Name: a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

Bu araştırma, Avrupa Birliği'nin Marie Sklodowska-Curie hibe anlaşması No 722609 ve 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007) kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları tarafından finanse edilmiştir. Bu araştırma BioSPX tarafından desteklenmiştir. WJ-D, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) TRR219 proje kimliği 322900939 ve proje kimliği 403041552

1. Hücre tohumlama, bakım ve kalsifikasyon indüksiyonu
<ol><li>Birincil hücreleri kültürlemek için laminer hava akış dolabı, eldivenler ve steril ekipman kullanın. Herhangi bir işi yapmadan önce ve sonra ellerinizi ve çalışma alanını dezenfekte edin. Aksi kanıtlanmadıkça, tüm birincil hücrelere ve kültür ortamına potansiyel bir biyolojik tehlike olarak davranın. Tercihen imha edilmeden önce fazla hücreleri ve ortamları otoklav eder. Kimyasal olarak inaktive etmeyin ve otok...

<ol>
	<li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors:+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+(PACC)+project.">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li><li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcification,+coronary+disease+risk+factors,+C-reactive+protein,+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study.">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li><li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups.">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li><li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles.">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).</li><li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling:+focus+on+calcification-related+processes.">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).</li><li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography.">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li><li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events.">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).</li><li>Benedek, T., Gy&#246;ngy&#246;si, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes.">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease.">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li><li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD.">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li><li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification:+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness.">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li><li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus.">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li><li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease:+Integrative+roles+for+OPG,+RANKL+and+TRAIL.">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li><li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening:+relevance+in+development,+aging,+and+disease.">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li><li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging.">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li><li>Herrmann, J., Babic, M., T&#246;lle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+models+for+studying+vascular+calcification.">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).</li><li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification:+solidifying+a+system.">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li><li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens.">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+(glucose-regulated+protein,+78+kDa)-loaded+extracellular+vesicles.">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li><li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+BioHybrid+assay:+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity.">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097 (2021).</li><li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations:+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD.">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li><li>Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality,+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li><li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ucma/GRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling.">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).</li><li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification.">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li><li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro.">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li><li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro.">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li><li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum.">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li></ol>

Bu yazıda, in vitro kalsifikasyon tayini için yarı otomatik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem için, hVSMC kalsifikasyonunun üç kritik adımı optimize edilmelidir. İlk olarak, hücresel yoğunluk hVSMC kalsifikasyon gelişimi için kritik öneme sahiptir. Düşük hVSMC yoğunlukları, hücreden hücreye temasın olmaması ve kalsifikasyon koşulları altında indüklenen stres nedeniyle yavaş veya hiç kalsifikasyon ve hücre ölümü ile sonuçlanacaktır21. Yüksek hü...

Vasküler kalsifikasyon (VC) kardiyovasküler morbidite ve mortalite için bağımsız bir risk faktörüdür 1,2,3. Uzun zamandır ektopik mineral birikiminin pasif bir kimyasal süreci olarak kabul edilirken, şimdi hastalığın itici gücü olarak aktif vasküler düz kas hücreleri (hVSMC) dahil olmak üzere çeşitli hücrelerin aktif katkısını içeren değiştirilebilir bir doku iyileşme yanıtı ortaya çıkmaktadır 4,5. İn vivo VC, aterosklerotik yükündeğerlendirilmesi olarak çok kesitli BT taramaları ile ölçülebilir 6,7,8. Şu anda, VC şiddetinin kardiyovasküler hastalık, tip II diyabet, kronik böbrek hastalığı ve yaşlanma 9,10,11,12,13,14,15'te bir risk faktörü olarak kabul edildiği bir paradigma değişimi devam etmektedir.
hVSMC'ler kardiyovasküler sistemde en bol bulunan hücre tipidir ve VC gelişiminde başlıca aktördür. İn vitro hVSMC kaynaklı kalsifikasyon, kardiyovasküler hastalıkları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hastalık modelidir16,17. Bununla birlikte, in vitro kalsifikasyonun tespiti için çoğu protokol, veri toplamayı sınırlayabilen, hücresel materyalin daha fazla kullanılmasını gerektiren ve araştırmayı yavaşlatabilen son nokta ölçümlerini kullanır. İn vitro hVSMC kalsifikasyonunun tespiti için yaygın yöntemler, toplam proteine karşı çözünür kalsiyum birikimini ölçen ve hücre lizisi18 gerektiren o-cresolphthalein testini içerir. Ayrıca, sabit hücreler veya doku19 üzerindeki kalsiyum birikintilerine doğrudan bağlanan Alizarin Kırmızı boyama kullanılır. Zaman içinde hVSMC kalsifikasyonunu o-kresolftalin veya Alizarin Kırmızısı ile incelemek için, zaman noktası başına replika partileri gerekir, bu da biyolojik materyale olan talebi arttırır ve sırayla değişkenlik şansını arttırır.
Bu yazıda, in vitro VC progresyonunu belirlemek ve tekil bir son aşama kalsifikasyon testi olarak işlev görmek için floresan görüntüleme probu ile hVSMC'leri kullanan yeni bir tahlilin uygulama yöntemini detaylandırıyoruz. Daha önce bu tahlilin o-cresolphthalein ve Alizarin Red yöntemleriyle doğrudan karşılaştırılabilir olduğunu ve değişen kültür koşullarını ayırt etmek için kullanılabileceğini göstermiştik20. Gerçek zamanlı ölçümlere ek olarak, bu tahlil, klinik VC gelişimi için vekil bir belirteç olarak serum veya plazma örneklerinin eğilimini belirlemek için kullanılabilir20. Bu, kardiyovasküler bilimlerin biyolojik stratejilerinin ve hastalık modellemesinin uygulanmasına yardımcı olacaktır. Tahlilin başka bir uygulaması, VC şiddetini veya serum veya plazma gibi kan bileşenlerinden ilerlemeyi değerlendirmek için translasyonel bir BioHybrid sistemi olarak olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 93%, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear TC-treated well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 System</td>
			<td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7524-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td>
			<td>Prepared in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software v3.10</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Medium 199</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-automated and reproducible biological-based method to quantify calcium deposition in vitro

