velg ønsket brønn ved å dobbeltklikke.Et nytt vindu dukker opp. Velg ett av bildene. Velg kategorien Analyse i popup-vinduet.Velg Cellantall for mobilanalyse, og klikk OK. Fjern merket for RFP- og Bright Field-kanalene. Merk av for Uthev objekter. Klikk Alternativer for å åpne menyen.Juster størrelses- og intensitetsterskelen for å inkludere alle kjerner, men ekskluder rusk, og klikk deretter OK. Klikk på Bruk endringer nederst til venstre for å bruke innstillingene på alle bilder. På samme måte velger du et godt bilde med en middels til høy mengde forkalkning. Hvis du vil justere signal-støy-forholdet best mulig, klikker du kategorien Analyse på Oppgave-menyen.Velg Bildestatistikk. Fjern merket for DAPI- og Bright Field-kanalen. Klikk Alternativer for å åpne menyen.Merk av i boksen Terskelavvik. Hvis du vil angi den ikke-subjektive terskelverdien for signalet over bakgrunnen, velger du linjeverktøyet fra oppgavelinjen. Et vindu vil dukke opp.Tegn en linje gjennom en signallapp mens du inkluderer et område av bakgrunnen. Juster tersklene øvre og nedre verdier. Tell bare signalet over bakgrunnen og ekskluder hvis det er rusk eller gjenstander.Klikk OK og bruk endringer for å overføre innstillingene til alle andre brønner. Bekreft at terskelen er nøyaktig valgt i de andre brønnene. Når tersklene for celletall og RFP er angitt, eksporterer du dataene.Klikk på Excel-knappen ved siden av rullegardinmenyen for å eksportere dataene direkte til et regneark. Ulike forkalkningsstadier fra lav til høy ble oppdaget og analysert. Forkalkning ble oppdaget som svarte flekker ved hjelp av lysmikroskopi, som var nyttige for primær vurdering og bestemmelse av når man skulle starte avbildning.For et forbedret signal-til-støy-forhold ble de behandlede RFP-bildene analysert for å kvantifisere forkalkning. Dataene ble oppnådd ved å sammenligne to eller flere forhold samtidig. Data ble normalisert til celletall som forkalkningsområde per celle.Dataene ble også avbildet som en tidsserie som viste samme tilstand på ulike tidspunkter. Det er viktig at resultatene etter datareduksjon og analyse fortsatt gjenspeiler det man kan se før bildetransformasjonen og terskelverdien.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induksjon av Eryptosis i røde blodlegemer ved hjelp av en kalsium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...