Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Это исследование финансировалось исследовательскими и инновационными программами Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 722609 и 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Это исследование было поддержано BioSPX. WJ-D получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) TRR219 -проект ID 322900939 и проект ID 403041552

1. Посев, поддержание и индукция кальцификации клеток
<ol><li>Для культивирования первичных клеток используйте ламинарный шкаф воздушного потока, перчатки и стерильное оборудование. Дезинфицируйте руки и рабочее пространство до и после проведения любой работы. Рассматривайте ?...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

В этой рукописи мы описываем полуавтоматический метод определения кальцификации in vitro . Для этого метода необходимо оптимизировать три критических этапа кальцификации hVSMC. Во-первых, клеточная плотность имеет решающее значение для развития кальцификации hVSMC. Низкая плотность hVSMC ?...

Кальцификация сосудов (ВК) является самостоятельным фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности 1,2,3. Долгое время считавшийся пассивным химическим процессом внематочного минерального отложения, теперь он представляет собой модифицируемую реакцию заживления тканей, включающую активный вклад различных клеток, включая активированные клетки гладкой мускулатуры сосудов (hVSMC) в качестве драйвера заболевания 4,5. In vivo ВК может быть измерен с помощью многоспиральной компьютерной томографии как оценка атеросклеротическойнагрузки 6,7,8. В настоящее время происходит смена парадигмы, в которой тяжесть ВК становится признанным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, диабета II типа, хронического заболевания почек и старения 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC являются наиболее распространенным типом клеток в сердечно-сосудистой системе и основным участником в развитии VC. Кальцификация in vitro hVSMC является широко используемой моделью заболевания для изучения сердечно-сосудистых заболеваний16,17. Тем не менее, большинство протоколов для обнаружения кальцификации in vitro используют измерения конечных точек, которые могут ограничить сбор данных, требуют более широкого использования клеточного материала и могут замедлить исследования. Общие методы обнаружения кальцификации hVSMC in vitro включают анализ o-кресольфталеина, который измеряет солюбилизированное отложение кальция против общего белка и требует лизиса клеток18. Также используется окрашивание Alizarin Red, которое связывается непосредственно с отложениями кальция на фиксированных клетках или ткани19. Для изучения кальцификации hVSMC с течением времени с помощью o-кресольфталеина или Alizarin Red требуются партии реплик в каждый момент времени, увеличивая спрос на биологический материал и, в свою очередь, увеличивая вероятность изменчивости.
В этой статье мы подробно описываем метод применения нового анализа, который использует hVSMC с флуоресцентным зондом визуализации для определения прогрессирования VC in vitro , а также функционирует как сингулярный анализ кальцификации на конечной стадии. Ранее мы продемонстрировали, что этот анализ непосредственно сопоставим с методами o-cresolphthalein и Alizarin Red и может быть использован для различения различных условий культуры20. В дополнение к измерениям в режиме реального времени этот анализ может быть использован для определения склонности образцов сыворотки или плазмы в качестве суррогатного маркера для клинической разработки VC20. Это поможет в применении биологических стратегий сердечно-сосудистых наук и моделировании заболеваний. Дальнейшее применение анализа может осуществляться в виде трансляционной системы BioHybrid для оценки тяжести или прогрессирования VC из компонентов крови, таких как сыворотка или плазма.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Кальцификация сосудов включает в себя ряд дегенеративных патологий, включая воспаление, изменения клеточного фенотипа, гибель клеток и отсутствие ингибиторов кальцификации, которые одновременно приводят к потере эластичности и функции сосудов. Кальцификация сосудов является важным фактором заболеваемости и смертности при многих патологиях, включая хроническое заболевание почек, сахарный диабет и атеросклероз. Современные исследовательские модели для изучения кальцификации сосудов ограничены и жизнеспособны только на поздних стадиях развития кальцификации in vivo. Инструменты in vitro для изучения кальцификации сосудов используют измерения конечных точек, повышая требования к биологическому материалу и рискуя введением изменчивости в научные исследования. Мы демонстрируем применение нового флуоресцентно меченого зонда, который связывается с развитием кальцификации in vitro на клетках гладкой мускулатуры сосудов человека и определяет развитие кальцификации in vitro в реальном времени. В этом протоколе мы описываем применение нашего недавно разработанного анализа кальцификации, нового инструмента в моделировании заболеваний, который имеет потенциальное трансляционное применение. Мы предполагаем, что этот анализ будет актуален в более широком спектре исследований минерального осаждения, включая применение в исследованиях костей, хрящей или зубов.