Vasküler kalsifikasyon, inflamasyon, hücresel fenotipteki değişiklikler, hücre ölümü ve kalsifikasyon inhibitörlerinin yokluğu da dahil olmak üzere bir dizi dejeneratif patolojiyi içerir ve bu da eşzamanlı olarak damar elastikiyeti ve fonksiyon kaybına yol açar. Vasküler kalsifikasyon, kronik böbrek hastalığı, diabetes mellitus ve ateroskleroz gibi birçok patolojide morbidite ve mortaliteye önemli bir katkıda bulunmaktadır. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için mevcut araştırma modelleri sınırlıdır ve sadece kalsifikasyon gelişiminin in vivo geç aşamalarında uygulanabilir. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için in vitro araçlar, son nokta ölçümlerini kullanır, biyolojik materyal üzerindeki talepleri arttırır ve araştırma çalışmalarına değişkenliğin getirilmesini riske atar. İnsan vasküler düz kas hücreleri üzerinde in vitro kalsifikasyon gelişimine bağlanan ve in vitro kalsifikasyonun gerçek zamanlı gelişimini belirleyen yeni bir floresan etiketli probun uygulanmasını gösteriyoruz. Bu protokolde, potansiyel translasyonel uygulamaları olan hastalık modellemesinde yeni bir araç olan yeni geliştirilen kalsifikasyon testimizin uygulanmasını açıklıyoruz. Bu tahlilin, kemik, kıkırdak veya diş araştırmalarındaki uygulamalar da dahil olmak üzere daha geniş bir mineral biriktirme araştırması yelpazesinde alakalı olmasını öngörüyoruz.

Sonuç, HOECHST boyalı çekirdeklerin orijinal görüntülerini, RFP etiketli kalsifikasyonu ve parlak alan görüntülerini içerir. Kalsifikasyonun düşükten (Şekil 2) yükseğe (Şekil 3) kadar değişen farklı aşamaları tespit edilebilir ve analiz edilebilir. Kalsifikasyon genellikle ışık mikroskobu kullanılarak siyah lekeler olarak tespit edilebilir (Şekil 2D ve Şekil 3B, oklar kalsifi...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro at JoVE.com

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler morbidite ve mortalite yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, floresan görüntüleme ile vasküler düz kas hücresi aracılı kalsiyum çökelmesini in vitro olarak ölçmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır.

