Name: models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

نحن نعترف بلين فوستر للمساعدة الفنية أثناء تطوير هذه النماذج. نحن نقدر أموال بدء التشغيل من قسم علم الأحياء الدقيقة الجزيئية ومركز أبحاث الأمراض المعدية للمرأة (إلى AL) ، و March of Dimes (جائزة باسل أوكونور ل AL) التي ساعدت في دعم تجارب المرحلة المبكرة. كما دعم المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01 AI114635) تطوير هذه النماذج.

<ol>
	<li>Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+vaginal+flora,+H2O2-producing+lactobacilli,+and+bacterial+vaginosis+in+pregnant+women.">The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women.</a> Clinical Infectious Diseases. 16, 273-281 (1993).</li><li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women.">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).</li><li>Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriology+of+the+vagina.">Bacteriology of the vagina.</a> Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).</li><li>van de Wijgert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaginal+microbiome+and+sexually+transmitted+infections+are+interlinked:+Consequences+for+treatment+and+prevention.">The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention.</a> PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis:+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria.">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).</li><li>Shipitsyna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+vaginal+microbiota+in+women+of+reproductive+age-sensitive+and+specific+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis+is+possible.">Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible.</a> PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).</li><li>Brotman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+assessed+by+gram+stain+and+diminished+colonization+resistance+to+incident+gonococcal,+chlamydial,+and+trichomonal+genital+infection.">Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).</li><li>Peipert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis,+race,+and+sexually+transmitted+infections:+does+race+modify+the+association.">Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association.</a> Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).</li><li>Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+is+a+strong+predictor+of+Neisseria+gonorrhoeae+and+Chlamydia+trachomatis+infection.">Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).</li><li>Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+abnormal+vaginal+flora,+proinflammatory+cytokines+and+idiopathic+infertility+in+women+undergoing+IVF.">Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF.</a> The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).</li><li>Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+bacterial+vaginosis+on+conception+and+miscarriage+in+the+first+trimester:+cohort+study.">Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study.</a> BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).</li><li>Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+and+vaginal+microorganisms+in+idiopathic+premature+labor+and+association+with+pregnancy+outcome.">Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).</li><li>DiGiulio, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+prevalence,+diversity+and+abundance+in+amniotic+fluid+during+preterm+labor:+a+molecular+and+culture-based+investigation.">Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation.</a> PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).</li><li>Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+in+a+cohort+of+Danish+pregnant+women:+Prevalence+and+relationship+with+preterm+delivery,+low+birthweight+and+perinatal+infections.">Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections.</a> British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).</li><li>&#193;d&#225;m, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-+and+PCR-based+detection+of+BV+associated+microbiological+profile+of+the+removed+IUDs+and+correlation+with+the+time+period+of+IUD+in+place+and+the+presence+of+the+symptoms+of+genital+tract+infection.">Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection.</a> Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).</li><li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cervico-vaginal+microbiota+in+women+developing+persistent+high-risk+Human+Papillomavirus+infection.">Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).</li><li>Bullman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fusobacterium+persistence+and+antibiotic+response+in+colorectal+cancer.">Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer.</a> Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).</li><li>Brennan, C. A., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota,+inflammation,+and+colorectal+cancer.">Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer.</a> Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).</li><li>Hill, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+birth:+associations+with+genital+and+possibly+oral+microflora.">Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora.