Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Denna forskning finansierades av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Sklodowska-Curie-bidragsavtalet nr 722609 och 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denna forskning stöddes av BioSPX. WJ-D fick finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) TRR219-project ID 322900939 och project ID 403041552

1. Cellsådd, underhåll och förkalkningsinduktion
<ol><li>För odling av primära celler, använd ett laminärt luftflödesskåp, handskar och steril utrustning. Desinficera händer och arbetsyta före och efter utförandet av något arbete. Behandla alla primära celler och odlingsmedier som en potentiell biofara, om inte annat bevisas. Helst autoklav överskottsceller och media före bortskaffande. Inaktivera inte kemiskt och autoklav eftersom detta kommer att frigöra giftiga ångor.</li>
	<li>Odl...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

I detta manuskript beskriver vi en halvautomatisk metod för in vitro-förkalkningsbestämning. För denna metod bör tre kritiska steg i hVSMC-förkalkning optimeras. För det första är cellulär densitet avgörande för hVSMC-förkalkningsutveckling. Låga densiteter av hVSMC kommer att resultera i långsam eller ingen förkalkning och celldöd på grund av bristen på cell-till-cell-kontakt och den stress som induceras under förkalkningsförhållanden21. Höga celltätheter result...

Vaskulär förkalkning (VC) är en oberoende riskfaktor för kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet 1,2,3. Länge betraktad som en passiv kemisk process av ektopisk mineralavsättning, verkar det nu vara ett modifierbart vävnadsläkningssvar som involverar det aktiva bidraget från olika celler inklusive aktiverade vaskulära glattmuskelceller (hVSMC) som en drivkraft för sjukdomen 4,5. In vivo VC kan mätas med flerdelade CT-skanningar som en bedömning av aterosklerotisk börda 6,7,8. För närvarande pågår ett paradigmskifte, där VC-svårighetsgrad blir erkänd som en riskfaktor vid hjärt-kärlsjukdom, typ II-diabetes, kronisk njursjukdom och åldrande 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC är den vanligaste celltypen i hjärt-kärlsystemet och en huvudaktör i utvecklingen av VC. In vitro hVSMC-inducerad förkalkning är en allmänt använd sjukdomsmodell för att studera hjärt-kärlsjukdom16,17. De flesta protokoll för detektion av in vitro-förkalkning använder dock slutpunktsmätningar som kan begränsa datainsamling, kräver större användning av cellulärt material och kan sakta ner forskningen. Vanliga metoder för detektion av in vitro hVSMC-förkalkning inkluderar o-cresolphthalein-analysen, som mäter solubiliserad kalciumavsättning mot totalt protein och kräver celllys18. Dessutom används Alizarin Red färgning, som binder direkt till kalciumavlagringar på fasta celler eller vävnad19. För att studera hVSMC-förkalkning över tid med antingen o-kresolftalein eller Alizarin Red krävs satser av replikat per tidpunkt, vilket ökar efterfrågan på biologiskt material och i sin tur ökar risken för variabilitet.
I det här dokumentet beskriver vi metoden för tillämpning av en ny analys som använder hVSMC med en fluorescerande bildsond för att bestämma in vitro VC-progression samt fungera som en singulär förkalkningsanalys i slutstadiet. Vi har tidigare visat att denna analys är direkt jämförbar med metoderna o-cresolftalein och Alizarin Red och kan användas för att skilja mellan varierande odlingsförhållanden20. Förutom realtidsmätningar kan denna analys användas för att bestämma benägenheten hos serum- eller plasmaprover som en surrogatmarkör för klinisk VC-utveckling20. Detta kommer att hjälpa till vid tillämpningen av biologiska strategier för kardiovaskulär vetenskap och sjukdomsmodellering. En ytterligare tillämpning av analysen kan vara som ett translationellt BioHybrid-system för att bedöma VC-svårighetsgrad eller progression från blodbeståndsdelar såsom serum eller plasma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Vaskulär förkalkning involverar en serie degenerativa patologier, inklusive inflammation, förändringar i cellulär fenotyp, celldöd och frånvaron av förkalkningshämmare, som samtidigt leder till förlust av kärlelasticitet och funktion. Vaskulär förkalkning är en viktig bidragsgivare till sjuklighet och dödlighet i många patologier, inklusive kronisk njursjukdom, diabetes mellitus och åderförkalkning. Nuvarande forskningsmodeller för att studera vaskulär förkalkning är begränsade och är endast livskraftiga i de sena stadierna av förkalkningsutveckling in vivo. In vitro-verktyg för att studera vaskulär förkalkning använder slutpunktsmätningar, vilket ökar kraven på biologiskt material och riskerar att införa variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerar tillämpningen av en ny fluorescerande märkt sond som binder till in vitro-förkalkningsutveckling på humana vaskulära glattmuskelceller och bestämmer realtidsutvecklingen av in vitro-förkalkning. I detta protokoll beskriver vi tillämpningen av vår nyutvecklade förkalkningsanalys, ett nytt verktyg inom sjukdomsmodellering som har potentiella translationella tillämpningar. Vi föreställer oss att denna analys är relevant i ett bredare spektrum av mineraldepositionsforskning, inklusive tillämpningar inom ben-, brosk- eller tandforskning.

