Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
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Esta investigación fue financiada por los programas de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta investigación fue apoyada por BioSPX. WJ-D recibió fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) TRR219-ID de proyecto 322900939 e ID de proyecto 403041552

1. Siembra celular, mantenimiento e inducción de calcificación
<ol><li>Para cultivar células primarias, use un gabinete de flujo de aire laminar, guantes y equipo estéril. Desinfecte las manos y el espacio de trabajo antes y después de realizar cualquier trabajo. Trate todas las células primarias y medios de cultivo como un riesgo biológico potencial, a menos que se demuestre lo contrario. Preferiblemente células y medios excedentes de autoclave antes de su eliminación. No inactivar químicame...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

En este manuscrito, describimos un método semiautomatizado para la determinación de calcificación in vitro . Para este método, se deben optimizar tres pasos críticos de calcificación de hVSMC. En primer lugar, la densidad celular es crítica para el desarrollo de la calcificación de hVSMC. Las bajas densidades de hVSMCs resultarán en calcificación lenta o nula y muerte celular debido a la falta de contacto célula a célula y al estrés inducido en condiciones calcificantes21. La...

La calcificación vascular (VC) es un factor de riesgo independiente para la morbimortalidad cardiovascular 1,2,3. Considerado durante mucho tiempo un proceso químico pasivo de deposición mineral ectópica, ahora aparece una respuesta de curación tisular modificable que involucra la contribución activa de varias células, incluidas las células activadas del músculo liso vascular (hVSMC) como impulsor de la enfermedad 4,5. In vivo La VC puede ser medida por tomografía computarizada multicorte como una evaluación de la carga aterosclerótica 6,7,8. Actualmente, se está produciendo un cambio de paradigma, en el que la gravedad de la VC se está reconociendo como un factor de riesgo en la enfermedad cardiovascular, la diabetes tipo II, la enfermedad renal crónica y el envejecimiento 9,10,11,12,13,14,15.
Los hVSMC son el tipo de célula más abundante en el sistema cardiovascular y un actor principal en el desarrollo de VC. La calcificación inducida por hVSMC in vitro es un modelo de enfermedad ampliamente utilizado para estudiar la enfermedad cardiovascular16,17. Sin embargo, la mayoría de los protocolos para la detección de calcificación in vitro utilizan mediciones de punto final que pueden limitar la adquisición de datos, requieren un mayor uso de material celular y pueden retrasar la investigación. Los métodos comunes para la detección de calcificación in vitro de hVSMC incluyen el ensayo de o-cresolftaleína, que mide la deposición de calcio solubilizado contra la proteína total y requiere lisis celular18. Además, se utiliza la tinción Alizarin Red, que se une directamente a los depósitos de calcio en células o tejidos fijos19. Para estudiar la calcificación de hVSMC a lo largo del tiempo con o-cresolftaleína o rojo de alizarina se requieren lotes de réplicas por punto de tiempo, lo que aumenta la demanda de material biológico y, a su vez, aumenta la posibilidad de variabilidad.
En este documento, detallamos el método para la aplicación de un nuevo ensayo que utiliza hVSMC con una sonda de imagen fluorescente para determinar la progresión in vitro de VC, así como la función como un ensayo de calcificación de etapa terminal singular. Anteriormente demostramos que este ensayo es directamente comparable a los métodos de o-cresolftaleína y rojo de alizarina y puede usarse para distinguir entre condiciones de cultivo variables20. Además de las mediciones en tiempo real, este ensayo puede ser utilizado para determinar la propensión de las muestras de suero o plasma como marcador sustituto para el desarrollo clínico de VC20. Esto ayudará en la aplicación de estrategias biológicas de ciencias cardiovasculares y modelado de enfermedades. Una aplicación adicional del ensayo puede ser como un sistema BioHybrid traslacional para evaluar la gravedad o progresión de VC a partir de componentes sanguíneos como suero o plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

La calcificación vascular implica una serie de patologías degenerativas, que incluyen inflamación, cambios en el fenotipo celular, muerte celular y ausencia de inhibidores de la calcificación, que concomitantemente conducen a una pérdida de elasticidad y función de los vasos. La calcificación vascular es un importante contribuyente a la morbilidad y mortalidad en muchas patologías, incluida la enfermedad renal crónica, la diabetes mellitus y la aterosclerosis. Los modelos de investigación actuales para estudiar la calcificación vascular son limitados y solo son viables en las últimas etapas del desarrollo de la calcificación in vivo. Las herramientas in vitro para estudiar la calcificación vascular utilizan mediciones de punto final, lo que aumenta las demandas de material biológico y corre el riesgo de introducir variabilidad en los estudios de investigación. Demostramos la aplicación de una nueva sonda marcada con fluorescencia que se une al desarrollo de calcificación in vitro en células del músculo liso vascular humano y determina el desarrollo en tiempo real de la calcificación in vitro . En este protocolo, describimos la aplicación de nuestro ensayo de calcificación recientemente desarrollado, una herramienta novedosa en el modelado de enfermedades que tiene posibles aplicaciones traslacionales. Prevemos que este ensayo es relevante en un espectro más amplio de investigación de deposición mineral, incluidas las aplicaciones en la investigación ósea, cartílago o dental.