</a> Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).</li><li>Hitti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+indicators+of+amniotic+fluid+infection+in+preterm+labor.">Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).</li><li>DiGiulio, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+microbes+in+amniotic+fluid.">Diversity of microbes in amniotic fluid.</a> Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).</li><li>Patras, K. A., Doran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+Group+B+Streptococcus+vaginal+colonization.">A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).</li><li>Jerse, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-treated+female+mice+as+surrogate+hosts+for+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections.">Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).</li><li>Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+bacterial+vaginosis+in+a+murine+model+of+vaginal+infection+with+Gardnerella+vaginalis.">Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis.</a> PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).</li><li>Gilbert, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardnerella+vaginalis+and+Prevotella+bivia+trigger+distinct+and+overlapping+phenotypes+in+a+mouse+model+of+bacterial+vaginosis.">Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).</li><li>Agarwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+cross-feeding+supports+mutualism+between+Fusobacterium+and+the+vaginal+microbiota.">Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota.</a> PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).</li><li>Liehr, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+estradiol+a+genotoxic+mutagenic+carcinogen.">Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).</li><li>Yager, J. D., Davidson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+carcinogenesis+in+breast+cancer.">Estrogen carcinogenesis in breast cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation,+foraging,+and+depletion+of+mucus+sialoglycans+by+the+vagina-adapted+Actinobacterium+Gardnerella+vaginalis.">Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).</li><li>Robinson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+15+Gardnerella+vaginalis+strains+isolated+from+the+vaginas+of+women+with+and+without+bacterial+vaginosis.">Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis.</a> Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).</li><li>Adapted from &amp;#34;mouse posterior turn&amp;#34; by BioRender.com. BioRender.com Available from: <a target="_blank" href="https://app.biorender.com/biorender-templates">https://app.biorender.com/biorender-templates</a> (2022)</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).</li><li>Verollet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+step+towards+efficient+sample+preparation+with+bead-beating.">A major step towards efficient sample preparation with bead-beating.</a> Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

الطريقة الأكثر أهمية التي يختلف بها النموذج الموصوف هنا عن نماذج التلقيح المهبلي المنشورة سابقا هي استخدام البكتيريا المستزرعة لاهوائيا ، والتي تتطلب اعتبارات خاصة لإعداد لقاح قابل للحياة واستعادة البكتيريا من الفئران. قد تختلف الخطوات المحددة في البروتوكول أعلاه اختلافا طفيفا اعتمادا على الأنواع / سلالة البكتيريا المستخدمة ، كما هو مقترح في الملف التكميلي 1. بالإضافة إلى ذلك ، تصف هذه المخطوطة طريقة إجرائية جديدة لإدارة البكتيريا والغسول المهبلي تتطلب خبرة أقل من جانب الباحث وضبط أقل للفئران. إذا كان المجرب غير مرتاح لشكل ضبط النفس الموضح في الخطوة 3.2. والخطوة 3.3 ، يمكن بدلا من ذلك تقشير الفئران كما هو موضح سابقا34 مع أو بدون تخدير وفقا للتصميم التجريبي وإرشادات IACUC المؤسسية.
أحد التحذيرات المهمة لاستخدام البكتيريا المستزرعة لاهوائيا في نماذج الفئران هو أن بعض الخطوات (مثل أي خطوات تنطوي على حية) يجب أن تتم خارج الغرفة اللاهوائية. لذلك ، فإن أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي تلك التي تتعرض فيها البكتيريا ذات الأهمية لبيئة هوائية ، مثل أثناء تلقيح الفئران. سيتطلب استخدام أي لاهوائية جديدة في هذا النموذج تحقيقا أوليا في قدرته على الحفاظ على صلاحيته عند التعرض للأكسجين (مثل مقارنة وحدات CFU قبل وبعد التلقيح كما هو موضح في الخطوة 2.5. والخطوة 3.4.). اعتمادا على درجة الأكسجين وحساسية PBS للكائن الحي ، ينبغي النظر في طرق مختلفة لإعداد اللقاح (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 2.4.5.). بالنسبة للتلقيح باستخدام G. vaginalis JCP8151B ، وجدنا أنه يمكن تحضير أنبوب واحد من اللقاح في PBS واستخدامه لإصابة جميع الفئران. إذا تم استخدام بكتيريا لاهوائية مختلفة أكثر حساسية للأكسجين ، فيمكن بدلا من ذلك تحضير اللقاح في أنابيب منفصلة لكل فأر بحيث لا يلزم فتح / إغلاق الأنبوب بشكل متكرر. وبالمثل ، إذا كانت الأنواع البكتيرية ذات الأهمية أكثر حساسية / أقل قدرة على البقاء على قيد الحياة في برنامج تلفزيوني من G. vaginalis ، فيمكن بدلا من ذلك تحضير التلقيح في وسائط الاستزراع. إذا كان الوسيط المستخدم يحتوي على عوامل اختزال ، مثل وسيط CDC اللاهوائي المستخدم في زراعة Prevotella bivia (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 2.1. والخطوة 2.2.) ، فإن البكتيريا ستحصل أيضا على حماية متزايدة من التعرض للأكسجين.