In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Yöntemimiz, insan vasküler düz kas hücrelerini kullanarak hasta örneklerinin kireçlenme eğilimini ölçmeye izin verir. Bu, vasküler kalsifikasyon bozukluklarına yönelik araştırmaları ilerletmeye yardımcı olacak ve yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Bu teknik, hassasiyeti artıran ve numunelerin zaman içinde ölçülmesine izin veren, böylece çoğaltma ihtiyacını azaltan ve sağlamlığı artıran floresan tabanlı bir algılama kullanır.Başlamak için, kaplanmamış hücre kültürü üzerindeki insan vasküler düz kas hücrelerini% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede şişeler. % 70 ila% 90 akıcılığa ulaştıktan sonra hücreleri bölün. Bölmek için HVSMC'leri PBS ile iki kez yıkayın.Tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede 2 ila 5 dakika kuluçkaya yatırın. Serum içeren bir ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu inhibe edin. Hücreleri 350 RCF'de 4 dakika boyunca santrifüj edin ve peleti bir bakım ortamında yeniden askıya alın.Hücreleri gösterildiği gibi bir bölünmeye hazırladıktan sonra, kalsifikasyon deneyine başlamak için hücreleri sayın ve 48 delikli bir plakaya tohumlayın. % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede gece inkübasyonunu takiben, hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın, ikinci yıkamadan sonra kalan tüm PBS'yi dikkatlice aspire edin. Yavaşça kireçlenme ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede daha fazla inkübe edin.Kalsifikasyon meydana gelene kadar her gün bir ışık mikroskobu ile kontrol edin. Görüntüleme yoluyla kalsifikasyonu tespit etmek için yazılımı açın ve Protokoller ve Yeni Oluştur'u seçin. Prosedür'ü seçin ve Sıcaklığı Ayarla'ya tıklayın.Açılır pencerede sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve gradyanı 1 santigrat dereceye ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Açılır menüden tercih ettiğiniz plaka türünü seçin. Görüntü'yü tıklatarak görüntüleme adımını ekleyin. Ters Görüntüleyici'yi seçin ve Tamam'ı tıklatın. Üç görüntüleme kanalı ekleyin ve bunları DAPI, RFP ve Parlak Alan olarak ayarlayın.Montaj kutusunu işaretleyin ve görüntülerin istediğiniz sayısını ve konumunu ayarlayın. Her bir kuyucuğun daha iyi bir kapsamını temsil etmek için Örtüşme'yi değiştirin. Hangi kuyucukların görüntüleneceğini seçin.İlgilenilen kuyuların seçilebileceği yeni bir pencere açılacaktır. Netleme modunu ayarlamak için Netleme Seçenekleri'ni tıklatın. Yeni bir pencere açılacaktır.Her kanalı ayrı ayrı ayarlayın. Genellikle, kuyular DAPI kanalına otomatik olarak odaklanır. Diğer tüm kanalları İlk kanaldan sabit odak yüksekliği olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatarak ayarlayın. Pencereyi kapatın.Veri Azaltma'yı tıklayıp Görüntü Ön İşleme'yi seçerek önceden ayarlanmış veri azaltma adımlarını başlatın. Tamam'ı seçerek varsayılan ayarları kabul edin. Hücresel Analiz'i seçerek hücreleri saymak için bir adım ayarlayın. Kanal açılır menüsünden TsF DAPI Görüntüleri'ni seçin.Görüntüleme yapıldıktan sonra daha fazla ayrıntı ayarlayın. Açılır pencere Etiket adımında İstatistikler'i seçerek RFP sinyalinin analizini hazırlayın ve giriş kanalı olarak TsF RFP'yi seçin. Üst Değer ve Düşük Değer kutularını işaretleyin.Alt listedeki Toplam Alan kutusunu işaretleyin. Color Effect sütununda Hiçbiri'ni seçin. Açılır pencerede, Özel'i tıklayın ve Arka Plan kutusunu işaretleyin.Tamam'a basın. Adil bir okuma için, sol taraftaki Oran düğmesine basarak hücre başına RFP sinyalini normalleştirin. Açılır pencerede, RFP Niceliği Toplam Alanı'nı seçin. Açılır menüden Veri Girişi 1 için Veri Girişi Olarak Hücre Sayısı 2'yi seçin.Son olarak, Yeni Veri Kümesi Adı seçin ve Tamam'a iki kez basın. Daha önce gösterildiği gibi Renk Efekti'ni seçin ve sol üst köşedeki OK.In tıklayın, Dosya'yı seçin ve dosyayı Protokol dosya türü olarak kaydedin. Kalsifikasyonun ilk örneğinden sonra her zaman noktası için gözlemleri kaydedin.Başlangıç yazılımında Şimdi Oku'ya basın ve Mevcut Protokol'e tıklayın. Önceki adımda oluşturulan protokolü seçin. Program denemeyi kaydetmenizi ister.Bu, bu aşamada veya daha sonra sol üstteki Kaydet düğmesine tıklayarak manuel olarak yapılabilir. Bir açılır pencere, sistemin ısınmasını beklemenizi isteyecektir. Karbondioksit gazı kontrol cihazını açın ve% 5'e ayarlayınSistem ayarlanan sıcaklığa ulaştığında, bir plaka takmak ve okumak için bir istem görünecektir.