El resultado incluye imágenes originales de núcleos teñidos con HOECHST, calcificación marcada con RFP e imágenes de campo claro. Se pueden detectar y analizar diferentes etapas de calcificación que van desde baja (Figura 2) a alta (Figura 3). La calcificación generalmente se puede detectar como manchas negras utilizando microscopía óptica (Figura 2D y Figura 3B, las flechas indican calcificaci...

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A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.

Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Nuestro método permite medir la propensión a la calcificación de muestras de pacientes utilizando células del músculo liso vascular humano. Esto ayudará a impulsar la investigación sobre los trastornos de calcificación vascular, ayudando en el desarrollo de nuevas terapias. Esta técnica utiliza una detección basada en fluorescentes, que aumenta la sensibilidad y permite medir muestras a lo largo del tiempo, reduciendo así la necesidad de réplicas y aumentando la robustez.Para comenzar, cultive células de músculo liso vascular humano en matraces de cultivo celular no recubiertos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Dividir las células al alcanzar 70 a 90% de confluencia. Para dividir, lave los HVSMC dos veces con PBS.Agregue tripsina e incube durante 2 a 5 minutos a 37 grados centígrados. Inhibir la reacción de tripsina añadiendo un medio que contenga suero. Centrifugar las células durante 4 minutos a 350 RCF y resuspender el pellet en un medio de mantenimiento.Después de preparar las células para una división como se demuestra, cuente y siembre las células en una placa de 48 pocillos para comenzar el experimento de calcificación. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, lave suavemente las células dos veces con PBS, aspirando cuidadosamente todo el PBS restante después del segundo lavado. Agregue suavemente el medio de calcificación y luego incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.Verifique diariamente con un microscopio óptico hasta que se produzca la calcificación. Para detectar la calcificación mediante imágenes, abra el software y seleccione Protocolos y Crear nuevo. Seleccione Procedimiento y haga clic en Establecer temperatura.Establezca la temperatura en 37 grados centígrados y el gradiente en 1 grado centígrado en la ventana emergente y haga clic en Aceptar. Seleccione el tipo de placa de su elección en el menú desplegable. Agregue el paso de imagen haciendo clic en Imagen. Seleccione el generador de imágenes invertido y haga clic en Aceptar. Agregue tres canales de imágenes y configúrelos en DAPI, RFP y Bright Field.Marque la casilla Montaje y establezca el número y la ubicación deseados de las imágenes. Cambie la superposición para representar una mejor cobertura de cada pozo. Seleccione qué pozos se van a fotografiar.Se abrirá una nueva ventana donde se pueden seleccionar los pozos de interés. Haga clic en Opciones de enfoque para establecer el modo de enfoque. Se abrirá una nueva ventana.Establezca cada canal individualmente. Comúnmente, los pozos se enfocan automáticamente en el canal DAPI. Establezca todos los demás canales en Altura focal fija desde el primer canal y configúrelos haciendo clic en Aceptar. Cierre la ventana.Inicie los pasos de reducción de datos preestablecidos haciendo clic en Reducción de datos y seleccione Preprocesamiento de imágenes. Acepte la configuración predeterminada seleccionando Aceptar. Configure un paso para contar las celdas seleccionando Análisis celular. Seleccione TsF DAPI Images (Imágenes DAPI de TsF) en el menú desplegable del canal.Establezca más detalles después de que se hayan realizado las imágenes. Prepare el análisis de la señal RFP seleccionando Estadísticas en el paso Etiqueta de la ventana emergente y seleccione RFP de TsF como canal de entrada. Marque las casillas Valor superior y Valor inferior.Marque la casilla Área total en la lista inferior. Seleccione Ninguno en la columna Efecto de color. En la ventana emergente, haga clic en Personalizado y marque la casilla Fondo.Pulse OK. Para una lectura justa, normalice la señal RFP por celda presionando Ratio en el lado izquierdo. En la ventana emergente, seleccione RFP Quantification Total Area (Área total de cuantificación de RFP). Para Data Input 1 (Entrada de datos 1) en el menú desplegable (Recuento de celdas como entrada de datos 2).Finalmente, seleccione un Nuevo nombre de conjunto de datos y presione OK dos veces. Seleccione Efecto de color como se demostró anteriormente y haga clic OK.In la esquina superior izquierda, seleccione Archivo y guarde el archivo como un tipo de archivo de protocolo. Registre las observaciones para cada punto de tiempo después de que ocurra la primera instancia de calcificación.Presione Leer ahora en el software