يمكن أيضا النظر في طرق بديلة للتجانس ، مثل ضرب الخرز22,35 ، والذي يتم مع إغلاق غطاء الأنبوب وبالتالي قد يدخل كمية أقل من الأكسجين من الخالط المحمول باليد. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب الكائنات الحية الأكثر حساسية للأكسجين وقت توازن أطول للوسائط. يمكن استخدام مؤشر الأكسجين مثل resazurin للتحقق من الوصول إلى الظروف اللاهوائية (الخطوة 2.1.). قد تؤثر الطرق البديلة مثل الجرار اللاهوائية على النتائج ويجب فحصها للتأكد من صلاحيتها للبكتيريا قبل الاستخدام.
قد تلعب حساسية الأكسجين وسرعة الكائن التجريبي أيضا دورا في الاسترداد الناجح للبكتيريا القابلة للحياة من الفأر أثناء الغسل / التجانس (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 3.2. والخطوة 5.1). بالنسبة للكائنات شديدة الحساسية ، قد يؤدي الوقت بين الغسل الذي يتم أخذه والطلاء إلى فقدان الصلاحية ويسبب تقديرا منخفضا بشكل مصطنع للاستعمار المهبلي البكتيري. للتخفيف من هذا التأثير ، يمكن تخفيف الغسل الذي تم جمعه على الفور إلى وسائط استزراع لاهوائية جديدة (مع عامل اختزال). وبالمثل ، يمكن إجراء تجانس الأعضاء في وسائط زراعة جديدة بدلا من PBS لزيادة قابلية البكتيريا ويمكن أيضا القيام به في الغرفة اللاهوائية نفسها لتقليل التعرض للأكسجين.
اعتمادا على الغرض من تجربة معينة ، يجب على المجرب الانتباه إلى مجموعات التحكم. لاختبار الفرضيات ، ستساعد المقاييس الأساسية للفئران الضابطة غير المصابة التي يتم علاجها بالمركبة وحدها في تحديد ما إذا كان هناك تحريض للكيموكينات / السيتوكينات أو نتائج محددة أخرى للعدوى. يجب أن تكون مركبة التحكم المستخدمة هي نفس السيارة المستخدمة للتلقيح، لذلك إذا تم تلقيح البكتيريا في وسط الاستزراع، فيجب استخدام وسائط الاستزراع غير الملقحة كعنصر تحكم (الملف التكميلي 1، الخطوة 2.4.5).
يمكن أيضا تطبيق الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول على البكتيريا الاختيارية القادرة على النمو لاهوائيا ولكن يتم دراستها تقليديا باستخدام ظروف الاستزراع الهوائي (مثل الإشريكية القولونية أو المجموعة ب العقدية). قد يكون هذا مناسبا بشكل خاص للعدوى التي تسببها هذه الكائنات الحية في مواقع الجسم التي يعتقد أنها تحتوي على مستويات منخفضة من الأكسجين ، مثل عنق الرحم. قد يكون الكائن الاختياري أكثر نجاحا يصيب المواقع بكمية أقل من الأكسجين عندما يتم تحضير اللقاح لاهوائيا مقارنة بالهواء. في مثل هذه التجربة ، قد لا يتطلب استرداد البكتيريا القابلة للحياة لتعداد CFU ظروفا لاهوائية.

في الثدييات ، المهبل هو موطن لمجموعة من الأنواع البكتيرية. الميكروبيوم المهبلي البشري فريد من نوعه بين الثدييات في وفرة أعضاء جنس Lactobacillus وما يقابله من انخفاض درجة الحموضة المهبلية (3.8-4.5) 1،2،3،4. يرتبط اضطراب هيمنة Lactobacillus بمجموعة متنوعة من النتائج الصحية السلبية.
في التهاب المهبل الجرثومي (BV) هناك عدد أقل من العصيات اللبنية وزيادة وفرة البكتيريا اللاهوائية المتنوعة ، مثل Gardnerella vaginalis و Prevotella bivia 5,6. النساء المصابات بالتهاب المهبل الجرثومي معرضات بشكل متزايد لخطر الإصابة بالأمراض المنقولة جنسيا7،8،9 ، والعقم 10 ، وفقدان الحمل 11 ، والولادة المبكرة12،13،14 ، والالتهابات داخل الرحم 15 ، والتهابات عنق الرحم 16 ، والسرطان 16،17،18 . يرتبط BV أيضا باحتمالية أكبر للاستعمار المهبلي بواسطة البكتيريا المسببة للأمراض المحتملة ، مثل Fusobacterium nucleatum1،19،20 ، وهو عزل شائع من عدوى السائل الأمنيوسي 21.