İptal'e basın. Kırılmayı ve dökülmeyi önlemek için plakayı inkübatörden görüntüleyiciye güvenli bir kutuda taşıyın ve bir kaza durumunda canlı hücrelerin taşınması için yerel biyogüvenlik yönetmeliklerine uygundur. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.Prosedür'e tıklayın. Açılır pencerede, Önceden Ayarlanmış Görüntüleme Adımı'nı seçin. Odağı ve pozlamayı önce DAPI kanalında ayarlayın.Tüm kanallarda Otomatik Pozlama kutusunun işaretini kaldırın, ardından DAPI kanalının yanındaki mikroskop simgesini tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. Netlemeyi yönlendirmek için kuyuyu seçin.Bir sinyal zaten görünüyorsa, önce Otomatik Netleme'yi ve ardından Otomatik Pozlama'yı tıklatın. Değilse, önce pozlamayı artırın ve Otomatik Netleme ve Otomatik Pozlamayı tekrarlayın. Pozlama, Pozlama açılır menüsü seçilerek manuel olarak ayarlanabilir.Birden fazla kuyucuktaki ayarları kontrol edin, ardından ayarları kaydedin. Pozlamayı tüm kanallar için aynı şekilde ayarlayın. RFP kanalı için, orta-yüksek kireçlenmeye sahip bir kuyu ile başladığınızdan emin olun.Prosedür penceresini kapatın ve üst görev çubuğundaki yeşil Şimdi Oku düğmesini seçin. Denemeyi yazılım tarafından belirtildiği şekilde kaydedin. Her zaman noktası için bu işlemi tekrarlayın.Sistem plakayı okurken, tüm görüntüler arka planda otomatik olarak işlenir. Görüntülenecek TsF DAPI görüntülerini seçerek hücre sayısı ayarlarını yapın. Çift tıklayarak istediğiniz kuyuyu seçin.Yeni bir pencere açılacaktır. Görüntülerden birini seçin. Açılır pencerede Analiz sekmesini seçin.Hücresel Analiz Hücre Sayısı'nı seçin ve Tamam'ı tıklatın. RFP ve Parlak Alan kanallarının seçimini kaldırın. Nesneleri Vurgula kutusunu işaretleyin. Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın.Boyut ve Yoğunluk Eşiği'ni tüm çekirdekleri içerecek şekilde ayarlayın, ancak kalıntıları hariç tutun, ardından Tamam'ı tıklayın. Ayarları tüm resimlere uygulamak için sol alttaki Değişiklikleri Uygula'yı tıklayın. Benzer şekilde, orta-yüksek miktarda kireçlenme içeren iyi uçlu bir görüntü seçin. Sinyal-gürültü oranını en iyi şekilde ayarlamak için, Görev menüsündeki Analiz sekmesini tıklatın.Görüntü İstatistikleri'ni seçin. DAPI ve Parlak Alan kanalının seçimini kaldırın. Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın.Eşik Aykırı Değerleri kutusunu işaretleyin. Arka planın üzerindeki sinyalin öznel olmayan eşik değerini ayarlamak için, görev çubuğundan Çizgi aracını seçin. Bir pencere açılacaktır.Arka planın bir alanını dahil ederken bir sinyal yaması boyunca bir çizgi çizin. Eşiklerin üst ve alt değerlerini ayarlayın. Yalnızca arka planın üzerindeki sinyali sayın ve enkaz veya eserler varsa hariç tutun.Tamam'ı tıklatın ve ayarları diğer tüm kuyucuklara aktarmak için değişiklikleri uygulayın. Eşiğin diğer kuyularda doğru seçildiğini onaylayın. Hücre sayısı ve RFP eşikleri ayarlandıktan sonra verileri dışarı aktarın.Verileri doğrudan bir elektronik tabloya dışa aktarmak için açılır menünün yanındaki Excel düğmesini tıklatın. Düşükten yükseğe kadar değişen farklı kalsifikasyon aşamaları tespit edildi ve analiz edildi. Kalsifikasyon, ışık mikroskobu kullanılarak siyah lekeler olarak tespit edildi, bu da birincil değerlendirme ve görüntülemeye ne zaman başlanacağını belirlemek için yararlı oldu.Geliştirilmiş bir sinyal-gürültü oranı için, işlenmiş RFP görüntüleri kireçlenmeyi ölçmek için analiz edildi. Veriler, aynı zaman noktasında iki veya daha fazla koşulun karşılaştırılmasıyla elde edildi. Veriler, hücre başına kalsifikasyon alanı olarak hücre sayımına normalleştirildi.Veriler aynı zamanda çeşitli zaman noktalarında aynı durumu gösteren bir zaman serisi olarak da tasvir edildi. Veri azaltma ve analizden sonraki sonuçların, görüntü dönüşümü ve eşik değerinden önce görülebilenleri yansıtması önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...