Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelos programas de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o contrato de subvenção Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta pesquisa foi apoiada pela BioSPX. O WJ-D recebeu financiamento do 322900939 de identificação do projeto TRR219 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) e do ID do projeto 403041552

1. Semeadura, manutenção e indução de calcificação celular
<ol><li>Para cultivar células primárias, use um gabinete de fluxo de ar laminar, luvas e equipamentos estéreis. Desinfete as mãos e o espaço de trabalho antes e depois de realizar qualquer trabalho. Trate todas as células primárias e meios de cultura como um potencial risco biológico, salvo prova em contrário. De preferência, células e meios excedentes de autoclave antes da eliminação. Não inative quimicamente e autoclave, p...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

Neste manuscrito, descrevemos um método semi-automatizado para determinação da calcificação in vitro . Para este método, três etapas críticas da calcificação do hVSMC devem ser otimizadas. Primeiro, a densidade celular é crítica para o desenvolvimento da calcificação do hVSMC. Baixas densidades de hVSMCs resultarão em calcificação lenta ou nenhuma e morte celular devido à falta de contato célula-a-célula e ao estresse induzido sob condições calcificantes21. Altas den...

A calcificação vascular (CV) é um fator de risco independente para morbidade e mortalidade cardiovascular 1,2,3. Há muito considerado um processo químico passivo de deposição mineral ectópica, agora aparece uma resposta de cicatrização tecidual modificável envolvendo a contribuição ativa de várias células, incluindo células musculares lisas vasculares ativadas (hVSMC) como um impulsionador da doença 4,5. In vivo A CV pode ser medida por tomografia computadorizada multislice como avaliação da carga aterosclerótica 6,7,8. Atualmente, uma mudança de paradigma está em andamento, em que a gravidade da CV está se tornando reconhecida como um fator de risco em doenças cardiovasculares, diabetes tipo II, doença renal crônica e envelhecimento 9,10,11,12,13,14,15.
Os hVSMCs são o tipo de célula mais abundante no sistema cardiovascular e um ator principal no desenvolvimento da CV. A calcificação induzida por hVSMC in vitro é um modelo de doença amplamente utilizado para estudar doenças cardiovasculares16,17. No entanto, a maioria dos protocolos para a detecção de calcificação in vitro usa medições de ponto final que podem limitar a aquisição de dados, exigir maior uso de material celular e retardar a pesquisa. Métodos comuns para a detecção da calcificação do hVSMC in vitro incluem o ensaio de o-cresolftaleína, que mede a deposição de cálcio solubilizado em relação à proteína total e requer lise celular18. Além disso, utiliza-se a coloração Alizarin Red, que se liga diretamente aos depósitos de cálcio em células ou tecidos fixos19. Para estudar a calcificação do hVSMC ao longo do tempo com o-cresolftaleína ou Alizarin Red requer lotes de replicações por ponto de tempo, aumentando a demanda por material biológico e, por sua vez, aumentando a chance de variabilidade.
Neste artigo, detalhamos o método para a aplicação de um novo ensaio que utiliza hVSMCs com uma sonda de imagem fluorescente para determinar a progressão da CV in vitro, bem como a função como um ensaio singular de calcificação em estágio terminal. Demonstramos anteriormente que este ensaio é diretamente comparável aos métodos o-cresolftaleína e Alizarina Vermelha e pode ser usado para distinguir entre diferentes condições de cultura20. Além das medidas em tempo real, este ensaio pode ser utilizado para determinar a propensão de amostras de soro ou plasma como um marcador substituto para o desenvolvimento clínico da CV20. Isso ajudará na aplicação de estratégias biológicas das ciências cardiovasculares e modelagem de doenças. Uma aplicação adicional do ensaio pode ser como um sistema BioHybrid translacional para avaliar a gravidade ou a progressão da CV a partir de constituintes sanguíneos, como soro ou plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

A calcificação vascular envolve uma série de patologias degenerativas, incluindo inflamação, alterações no fenótipo celular, morte celular e ausência de inibidores da calcificação, que concomitantemente levam a uma perda de elasticidade e função dos vasos. A calcificação vascular é um importante contribuinte para a morbidade e mortalidade em muitas patologias, incluindo doença renal crônica, diabetes mellitus e aterosclerose. Os modelos de pesquisa atuais para estudar a calcificação vascular são limitados e só são viáveis nos estágios finais do desenvolvimento da calcificação in vivo. Ferramentas in vitro para o estudo da calcificação vascular utilizam medições de end-point, aumentando as demandas de material biológico e arriscando a introdução de variabilidade nos estudos de pesquisa. Demonstramos a aplicação de uma nova sonda marcada fluorescentemente que se liga ao desenvolvimento de calcificação in vitro em células musculares lisas vasculares humanas e determina o desenvolvimento em tempo real da calcificação in vitro . Neste protocolo, descrevemos a aplicação de nosso recém-desenvolvido ensaio de calcificação, uma nova ferramenta na modelagem de doenças que tem potenciais aplicações translacionais. Consideramos que este ensaio seja relevante em um espectro mais amplo de pesquisa de deposição mineral, incluindo aplicações em pesquisas ósseas, cartilaginosas ou odontológicas.

