Name: models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00
Duration: 8 min 53 s
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Nous remercions Lynne Foster pour son assistance technique lors de l’élaboration de ces modèles. Nous apprécions les fonds de démarrage du Département de microbiologie moléculaire et du Center for Women’s Infectious Disease Research (à AL), ainsi que la March of Dimes (prix Basil O’Connor à AL) qui ont aidé à soutenir les expériences à un stade précoce. L’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (R01 AI114635) a également soutenu le développement de ces modèles.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La façon la plus importante dont le modèle décrit ici diffère des modèles d’inoculation vaginale publiés précédemment est l’utilisation de bactéries en culture anaérobie, qui nécessitent des considérations spéciales pour la préparation d’inoculum viable et la récupération des bactéries chez les souris. Les étapes spécifiques du protocole ci-dessus peuvent varier légèrement selon l’espèce ou la souche de bactéries utilisée, comme suggéré dans le dossier supplémentaire 1. De plus, ce manuscrit décrit une nouvelle méthode procédurale pour l’administration de bactéries et de lavages vaginaux qui nécessite moins d’expérience de la part de l’investigateur et moins de retenue pour les souris. Si l’expérimentateur n’est pas à l’aise avec la forme de contention décrite à l’étape 3.2. et l’étape 3.3., les souris peuvent plutôt être éraflées comme décrit précédemment34 avec ou sans anesthésie selon la conception expérimentale et les directives institutionnelles de l’IACUC.
Une mise en garde importante à l’utilisation de bactéries cultivées en anaérobiose dans les modèles murins est que certaines étapes (telles que celles impliquant des animaux vivants) doivent être effectuées à l’extérieur de la chambre anaérobie. Par conséquent, les étapes les plus critiques de ce protocole sont celles dans lesquelles les bactéries d’intérêt seront exposées à un environnement aérobie, comme lors de l’inoculation des souris. L’utilisation de tout nouvel anaérobie dans ce modèle nécessitera une étude préliminaire de sa capacité à maintenir sa viabilité en cas d’exposition à l’oxygène (comme la comparaison des UFC avant et après l’inoculation, comme décrit aux étapes 2.5 et 3.4). Selon le degré d’oxygène et la sensibilité au PBS de l’organisme, différentes méthodes de préparation de l’inoculum doivent être envisagées (dossier supplémentaire 1, étape 2.4.5.). Pour les inoculations utilisant G. vaginalis JCP8151B, nous avons constaté qu’un seul tube d’inoculum peut être préparé dans du PBS et utilisé pour infecter toutes les souris. Si une bactérie anaérobie différente est utilisée et plus sensible à l’oxygène, l’inoculum peut plutôt être préparé dans des tubes séparés pour chaque souris afin qu’il ne soit pas nécessaire d’ouvrir / fermer le tube de manière répétée. De même, si l’espèce bactérienne d’intérêt est plus exigeante / moins capable de survivre dans le PBS que G. vaginalis, l’inoculation peut plutôt être préparée dans des milieux de culture. Si le milieu utilisé contient des agents réducteurs, tels que le milieu anaérobie CDC utilisé pour la culture de Prevotella bivia (dossier supplémentaire 1, étape 2.1. et étape 2.2.), la bactérie aura également une protection accrue contre l’exposition à l’oxygène.
D’autres méthodes d’homogénéisation peuvent également être envisagées, telles que le battement du cordon22,35, qui se fait avec le bouchon du tube fermé et peut donc introduire moins d’oxygène que l’homogénéisateur portatif. De plus, les organismes plus sensibles à l’oxygène peuvent nécessiter un temps d’équilibre plus long pour les milieux. Un indicateur d’oxygène tel que la résazurine peut être utilisé pour vérifier que les conditions anaérobies ont été atteintes (étape 2.1.). D’autres méthodes telles que les pots anaérobies peuvent affecter les résultats et doivent être vérifiées pour la viabilité bactérienne avant utilisation.
La sensibilité à l’oxygène et la minutie de l’organisme expérimental peuvent également jouer un rôle dans la récupération réussie des bactéries viables de la souris pendant le lavage/homogénéisation (dossier supplémentaire 1, étape 3.2. et étape 5.1.). Pour les organismes très sensibles, le temps écoulé entre le lavage pris et le plaquage peut entraîner une perte de viabilité et provoquer une estimation artificiellement basse de la colonisation vaginale bactérienne. Pour atténuer cet effet, les lavages collectés peuvent être immédiatement dilués dans des milieux de culture anaérobies frais (avec agent réducteur). De même, l’homogénéisation des organes peut être effectuée dans des milieux de culture frais plutôt que dans du PBS pour augmenter la viabilité bactérienne et peut également être effectuée dans la chambre anaérobie elle-même pour minimiser l’exposition à l’oxygène.