Resultatet inkluderar originalbilder av HOECHST-färgade kärnor, RFP-märkt förkalkning och ljusfältbilder. Olika stadier av förkalkning som sträcker sig från låg (figur 2) till hög (figur 3) kan detekteras och analyseras. Förkalkning kan vanligtvis upptäckas som svarta fläckar med hjälp av ljusmikroskopi (figur 2D och figur 3B, pilar indikerar förkalkning), som är användbara för primär...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen. Vaskulär förkalkning bidrar väsentligt till bördan av kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att kvantifiera vaskulär glattmuskelcellmedierad kalciumutfällning in vitro genom fluorescerande avbildning.

En halvautomatiserad och reproducerbar biologisk baserad metod för att kvantifiera kalciumdeposition in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Vår metod gör det möjligt att mäta förkalkningsbenägenhet hos patientprover med hjälp av humana vaskulära glattmuskelceller. Detta kommer att bidra till att driva forskning om vaskulära förkalkningsstörningar, vilket hjälper till att utveckla nya terapier. Denna teknik använder en fluorescerande baserad detektion, vilket ökar känsligheten och gör det möjligt att mäta prover över tid, vilket minskar behovet av replikat och ökar robustheten.Till att börja med odla humana vaskulära glattmuskelceller på obelagda cellodlingskolvar vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Dela cellerna när du når 70 till 90% sammanflöde. För att dela, tvätta HVSMC två gånger med PBS.Tillsätt trypsin och inkubera i 2 till 5 minuter vid 37 grader Celsius. Hämma trypsinreaktionen genom att tillsätta ett seruminnehållande medium. Centrifugera cellerna i 4 minuter vid 350 RCF och återsuspendera pelleten i ett underhållsmedium.Efter att ha förberett cellerna för en delning som visats, räkna och frö cellerna till en 48-brunnsplatta för att starta förkalkningsexperimentet. Efter inkubation över natten vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid, tvätta försiktigt cellerna två gånger med PBS och försiktigt aspirera alla återstående PBS efter den andra tvätten. Tillsätt försiktigt förkalkningsmedium och inkubera ytterligare vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Kontrollera dagligen med ett ljusmikroskop tills förkalkning sker. För att upptäcka förkalkning via avbildning, öppna programvaran och välj Protokoll och Skapa ny. Välj Procedur och klicka på Ställ in temperatur.Ställ in temperaturen på 37 grader Celsius och lutningen på 1 grad Celsius i popup-fönstret och klicka på OK. Välj den typ av platta som valts i rullgardinsmenyn. Lägg till bildsteget genom att klicka på Bild. Välj inverterad bild och klicka på OK. Lägg till tre bildkanaler och ställ in dem på DAPI, RFP och Bright Field.Markera rutan Montage och ställ in önskat nummer och plats för bilderna. Ändra överlappningen så att den representerar en bättre täckning av varje brunn. Välj vilka brunnar som ska avbildas.Ett nytt fönster öppnas där brunnarna av intresse kan väljas. Klicka på Fokusalternativ för att ställa in fokusläget. Ett nytt fönster öppnas.Ställ in varje kanal individuellt. Vanligtvis är brunnar automatiskt fokuserade på DAPI-kanalen. Ställ in alla andra kanaler på Fast brännvidd från första kanalen och ställ in genom att klicka på OK. Stäng fönstret.Starta stegen för förinställning av datareduktion genom att klicka på Datareduktion och välj Bildförbehandling. Acceptera standardinställningarna genom att välja OK. Ställ in ett steg för att räkna cellerna genom att välja Cellanalys. Välj TsF DAPI-bilder från rullgardinsmenyn för kanalen.Ställ in ytterligare detaljer efter att avbildningen har utförts. Förbered analysen av RFP-signalen genom att välja Statistik i popup-fönstret Etikettsteg och välj TsF RFP som ingångskanal. Markera rutorna Övre värde och Lägre värde.Markera rutan för Total yta i den nedre listan. Välj Ingen i kolumnen Färgeffekt. I popup-fönstret klickar du på Anpassad och markerar bakgrundsrutan.Tryck på OK. För en rättvis avläsning, normalisera RFP-signalen per cell genom att trycka på Ratio på vänster sida. I popup-fönstret väljer du RFP Quantification Total Area. För Datainmatning 1 från rullgardinsmenyn och välj Cellantal som datainmatning 2.Välj slutligen ett nytt datamängdsnamn och tryck på OK två gånger. Välj Färgeffekt som visats tidigare och klicka OK.In det övre vänstra hörnet, välj