نظرا لأهمية البكتيريا اللاهوائية في صحة المهبل البشري ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا هذه الكائنات الحية وإمراضها. هنا ، نصف طرق التلقيح المهبلي والتعافي القابل للحياة ل Gardnerella vaginalis في الفئران المستروجة ونقترح استراتيجيات إضافية ل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum. تم وصف نماذج أخرى من الاستعمار المهبلي للفئران سابقا ، لكنها ركزت على تلقيح واستعادة البكتيريا اللاهوائية الاختيارية مثل المجموعة B Streptococcus22 و Neisseria gonorrhoeae23 التي تم استزراعها هوائيا. يمكن تحقيق التلقيح واستعادة اللاهوائيات الملزمة بنجاح باستخدام الاستراتيجيات التجريبية المناسبة. نناقش مناهج الاستعادة القابلة للتطبيق للعديد من الأصناف البكتيرية ونقترح تقييما تجريبيا لظروف بقاء الأنواع / السلالات الإضافية ذات الاهتمام.
الطريقة الكلاسيكية لتقدير الاستعمار بواسطة البكتيريا الحية هي استعادة وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs). في الفئران التي يتم تربيتها تقليديا مع الجراثيم الداخلية الخاصة بها ، يتطلب هذا التعافي على وسائط أجار التي تختار ضد أعضاء الجراثيم المهبلية الداخلية مع السماح لسلالة البكتيريا الملقحة بالنمو. هنا ، نستخدم عزلة مقاومة للستربتومايسين من G. vaginalis24 والتي يمكن استردادها بشكل انتقائي على وسط أجار يحتوي على الستربتومايسين. للتأكد من أن الوسط انتقائي بما فيه الكفاية ، وعلى العكس من ذلك ، أن البكتيريا المقاومة للستربتومايسين غير موجودة في الميكروبيوم الداخلي ، يجب طلاء الغسلات المهبلية التي يتم جمعها قبل التلقيح مباشرة على أجار انتقائي (يحتوي على الستربتومايسين).
قد تختلف أفضل طريقة لإعداد اللقاح بين أنواع وسلالات البكتيريا. قبل بدء التجارب على الفئران ، يجب إجراء العمل الأولي لتحديد الظروف المفضلة لوسط الاستزراع ، ونقطة نهاية النمو ، وإعداد اللقاح ، وكذلك القابلية للأكسجين والجدوى في برنامج تلفزيوني. في حالة البكتيريا الأكثر حساسية للأكسجين، يمكن النظر في الاستعدادات البديلة للقاحي (على سبيل المثال، في وسط ثقافة لاهوائية مع مجموعة تحكم مركبة مناسبة)25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1631</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m, 50 mL Steriflip vacuum filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;SCGP00525</td>
			<td>sterile filtering sesame oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190-proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>&#160;V1105M</td>
			<td>dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT21040CM</td>
			<td>vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G &#215; 5/8 -in needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td>7200000</td>
			<td>Growth of anaerobic bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0140074</td>
			<td>G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118170</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbia broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0944170</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>DSB500</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;11008-13</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogenizer</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>3305500</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>SHS500</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)</td>
			<td>Matheson</td>
			<td></td>