Результат включает в себя оригинальные изображения ядер, окрашенных HOECHST, кальцификацию, помеченную RFP, и изображения яркого поля. Могут быть обнаружены и проанализированы различные стадии кальцификации от низкой (рисунок 2) до высокой (рисунок 3). Кальциф...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире. Кальцификация сосудов вносит существенный вклад в бремя сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Этот протокол описывает простой метод количественной оценки осаждения кальция in vitro с помощью флуоресцентной визуализации.

Полуавтоматизированный и воспроизводимый биологический метод количественной оценки осаждения кальция in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Наш метод позволяет измерить склонность к кальцификации образцов пациентов с использованием гладкомышечных клеток сосудов человека. Это поможет продвинуть исследования нарушений кальцификации сосудов, помогая в разработке новых методов лечения. Этот метод использует флуоресцентное обнаружение, которое повышает чувствительность и позволяет измерять образцы с течением времени, тем самым уменьшая потребность в репликациях и повышая надежность.Для начала культивируйте клетки гладкой мускулатуры сосудов человека на колбах без покрытия клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Расщепление клеток при достижении 70-90% конфлюентности. Чтобы разделить, дважды промыте HVSMC с помощью PBS.Добавьте трипсин и инкубируйте в течение 2-5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Ингибировать трипсиновую реакцию путем добавления сыворотки, содержащей среду. Центрифугируйте ячейки в течение 4 минут при 350 RCF и повторно суспендируйте гранулу в поддерживающей среде.После подготовки клеток к расщеплению, как показано, подсчитайте и посейте клетки в 48-луночную пластину, чтобы начать эксперимент по кальцификации. После ночной инкубации при температуре 37 градусов цельсия с 5% углекислым газом осторожно промыть клетки дважды PBS, тщательно аспирируя все оставшиеся PBS после второй промывки. Осторожно добавьте кальцификационную среду и далее инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.Проверяйте ежедневно со световым микроскопом, пока не произойдет кальцификация. Чтобы обнаружить кальцификацию с помощью визуализации, откройте программное обеспечение и выберите Протоколы и Создать новые. Выберите Процедура и нажмите Установить температуру.Установите температуру на 37 градусов Цельсия и градиент на 1 градус Цельсия во всплывающем окне и нажмите OK. Выберите тип пластины в раскрывающемся меню. Добавьте шаг создания образа, щелкнув Изображение. Выберите инвертированный тепловизор и нажмите кнопку «ОК». Добавьте три канала обработки изображений и задайте для них dapi, RFP и Bright Field.Установите флажок Монтаж и задайте нужное количество и расположение изображений. Измените перекрытие, чтобы представить лучшее покрытие каждой скважины. Выберите, какие скважины должны быть изображены.Откроется новое окно, в котором можно выбрать интересующие скважины. Нажмите кнопку Параметры фокусировки, чтобы задать режим фокусировки. Откроется новое окно.Установите каждый канал индивидуально. Как правило, скважины автоматически фокусируются на канале DAPI. Установите для всех остальных каналов значение Фиксированная фокусная высота от первого канала и установите его, нажав кнопку ОК. Закройте окно.Начните шаги по предварительному сокращению данных, щелкнув Сокращение данных и выбрав Предварительная обработка изображений. Примите параметры по умолчанию, нажав кнопку ОК. Настройте шаг для подсчета клеток, выбрав Клеточный анализ. Выберите TsF DAPI Images в раскрывающемся меню канала.Установите дополнительные сведения после выполнения визуализации. Подготовьте анализ сигнала RFP, выбрав Статистика во всплывающем окне Шаг Метка и выберите TsF RFP в качестве входного канала. Установите флажки Верхнее значение и Нижнее значение.Установите флажок Общая площадь в нижнем списке. Выберите «Нет» в столбце «Цветовой эффект». Во всплывающем окне нажмите кнопку Пользовательский и установите флажок Фон.Нажмите OK. Для справедливого считывания нормализуйте сигнал RFP на ячейку, нажав Ratio с левой стороны. Во всплывающем окне выберите Общая площадь количественной оценки RFP. Для параметра Ввод данных 1 в раскрывающемся меню выберите Количество ячеек в качестве входных данных 2.Наконец, выберите Новое имя набора данных и дважды нажмите OK. Выберите Цветовой эффект, как показано ранее, и щелкните OK.In левом верхнем углу, выберите Файл и сохраните файл как тип файла протокола. Записывайте наблюдения за каждой временной точкой после первого случая кальцификации.