O resultado inclui imagens originais de núcleos corados com HOECHST, calcificação marcada com RFP e imagens de campo brilhante. Diferentes estágios de calcificação que variam de baixo (Figura 2) a alto (Figura 3) podem ser detectados e analisados. A calcificação geralmente pode ser detectada como manchas pretas usando microscopia de luz (Figura 2D e Figura 3B, setas indicam calcificação), que ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.

Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Nosso método permite medir a propensão à calcificação de amostras de pacientes usando células musculares lisas vasculares humanas. Isso ajudará a impulsionar a pesquisa sobre distúrbios de calcificação vascular, auxiliando no desenvolvimento de novas terapias. Esta técnica utiliza uma deteção baseada em fluorescentes, que aumenta a sensibilidade e permite medir amostras ao longo do tempo, reduzindo assim a necessidade de replicações e aumentando a robustez.Para começar, cultive células musculares lisas vasculares humanas em frascos de cultura de células não revestidas a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Divida as células ao atingir 70 a 90% de confluência. Para dividir, lave os HVSMCs duas vezes com PBS.Adicione tripsina e incube por 2 a 5 minutos a 37 graus Celsius. Inibir a reação de tripsina adicionando um meio contendo soro. Centrifugar as células durante 4 minutos a 350 RCF e ressuspender o pellet num meio de manutenção.Depois de preparar as células para uma divisão, conforme demonstrado, conte e semeie as células em uma placa de 48 poços para iniciar o experimento de calcificação. Após a incubação durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%, lave suavemente as células duas vezes com PBS, aspirando cuidadosamente todos os PBS restantes após a segunda lavagem. Adicione suavemente o meio de calcificação e incube ainda a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.Verifique diariamente com um microscópio de luz até que ocorra a calcificação. Para detectar a calcificação por meio de imagens, abra o software e selecione Protocolos e Criar Novo. Selecione Procedimento e clique em Definir temperatura.Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o gradiente para 1 grau Celsius na janela pop-up e clique em OK. Selecione o tipo de prato de escolha no menu suspenso. Adicione a etapa de criação de imagens clicando em Imagem. Selecione o Gerador de imagens invertido e clique em OK. Adicione três canais de imagem e defina-os como DAPI, RFP e Bright Field.Marque a caixa Montagem e defina o número e a localização desejados das imagens. Altere a Sobreposição para representar uma melhor cobertura de cada poço. Selecione quais poços devem ser fotografados.Uma nova janela será aberta onde os poços de interesse podem ser selecionados. Clique em Opções de Foco para definir o modo de foco. Uma nova janela será aberta.Defina cada canal individualmente. Comumente, os poços são focados automaticamente no canal DAPI. Defina todos os outros canais como Altura focal fixa a partir do primeiro canal e defina clicando em OK. Feche a janela.Inicie as etapas de redução de dados de predefinição clicando em Redução de Dados e selecione Pré-processamento de Imagem. Aceite as configurações padrão selecionando OK. Configure uma etapa para contar as células selecionando Análise Celular. Selecione TsF DAPI Images no menu suspenso do canal.Defina mais detalhes após a realização da imagem. Prepare a análise do sinal RFP selecionando Estatísticas na janela pop-up Label step e selecione TsF RFP como o canal de entrada. Marque as caixas Valor Superior e Valor Inferior.Marque a caixa Área Total na lista inferior. Selecione Nenhum na coluna Efeito de Cor. Na janela pop-up, clique em Personalizado e marque a caixa Plano de fundo.Pressione OK. Para uma leitura justa, normalize o sinal de RFP por célula pressionando Ratio no lado esquerdo. Na janela pop-up, selecione Área Total de Quantificação de RFP. Para Entrada de Dados 1, no menu suspenso e selecione Contagem de Células como Entrada de Dados 2.Por fim, selecione um Novo Nome do Conjunto de Dados e pressione OK duas vezes. Selecione Efeito de cor, conforme demonstrado anteriormente, e clique em OK.In canto superior esquerdo, selecione Arquivo e salve o arquivo como um tipo de arquivo Protocolo. Registre as observações para cada ponto de tempo após a primeira instância de calcificação ocorrer.Pressione