			<td>Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>mouse anaethesia at sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1626</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>for making media and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-200 filter tips</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>&#160;P-1237-200</td>
			<td>vaginal lavages and bacterial inoculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic digest of casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70169</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone #3</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;14084-08</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;ICN15662191</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge surgical carbon steel razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to agar media to make selective plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin slip tip 1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitaim K3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95271</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria

يمكن استعمار مهبل الثدييات بواسطة العديد من الأصناف البكتيرية. غالبا ما تهيمن أنواع Lactobacillus على الميكروبيوم المهبلي البشري ، لكن واحدة من كل أربع نساء تعاني من التهاب المهبل الجرثومي ، حيث يصاحب انخفاض مستوى العصيات اللبنية فرط نمو البكتيريا اللاهوائية المتنوعة. ارتبطت هذه الحالة بالعديد من المضاعفات الصحية ، بما في ذلك المخاطر على الصحة الإنجابية والجنسية. في حين أن هناك أدلة متزايدة تظهر الطبيعة المعقدة للتفاعلات الميكروبية في صحة المهبل البشري ، فإن الأدوار الفردية لهذه البكتيريا اللاهوائية المختلفة ليست مفهومة تماما. هذا معقد بسبب عدم وجود نماذج كافية لدراسة البكتيريا المهبلية المزروعة لاهوائيا. تسمح لنا نماذج الماوس بالتحقيق في بيولوجيا وضراوة هذه الكائنات الحية في الجسم الحي. تم وصف نماذج الفئران الأخرى من التلقيح البكتيري المهبلي سابقا. هنا ، نصف طرق تلقيح البكتيريا المزروعة لاهوائيا واستعادتها القابلة للحياة في الفئران C57Bl / 6 التي يتم تربيتها تقليديا. كما تم وصف طريقة إجرائية جديدة أقل إرهاقا للتلقيح المهبلي والغسيل. يتم تحديد التلقيح والانتعاش القابل للحياة من Gardnerella بالتفصيل ، وتناقش استراتيجيات اللاهوائية الإضافية مثل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum .

يوضح التمثيل التخطيطي لتجربة مثال بعض الطرق التي يمكن للمرء من خلالها تنفيذ البروتوكول الموصوف (الشكل 1).
تحمل بعض الحيوانات ميكروبات داخلية المنشأ في الميكروبات المهبلية التي ستنمو على وسائط غير انتقائية. تعتمد الطرق الموصوفة هنا على العزلات المقاومة للستربتومايسين للسلالات البكتيرية المدروسة ، جنبا إلى جنب مع الوسائط الانتقائية التي تحتوي على الستربتومايسين ، للاختيار ضد البكتيريا الداخلية (الشكل 2 أ ، ب). من الممكن أن تتطور مقاومة الستربتومايسين تلقائيا ، لذا فإن فحص الفئران قبل الإصابة (اليوم 0 يغسل) يمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كانت هذه مشكلة.
يتم استعادة البكتيريا القابلة للحياة من الغسول المهبلي عن طريق التخفيف التسلسلي والطلاء على وسائط أجار. يمكن أن يستوعب طبق بتري القياسي ما يصل إلى 6 × 6 صفيف من بقع 5 ميكرولتر ، مما يسمح بتعداد التتر البكتيري من ست نقاط متماثلة عبر ستة أوامر من حيث الحجم لكل عينة في حالة استخدام تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف (الشكل 3 أ). يمكن استخدام هذه الطريقة لتعداد عيار البكتيريا التي تتراوح من Gardnerella إلى Prevotella و Fusobacterium (الشكل 3B-D).