Arkiv och spara filen som en protokollfiltyp. Spela in observationer för varje tidpunkt efter den första förekomsten av förkalkning.Tryck på Läs nu i startprogramvaran och klicka på Befintligt protokoll. Välj det protokoll som skapades i föregående steg. Programmet uppmanas att spara experimentet.Detta kan göras i detta skede eller senare manuellt genom att klicka på Save knappen uppe till vänster. Ett popup-fönster kommer att be om att vänta på att systemet värms upp. Slå på koldioxidgasregulatorn och ställ in den på 5% När systemet har nått den inställda temperaturen visas en uppmaning att sätta in en platta och läsa.Tryck på Avbryt. Transport plattan från inkubatorn till avbildaren i ett kassaskåp för att undvika brott och spill och är i linje med lokala biosäkerhetsbestämmelser för transport av levande celler i händelse av en olycka. Placera plattan i plattläsaren.Klicka på Procedur. I popup-fönstret väljer du Förinställt bildsteg. Justera fokus och exponering på DAPI-kanalen först.Avmarkera rutan Automatisk exponering vid alla kanaler och klicka sedan på mikroskopikonen bredvid DAPI-kanalen. Ett nytt fönster öppnas. Välj brunnen för att rikta fokus.Om en signal redan är synlig klickar du först på Autofokus och sedan på Autoexponering. Om inte, öka först exponeringen och upprepa autofokus och automatisk exponering. Exponeringen kan justeras manuellt genom att välja rullgardinsmenyn Exponering.Kontrollera inställningarna på flera brunnar och spara sedan inställningarna. Justera exponeringen på samma sätt för alla kanaler. För RFP-kanalen, se till att börja med en brunn med medelhög till hög förkalkning.Stäng procedurfönstret och välj den gröna Läs nu-knappen i det övre aktivitetsfältet. Spara experimentet enligt programvaran. Upprepa denna process för varje tidpunkt.Medan systemet läser plattan bearbetas alla bilder automatiskt i bakgrunden. Justera inställningarna för cellantal genom att välja TsF DAPI-bilder som ska visas. Välj den valda brunnen genom att dubbelklicka.Ett nytt fönster dyker upp. Välj en av bilderna. Välj fliken Analys i popup-fönstret.Välj Antal cellceller för mobilanalys och klicka på OK. Avmarkera kanalerna RFP och Bright Field. Markera rutan Markera objekt. Klicka på Alternativ för att öppna menyn.Justera storleks- och intensitetströskeln så att den inkluderar alla kärnor, men uteslut skräp, och klicka sedan på OK. Klicka på Tillämpa ändringar längst ned till vänster för att tillämpa inställningarna på alla bilder. På samma sätt väljer du en välslutsbild med en medelhög till hög mängd förkalkning. Om du vill justera signal-brusförhållandet på bästa sätt klickar du på fliken Analys på menyn Uppgift.Välj Bildstatistik. Avmarkera kanalen DAPI och Bright Field. Klicka på Alternativ för att öppna menyn.Markera rutan Tröskelavvikelser. Om du vill ange det icke-subjektiva tröskelvärdet för signalen ovanför bakgrunden väljer du linjeverktyget i aktivitetsfältet. Ett fönster dyker upp.Rita en linje genom en signalfläck medan du inkluderar ett område i bakgrunden. Justera tröskelvärdenas övre och nedre värden. Räkna bara signalen ovanför bakgrunden och uteslut om det finns skräp eller artefakter.Klicka på OK och tillämpa ändringar för att överföra inställningarna till alla andra brunnar. Bekräfta att tröskeln är korrekt vald i de andra brunnarna. När cellantalet och RFP-tröskelvärdena har angetts exporterar du data.Klicka på Excel-knappen bredvid rullgardinsmenyn för att exportera data direkt till ett kalkylblad. Olika förkalkningssteg från låg till hög upptäcktes och analyserades. Förkalkning upptäcktes som svarta fläckar med hjälp av ljusmikroskopi, som var användbara för primär bedömning och för att bestämma när man skulle börja bilda.För ett förbättrat signal-brusförhållande analyserades de bearbetade RFP-bilderna för att kvantifiera förkalkning. Data erhölls genom att jämföra två eller flera villkor samtidigt. Data normaliserades till cellantal som förkalkningsområde per cell.Data avbildades också som en tidsserie som visar samma tillstånd vid olika tidpunkter. Det är viktigt att resultaten efter datareduktion och analys fortfarande återspeglar vad man kan se före bildtransformationen och tröskeln.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induktion av Eryptos i röda blodkroppar med hjälp av en Kalciumionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...