Read Now no software de inicialização e clique em Protocolo Existente. Selecione o protocolo criado na etapa anterior. O programa solicitará para salvar o experimento.Isso pode ser feito nesta fase ou posteriormente manualmente, clicando no botão Salvar no canto superior esquerdo. Uma janela pop-up pedirá para aguardar o aquecimento do sistema. Ligue o controlador de gás dióxido de carbono e defina-o para 5%Uma vez que o sistema tenha atingido a temperatura definida, um prompt aparecerá para inserir uma placa e ler.Pressione Cancelar. Transporte a placa da incubadora para o gerador de imagens em um cofre para evitar quebra e derramamento e esteja de acordo com os regulamentos locais de biossegurança para o transporte de células vivas em caso de acidente. Coloque a placa no leitor de placas.Clique em Procedimento. Na janela pop-up, selecione Etapa de criação de imagens predefinida. Ajuste o foco e a exposição no canal DAPI primeiro.Desmarque a caixa Exposição automática em todos os canais e clique no ícone do microscópio ao lado do canal DAPI. Uma nova janela será aberta. Selecione o poço para direcionar o foco.Se um sinal já estiver visível, primeiro, clique em Foco Automático e, em seguida, em Exposição Automática. Caso contrário, primeiro, aumente a exposição e repita o foco automático e a exposição automática. A exposição pode ser ajustada manualmente selecionando o menu suspenso Exposição.Verifique as configurações em vários poços e, em seguida, salve as configurações. Ajuste a exposição da mesma maneira para todos os canais. Para o canal RFP, certifique-se de começar com um poço com calcificação média a alta.Feche a janela de procedimento e selecione o botão verde Ler Agora na barra de tarefas superior. Salve o experimento conforme indicado pelo software. Repita esse processo para cada ponto de tempo.Enquanto o sistema lê a placa, todas as imagens são processadas automaticamente em segundo plano. Ajuste as configurações para contagem de células selecionando imagens DAPI TsF a serem exibidas. Selecione o poço de escolha clicando duas vezes.Uma nova janela aparecerá. Selecione uma das imagens. Selecione a guia Análise na janela pop-up.Selecione Contagem de células de análise celular e clique em OK. Desmarque os canais RFP e Bright Field. Marque a caixa Realçar Objetos. Clique em Opções para abrir o menu.Ajuste o Limite de Tamanho e Intensidade para incluir todos os núcleos, mas exclua detritos e clique em OK. Clique em Aplicar alterações no canto inferior esquerdo para aplicar as configurações a todas as imagens. Da mesma forma, selecione uma imagem bem final com uma quantidade média a alta de calcificação. Para ajustar melhor a relação sinal-ruído, clique na guia Análise no menu Tarefa.Selecione Estatísticas da imagem. Desmarque o canal DAPI e Campo brilhante. Clique em Opções para abrir o menu.Marque a caixa Limites atípicos. Para definir o valor de limite não subjetivo para o sinal acima do plano de fundo, selecione a ferramenta Linha na barra de tarefas. Uma janela aparecerá.Desenhe uma linha através de um patch de sinal, incluindo uma área do fundo. Ajuste os limiares superiores e inferiores. Conte apenas o sinal acima do plano de fundo e exclua se houver detritos ou artefatos.Clique em OK e aplique as alterações para transferir as configurações para todos os outros poços. Confirme se o limite está selecionado com precisão nos outros poços. Depois que a contagem de células e os limites de RFP estiverem definidos, exporte os dados.Clique no botão Excel ao lado do menu suspenso para exportar os dados diretamente para uma planilha. Diferentes estágios de calcificação variando de baixo a alto foram detectados e analisados. A calcificação foi detectada como manchas pretas usando microscopia de luz, que foram úteis para avaliação primária e determinação de quando iniciar a imagem.Para uma melhor relação sinal-ruído, as imagens RFP processadas foram analisadas para quantificar a calcificação. Os dados foram obtidos comparando-se duas ou mais condições ao mesmo tempo. Os dados foram normalizados para contagem celular como área de calcificação por célula.Os dados também foram descritos como uma série temporal mostrando a mesma condição em vários pontos de tempo. É importante que os resultados após a redução e análise dos dados ainda reflitam o que se pode ver antes da transformação e do limiar da imagem.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...