معا ، تسمح هذه الطرق للمرء باختبار الفرضيات وتقديم تفسيرات حول الاستعمار البكتيري / العدوى في الجهاز التناسلي للأنثى. على سبيل المثال ، أظهرت مقارنة عيار Gardnerella في الغسول المهبلي وتجانس الأنسجة المهبلية التوافق بين هذه الطرق (الشكل 4 أ). وبالمثل ، في نموذج التلقيح المشترك المهبلي ، كانت عيارات Prevotella في أنسجة الرحم أعلى بكثير (حوالي 20 ضعفا) أثناء عدوى Gardnerella المشتركة مقارنة بعدوى Prevotella الأحادية (الشكل 4B). أخيرا ، يمكن مقارنة السلالات البكتيرية من النوع البري مقابل السلالات البكتيرية الطافرة في هذه النماذج لتحديد الأدوار التي تلعبها جينات معينة ومنتجاتها في عمليات استعمار / عدوى الجهاز التناسلي. على سبيل المثال ، أدت سلالة متحولة من Fusobacterium تفتقر إلى القدرة على نقل واستهلاك حمض السياليك الكربوهيدراتي إلى انخفاض مستويات الاستعمار لمدة 3 أيام بعد التلقيح (الشكل 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لتجربة نموذجية33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> الشكل 2: نمو الميكروبات المهبلية للفئران الذاتية على الآجار الانتقائي مقابل الأجار غير الانتقائي. تم وضع الغسل المهبلي من خمس إناث C57Bl / 6 فئران (1-5) على صفيحتين مختلفتين من أجار NYC III وتم تحضينها لاهوائيا. (أ) الصفيحة الموجودة على اليسار لا تحتوي على أي مضادات حيوية، وتسمح بنمو البكتيريا اللاهوائية الداخلية من القناة المهبلية للفئران. (ب) تحتوي الصفيحة الموجودة على اليمين على 1 ملغم/مل من الستربتومايسين، وتنتقص ضد نمو البكتيريا الذاتية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> الشكل 3: استعادة G. vaginalis و P. bivia و F. nucleatum CFUs القابلة للحياة من الغسول المهبلي. (أ) وحدات CFU من لقاح G. vaginalis JCP8151B-SmR ، مطلي بنسخة طبق الأصل كسلسلة تخفيف على أجار NYC III. (ب - د) استعادة قابلة للحياة (B) G. vaginalis24 ، (C) P. bivia25 ، و (D) F. nucleatum26 من الغسيل المهبلي للحيوانات أحادية العدوى. لكل رسم بياني (B-D) ، يتم دمج البيانات من تجربتين مستقلتين ، مع 10-15 فأر لكل تجربة24،25،26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> الشكل 4: مزيد من التحليل للاستعمار البكتيري اللاهوائي في نموذج التلقيح المهبلي للفئران . (أ) ترتبط عيار G. المهبلية في الغسول المهبلي بعيار G. vaginalis المستعاد من تجانس الأنسجة المهبلية عند 24 ساعة و 72 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، ن = 10 لكل منهما. الدلالة التي يحددها اختبار ارتباط رتبة سبيرمان)24. (ب) تؤدي العدوى المشتركة مع G. vaginalis إلى زيادة عيار P. bivia في أنسجة قرن الرحم مقارنة بالحيوانات أحادية العدوى P. bivia في 48 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، كل منهما مع 6-10 فئران لكل مجموعة . الدلالة التي يحددها اختبار Mann-Whitney U ، ** p = 0.0017)25. (C) F. nucleatum الطافر مع ناقل حمض السياليك المعطل (Ω SiaT) قد قلل من التتر في الغسل المهبلي للفئران أحادية العدوى مقارنة بالنوع البري من F. nucleatum عند 72 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، كل منهما يحتوي على 10 فئران لكل مجموعة . تم تحديد الأهمية بواسطة اختبار Mann-Whitney U ، ** p < 0.01) 26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الملف التكميلي 1: أمثلة على الطرق المستخدمة للبكتيريا المهبلية المختلفة التي تزرع في ظل الظروف اللاهوائية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

يقدم البروتوكول نموذجا للفأر للاستعمار المهبلي مع البكتيريا المهبلية البشرية المزروعة لاهوائيا. نحن نركز على Gardnerella vaginalis ، مع تضمين اقتراحات ل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول كدليل للتلقيح المهبلي والتعافي القابل للتطبيق للبكتيريا الأخرى المزروعة لاهوائيا.