Нажмите «Читать сейчас» в программном обеспечении запуска и нажмите «Существующий протокол». Выберите протокол, созданный на предыдущем шаге. Программа предложит сохранить эксперимент.Это можно сделать на этом этапе или позже вручную, нажав кнопку Сохранить в левом верхнем углу. Всплывающее окно попросит подождать, пока система нагреется. Включите контроллер углекислого газа и установите его на 5%Как только система достигнет заданной температуры, появится подсказка для вставки пластины и чтения.Нажмите кнопку Отмена. Транспортировка пластины из инкубатора в тепловизор в сейфе, чтобы избежать поломки и разлива, и соответствует местным правилам биобезопасности для транспортировки живых клеток в случае аварии. Поместите пластину в устройство считывания пластин.Нажмите на Процедура. Во всплывающем окне выберите Предустановленный шаг создания образа. Сначала настройте фокус и экспозицию на канале DAPI.Снимите флажок Автоматическая экспозиция на всех каналах, затем щелкните значок микроскопа рядом с каналом DAPI. Откроется новое окно. Выберите колодец, чтобы направить фокус.Если сигнал уже виден, сначала нажмите кнопку Автофокусировка, а затем Автоэкспозиция. Если нет, сначала увеличьте экспозицию и повторите автофокус и автоэкспозицию. Экспозицию можно настроить вручную, выбрав раскрывающееся меню Экспозиция.Проверьте настройки на нескольких скважинах, затем сохраните настройки. Отрегулируйте экспозицию одинаково для всех каналов. Для канала RFP обязательно начните с колодца со средним и высоким кальцификацией.Закройте окно процедуры и нажмите зеленую кнопку «Прочитать сейчас» на верхней панели задач. Сохраните эксперимент, как указано программным обеспечением. Повторите этот процесс для каждой точки времени.Пока система считывает пластину, все изображения автоматически обрабатываются в фоновом режиме. Настройте параметры количества ячеек, выбрав изображения TsF DAPI для отображения. Выберите нужный колодец двойным щелчком мыши.Появится новое окно. Выберите одно из изображений. Выберите вкладку Анализ во всплывающем окне.Выберите Количество ячеек клеточного анализа и нажмите кнопку ОК. Отмените выбор каналов RFP и Bright Field. Установите флажок Выделить объекты. Нажмите кнопку Параметры, чтобы открыть меню.Отрегулируйте порог размера и интенсивности, чтобы включить все ядра, но исключить мусор, а затем нажмите кнопку «ОК». Нажмите Применить изменения в левом нижнем углу, чтобы применить настройки ко всем изображениям. Аналогичным образом выберите хорошо выполненное изображение со средним и высоким уровнем кальцификации. Чтобы наилучшим образом настроить отношение сигнал/шум, перейдите на вкладку Анализ в меню Задача.Выберите Статистика изображений. Снимите флажки DAPI и канала Bright Field. Нажмите кнопку Параметры, чтобы открыть меню.Установите флажок Пороговые выбросы. Чтобы задать несубъективное пороговое значение для сигнала над фоном, выберите инструмент «Линия» на панели задач. Появится окно.Проведите линию через участок сигнала, включив область фона. Отрегулируйте пороговые значения верхнего и нижнего значений. Только подсчитывайте сигнал над фоном и исключайте, есть ли обломки или артефакты.Нажмите кнопку ОК и примените изменения, чтобы перенести настройки на все остальные скважины. Убедитесь, что порог точно выбран в других скважинах. После установки пороговых значений количества ячеек и RFP экспортируйте данные.Нажмите кнопку Excel рядом с раскрывающимся меню, чтобы экспортировать данные непосредственно в электронную таблицу. Были обнаружены и проанализированы различные стадии кальцификации от низкой до высокой. Кальцификация была замечена в виде черных пятен с использованием световой микроскопии, которые были полезны для первичной оценки и определения того, когда начинать визуализацию.Для улучшения отношения сигнал/шум обработанные изображения RFP были проанализированы для количественной оценки кальцификации. Данные были получены путем сравнения двух или более условий в один и тот же момент времени. Данные были нормализованы до количества клеток как площадь кальцификации на ячейку.Данные также были изображены в виде временных рядов, показывающих одно и то же состояние в различные моменты времени. Важно, чтобы результаты после сокращения и анализа данных по-прежнему отражали то, что можно увидеть до преобразования изображения и порогового значения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...