Selon le but d’une expérience donnée, l’expérimentateur doit prêter attention aux groupes témoins. Pour tester les hypothèses, les mesures de base de souris témoins non infectées qui sont simulées traitées avec le véhicule seul aideront à établir s’il y a induction de chimiokines / cytokines ou d’autres résultats spécifiques de l’infection. Le véhicule témoin utilisé doit être le même que celui utilisé pour l’inoculation, donc si les bactéries sont inoculées dans des milieux de culture, les milieux de culture non inoculés doivent être utilisés comme témoin (dossier supplémentaire 1, étape 2.4.5.).
Les méthodes décrites dans ce protocole pourraient également être appliquées à des bactéries facultatives capables de se développer en anaérobiose, mais qui sont traditionnellement étudiées en utilisant des conditions de culture aérobie (comme Escherichia coli ou Streptocoque du groupe B). Cela pourrait être particulièrement pertinent pour les infections par ces organismes dans les sites du corps qui sont censés contenir de faibles niveaux d’oxygène, comme le col de l’utérus. Il se peut qu’un organisme facultatif infecte plus efficacement les sites avec moins d’oxygène lorsque l’inoculum est préparé en anaérobiose que par voie aérobie. Dans une telle expérience, la récupération de bactéries viables pour le dénombrement de l’UFC peut ne pas nécessiter de conditions anaérobies.

Chez les mammifères, le vagin abrite un consortium d’espèces bactériennes. Le microbiome vaginal humain est unique parmi les mammifères par son abondance de membres du genre Lactobacillus et le faible pH vaginal correspondant (3,8-4,5)1,2,3,4. La perturbation de cette dominance de Lactobacillus est associée à une variété de résultats négatifs pour la santé.
Dans la vaginose bactérienne (VB), il y a moins de lactobacilles et une abondance accrue de diverses bactéries anaérobies, telles que Gardnerella vaginalis et Prevotella bivia 5,6. Les femmes atteintes de VB courent un risque accru d’infections sexuellement transmissibles 7,8,9, d’infertilité 10, de pertes de grossesse 11, de naissances prématurées 12,13,14, d’infections intra-utérines 15, d’infections cervicales 16 et de cancer16,17,18 . La VB est également associée à une probabilité plus élevée de colonisation vaginale par des bactéries potentiellement pathogènes, telles que Fusobacterium nucleatum 1,19,20, un isolat commun des infections du liquide amniotique 21.
En raison de l’importance des bactéries anaérobies dans la santé vaginale humaine, il existe un besoin de modèles animaux qui peuvent être utilisés pour étudier la biologie et la pathogenèse de ces organismes. Ici, nous décrivons des méthodes d’inoculation vaginale et de récupération viable de Gardnerella vaginalis chez des souris œstrogéniques et suggérons des stratégies supplémentaires pour Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum. D’autres modèles de colonisation vaginale murine ont déjà été décrits, mais ils se sont concentrés sur l’inoculation et la récupération de bactéries anaérobies facultatives telles que Streptococcus22 du groupe B et Neisseria gonorrhoeae23 qui ont été cultivées en aérobiose. L’inoculation et la récupération des anaérobies obligatoires peuvent être accomplies avec succès avec des stratégies expérimentales appropriées. Nous discutons des approches pour le rétablissement viable de plusieurs taxons bactériens et suggérons une évaluation empirique des conditions de viabilité d’autres espèces / souches d’intérêt.
La méthode classique d’estimation de la colonisation par des bactéries vivantes est la récupération des unités formant colonie (UFC). Chez les souris élevées de manière conventionnelle avec leur propre microbiote endogène, cela nécessite une récupération sur gélose qui sélectionne les membres du microbiote vaginal endogène tout en permettant à la souche inoculée de bactéries de se développer. Ici, nous utilisons un isolat résistant à la streptomycine de G. vaginalis24 qui peut être récupéré sélectivement sur un milieu gélosé contenant de la streptomycine. Pour s’assurer que le milieu est suffisamment sélectif et, inversement, que les bactéries résistantes à la streptomycine ne sont pas présentes dans le microbiome endogène, les lavages vaginaux prélevés juste avant l’inoculation doivent être plaqués sur gélose sélective (contenant de la streptomycine).