نماذج من استعمار الفئران المهبلي بواسطة البكتيريا المزروعة لاهوائيا

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

ستساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية للبكتيريا اللاهوائية التي تعيش وتسبب العدوى في الجهاز التناسلي للأنثى. ركزت النماذج السابقة من التلقيح المهبلي للفئران على البكتيريا التي نمت وتعافت في ظل الظروف الهوائية. ترشد طريقتنا إلى تلقيح واستعادة البكتيريا اللاهوائية الإلزامية ، والتي تتطلب استراتيجيات إضافية لتقليل التعرض للأكسجين.اعتمادا على مدى ثباتها ، قد تتطلب السلالات البكتيرية الجديدة المستخدمة في هذا النموذج تغييرات في خطوات معينة. لقد قدمنا اقتراحات للتعديلات المحتملة في الجدول الأول من المخطوطة. بادئ ذي بدء ، أضف 200 ميكرولتر من مزرعة بكتيرية عمرها 16 ساعة إلى كوفيت سعة 1.5 ملليلتر مع 800 ميكرولتر من الوسائط الطازجة في غرفة لاهوائية.ثم قم بقياس الكثافة الضوئية ، أو OD ، للثقافة المخففة عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام كفيت منفصل مع الوسائط فقط كفراغ. للحصول على قيمة OD الفعلية للثقافة ، اضرب قراءة مقياس الطيف الضوئي في خمسة ، ثم حدد حجم اللقاح المطلوب للتجربة واحسب حجم الثقافة البكتيرية اللازمة لتحقيق كثافة اللقاح المطلوبة. بعد ذلك ، ماصة الحجم المطلوب من الثقافة البكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وأجهزة طرد مركزي عند 16،000 مرة G لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق.بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في PBS اللاهوائي لتحقيق الحجم المطلوب من اللقاح المحسوب من قبل. لتحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية في اللقاح المحضر ، أولا ، استخدم 10 ميكرولتر من المعلق البكتيري لعمل العديد من التخفيفات التسلسلية في PBS واستخدم ماصة متعددة القنوات لاكتشاف تخفيفات اللقاح على ألواح الآجار. في الوقت نفسه ، قم بإعداد أنابيب غسل المهبل في الغرفة اللاهوائية عن طريق سحب 70 ميكرولتر من PBS اللاهوائي المعقم في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر تحمل أرقام الفئران.أغلق الأنابيب بإحكام وأخرجها من الغرفة. لأداء غسل المهبل ، أولا ، ضع فأرا فوق قفص يمكنه الإمساك به بأقدامه الأمامية. ثم ، أمسك الجزء الأوسط من الذيل برفق وارفعه بحيث تكون الأرباع الخلفية مرتفعة قليلا وتتعرض فتحة المهبل.بعد سحب 50 ميكرولتر من PBS من أنبوب الغسيل المسمى ، أدخل طرف الماصة برفق من مليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في تجويف المهبل لغسله باستخدام PBS عن طريق السحب للداخل والخارج ثلاث إلى أربع مرات. بعد ذلك ، انقل مادة الغسيل مرة أخرى إلى أنبوب الغسيل الأصلي مع 20 ميكرولتر المتبقية من PBS غير المستخدمة. مباشرة بعد هذا الغسل المهبلي ، قم بتلقيح كل فأر عن طريق نقل 20 ميكرولتر عن طريق المهبل من التعليق البكتيري أو التحكم في السيارة.بالنسبة لتجارب التلقيح المشترك مع سلالتين بكتيريتين مختلفتين ، قم بالتلقيح بشكل منفصل باستخدام 10 ميكرولتر من كل معلق بكتيري ، بدلا من خلط السلالات مسبقا. لمنع الحجم المعطى من التراكم على الفور عند مقدمة المهبل ، استمر في رفع الجزء الخلفي للفأر لمدة 10 إلى 20 ثانية. انقل الفأر الملقح إلى قفص جديد أو مع زملائه في القفص الملقح بالفعل ، وكرر الإجراء مع الفئران الأخرى.بعد تلقيح جميع الفئران ، احصل على وحدات تشكيل مستعمرة ما بعد اللقاح عن طريق طلاء التخفيفات التسلسلية للقاحة في الغرفة اللاهوائية. لجمع أعضاء الفأر ، قم بإعداد أنابيب جمع الأعضاء سعة خمسة ملليلتر في الغرفة اللاهوائية عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS اللاهوائي المعقم إلى كل أنبوب للمهبل وعنق الرحم. أضف 750 ملليلتر من PBS إلى الأنابيب المحددة لقرون الرحم.