de inicio y haga clic en Protocolo existente. Seleccione el protocolo creado en el paso anterior. El programa le pedirá que guarde el experimento.Esto se puede hacer en esta etapa o más tarde manualmente haciendo clic en el botón Guardar en la parte superior izquierda. Una ventana emergente le pedirá que espere a que el sistema se caliente. Encienda el controlador de gas de dióxido de carbono y configúrelo al 5%Una vez que el sistema haya alcanzado la temperatura establecida, aparecerá un mensaje para insertar una placa y leer.Presione Cancelar. Transporte la placa desde la incubadora hasta el generador de imágenes en una caja fuerte para evitar roturas y derrames y está en línea con las normas locales de bioseguridad para el transporte de células vivas en caso de accidente. Coloque la placa en el lector de placas.Haga clic en Procedimiento. En la ventana emergente, seleccione Paso de imágenes preestablecidas. Ajuste primero el enfoque y la exposición en el canal DAPI.Desmarque la casilla Exposición automática en todos los canales y, a continuación, haga clic en el icono del microscopio situado junto al canal DAPI. Se abrirá una nueva ventana. Seleccione el pozo para dirigir el enfoque.Si una señal ya está visible, primero haga clic en Enfoque automático y, a continuación, en Exposición automática. Si no es así, primero, aumente la exposición y repita el enfoque automático y la exposición automática. La exposición se puede ajustar manualmente seleccionando el menú desplegable Exposición.Verifique la configuración en varios pozos y luego guarde la configuración. Ajuste la exposición de la misma manera para todos los canales. Para el canal RFP, asegúrese de comenzar con un pozo con calcificación media a alta.Cierre la ventana de procedimiento y seleccione el botón verde Leer ahora en la barra de tareas superior. Guarde el experimento como indica el software. Repita este proceso para cada punto de tiempo.Mientras el sistema lee la placa, todas las imágenes se procesan automáticamente en segundo plano. Ajuste la configuración del recuento de celdas seleccionando las imágenes DAPI de TsF para mostrar. Seleccione el pozo de su elección haciendo doble clic.Aparecerá una nueva ventana. Seleccione una de las imágenes. Seleccione la pestaña Análisis en la ventana emergente.Seleccione Recuento de células de análisis celular y haga clic en Aceptar. Anule la selección de los canales RFP y Bright Field. Marque la casilla Resaltar objetos. Haga clic en Opciones para abrir el menú.Ajuste el umbral de tamaño e intensidad para incluir todos los núcleos, pero excluya los residuos y, a continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en Aplicar cambios en la parte inferior izquierda para aplicar la configuración a todas las imágenes. Del mismo modo, seleccione una imagen de fondo con una cantidad media a alta de calcificación. Para ajustar mejor la relación señal-ruido, haga clic en la ficha Análisis del menú Tarea.Seleccione Estadísticas de imagen. Anule la selección del canal DAPI y Bright Field. Haga clic en Opciones para abrir el menú.Marque la casilla Valores atípicos de umbral. Para establecer el valor de umbral no subjetivo para la señal sobre el fondo, seleccione la herramienta Línea en la barra de tareas. Aparecerá una ventana.Dibuja una línea a través de un parche de señal mientras incluyes un área del fondo. Ajuste los umbrales superior e inferior valores. Solo cuente la señal sobre el fondo y excluya si hay escombros o artefactos.Haga clic en Aceptar y aplique los cambios para transferir la configuración a todos los demás pozos. Confirme que el umbral se selecciona con precisión en los otros pozos. Una vez establecidos los umbrales de recuento de celdas y RFP, exporte los datos.Haga clic en el botón Excel junto al menú desplegable para exportar los datos directamente a una hoja de cálculo. Se detectaron y analizaron diferentes etapas de calcificación que van de baja a alta. La calcificación se detectó como manchas negras utilizando microscopía óptica, que fueron útiles para la evaluación primaria y la determinación de cuándo comenzar la obtención de imágenes.Para mejorar la relación señal-ruido, se analizaron las imágenes RFP procesadas para cuantificar la calcificación. Los datos se obtuvieron comparando dos o más condiciones en el mismo punto de tiempo. Los datos se normalizaron al recuento de células como área de calcificación por célula.Los datos también se representaron como una serie de tiempo que muestra la misma condición en varios puntos de tiempo. Es importante que los resultados después de la reducción y el análisis de datos aún reflejen lo que se puede ver antes de la transformación de la imagen y el umbral.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Cómo cuantificar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...