لجمع الغسيل النهائي عند التضحية ، قم بإعداد مجموعة أخرى من أنابيب غسل المهبل كما هو موضح سابقا. أيضا ، لشطف وتعقيم أدوات التشريح ، قم بإعداد دورق سعة 50 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات وكأس زجاجية سعة 50 ملليلتر من 70 إلى 90٪ من الإيثانول. مباشرة قبل أو بعد التضحية بالفئران ، قم بإجراء الغسيل النهائي كما هو موضح سابقا.بعد التضحية ، رش بطن وظهر الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، استخدم مقص الإيثانول المعقم والمجفف لفتح تجويف الحوض البطني للماوس بجروح رأسية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لسحب الجلد.لفضح الجهاز التناسلي ، ادفع الأمعاء برفق خارج تجويف الجسم إلى جانب الحقل المفتوح وأزل المثانة من الماوس للوصول إلى الجزء السفلي من الجهاز التناسلي. بعد ذلك ، قص مركز عظم العانة بمقص دون قطع المهبل. بعد ذلك ، استخدم مجموعتين من الملقط للإمساك بكل جانب من الحوض وسحب الحوض مفتوحا بشكل جانبي لكشف الجزء السفلي من المهبل تحته.أمسك عنق الرحم برفق بالملقط واسحبه لأعلى لفضح القولون. بعد ذلك ، استخدم مقص صغير لتحرير المهبل من الأنسجة الضامة الخارجية. حرر المهبل بعناية من القولون دون ثقب الأمعاء.عندما يتم تحرير المهبل بالكامل من القولون ، استخدم المقص لإحاطة المهبل عند المقدمة ثم قصه لإزالته من جسم الفأر. الحفاظ على قبضة لطيفة على عنق الرحم ، اسحبه لأعلى لجعل قرون الرحم أكثر وضوحا وقطع مباشرة أسفل المبيضين على الجانبين الأيمن والأيسر لتحرير قرون الرحم. بعد ذلك ، قم بإزالة الجهاز التناسلي من جسم الفأر وضعه في طبق بتري معقم.ثم ، باستخدام شفرة حلاقة ، افصل قرون الرحم وعنق الرحم والمهبل. ضع كل منديل في أنبوب التجميع المسمى الخاص به. لتجانس الأعضاء ، اجعل الخالط المحمول جاهزا في خزانة السلامة البيولوجية.أولا ، قم بإعداد مجموعة من ثلاثة أنابيب سعة 50 ملليلتر بالماء منزوع الأيونات ، و 70٪ من الإيثانول ، و PBS ، على التوالي ، لغسل شفرات الخالط بعد تجانس كل عضو. لتنظيف الخالط ، اغمس الشفرة في أنبوب الماء وقم بتشغيل الجهاز بأقصى سرعة لمدة ثلاث ثوان تقريبا. ثم هز الشفرة على منشفة ورقية لإزالة الماء الزائد.شطف الشفرة على التوالي في 70 ٪ من الإيثانول و PBS. بعد الشطف الأولي ، قم بخفض مسبار الخالط إلى أسفل الأنبوب مع الأعضاء لاحتجاز الأنسجة تحته. بعد ذلك ، قم بتشغيل الخالط لطحن الأنسجة وحرك المسبار برفق لأعلى ولأسفل حوالي خمس مرات ، مع إبقائه مغمورا.قم بإيقاف تشغيل الخالط وإزالته وتأكد بصريا من تعطيل الأنسجة بالكامل. بعد التجانس ، قم بتدوير العينة مرة أخرى إلى الغرفة اللاهوائية وقم بإجراء التخفيف التسلسلي لاستعادة CFU. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن استعادة البكتيريا القابلة للحياة وتعداد وحدات تشكيل المستعمرة من الغسول المهبلي بنجاح للسلالات البكتيرية ، Gardnerella vaginalis ، Prevotella bivia ، و Fusobacterium nucleatum.علاوة على ذلك ، فإن عدد وحدات تشكيل مستعمرة Gardnerella vaginalis التي تم الحصول عليها من الغسول المهبلي يرتبط بتلك المستعادة من تجانس الأنسجة المهبلية. كشفت هذه الطريقة أيضا أن عيار Prevotella bivia وأنسجة رحم الفأر كانت أعلى بشكل ملحوظ أثناء العدوى المشتركة مع Gardnerella vaginalis مقابل عدوى Prevotella mono. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بنجاح لمقارنة الثبات المهبلي لسلالة Fusobacterium nucleatum الطافرة مع النوع البري في 24 و 72 ساعة بعد التلقيح.للتحقيق في الاستجابة المناعية للتلقيح البكتيري المهبلي ، يمكن إجراء فحوصات السيتوكين على تجانس الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن حفظ الأنسجة للفحص النسيجي لتقييم علامات الالتهاب.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة 1 H NMR الطيفي

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية عن طريق اختبارات بيولوجية على النواة

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

استعمار Euprymna scolopes الحبار بواسطة الضمة fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...