La meilleure méthode de préparation de l’inoculum peut varier selon les espèces et les souches de bactéries. Avant le début des expériences sur la souris, des travaux préliminaires doivent être effectués pour déterminer les conditions préférables pour le milieu de culture, le critère de croissance et la préparation de l’inoculum, ainsi que la sensibilité à l’oxygène et la viabilité dans le PBS. Dans le cas de bactéries plus sensibles à l’oxygène, d’autres préparations de l’inoculum peuvent être envisagées (p. ex. dans un milieu de culture anaérobie avec un groupe témoin approprié du véhicule)25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1631</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m, 50 mL Steriflip vacuum filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;SCGP00525</td>
			<td>sterile filtering sesame oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190-proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>&#160;V1105M</td>
			<td>dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT21040CM</td>
			<td>vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G &#215; 5/8 -in needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td>7200000</td>
			<td>Growth of anaerobic bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0140074</td>
			<td>G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118170</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbia broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0944170</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>DSB500</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;11008-13</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogenizer</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>3305500</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>SHS500</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)</td>
			<td>Matheson</td>
			<td></td>
			<td>Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>mouse anaethesia at sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1626</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>for making media and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-200 filter tips</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>&#160;P-1237-200</td>
			<td>vaginal lavages and bacterial inoculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic digest of casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70169</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone #3</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;14084-08</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;ICN15662191</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge surgical carbon steel razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to agar media to make selective plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin slip tip 1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitaim K3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95271</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria

Le vagin des mammifères peut être colonisé par de nombreux taxons bactériens. Le microbiome vaginal humain est souvent dominé par les espèces de Lactobacillus , mais une femme sur quatre souffre de vaginose bactérienne, dans laquelle un faible niveau de lactobacilles s’accompagne d’une prolifération de diverses bactéries anaérobies. Cette condition a été associée à de nombreuses complications de santé, y compris des risques pour la santé reproductive et sexuelle. Bien qu’il y ait de plus en plus de preuves montrant la nature complexe des interactions microbiennes dans la santé vaginale humaine, les rôles individuels de ces différentes bactéries anaérobies ne sont pas entièrement compris. Ceci est compliqué par le manque de modèles adéquats pour étudier les bactéries vaginales cultivées en anaérobiose. Les modèles murins nous permettent d’étudier la biologie et la virulence de ces organismes in vivo. D’autres modèles murins d’inoculation bactérienne vaginale ont déjà été décrits. Ici, nous décrivons les méthodes d’inoculation de bactéries cultivées en anaérobiose et leur récupération viable chez des souris C57Bl/6 d’élévation conventionnelle. Une nouvelle méthode procédurale moins stressante pour l’inoculation et le lavage vaginaux est également décrite. L’inoculation et la récupération viable de Gardnerella sont décrites en détail, et des stratégies pour d’autres anaérobies tels que Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum sont discutées.

Une représentation schématique d’un exemple d’expérience montre quelques-unes des façons dont on pourrait exécuter le protocole décrit (Figure 1).
Certains animaux transportent des microbes endogènes dans leur microbiome vaginal qui se développeront sur des milieux non sélectifs. Les méthodes décrites ici reposent sur des isolats résistants à la streptomycine des souches bactériennes étudiées, ainsi que sur des milieux sélectifs contenant de la streptomycine, pour sélectionner les bactéries endogènes (Figure 2A,B). Il est possible que la résistance à la streptomycine se développe spontanément, de sorte que la vérification des souris avant l’infection (lavages au jour 0) peut aider à déterminer si cela peut être un problème.
La récupération des bactéries viables des lavages vaginaux est réalisée par dilution en série et placage sur un milieu gélosé. Une boîte de Pétri standard peut contenir jusqu’à un réseau 6 x 6 de taches de 5 μL, ce qui permet de dénombrer les titres bactériens à partir de six répliques de taches sur six ordres de grandeur pour chaque échantillon si l’on utilise des dilutions en série 10 fois (figure 3A). Cette méthode peut être utilisée pour dénombrer les titres de bactéries allant de Gardnerella à Prevotella et Fusobacterium (Figure 3B-D).
Ensemble, ces méthodes permettent de tester des hypothèses et de faire des interprétations sur la colonisation bactérienne / infection de l’appareil reproducteur féminin. Par exemple, une comparaison des titres de Gardnerella dans les lavages vaginaux et les homogénats de tissus vaginaux a démontré une concordance entre ces méthodes (figure 4A). De même, dans un modèle de co-inoculation vaginale, les titres de Prevotella dans le tissu utérin étaient significativement plus élevés (environ 20 fois) pendant la co-infection à Gardnerella par rapport à la mono-infection à Prevotella (Figure 4B). Enfin, les souches bactériennes de type sauvage par rapport aux souches bactériennes mutantes peuvent être comparées dans ces modèles afin d’établir les rôles joués par des gènes spécifiques et leurs produits dans les processus de colonisation / infection de l’appareil reproducteur. Par exemple, une souche mutante de Fusobacterium qui n’a pas la capacité de transporter et de consommer l’acide sialique glucidique a entraîné une baisse des niveaux de colonisation 3 jours après l’inoculation (figure 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma d’un exemple d’expérience33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> Figure 2 : Croissance des microbes vaginaux murins endogènes sur gélose sélective versus non sélective. Les lavages vaginaux de cinq souris C57Bl/6 femelles (1-5) ont été striés sur deux plaques de gélose NYC III différentes et incubés en anaérobiose. (A) La plaque de gauche ne contient pas d’antibiotiques et permet la croissance de bactéries anaérobies endogènes à partir du tractus vaginal murin. (B) La plaque de droite contient 1 mg/mL de streptomycine et sélectionne contre la croissance de bactéries endogènes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> Figure 3 : Récupération des UFC viables de G. vaginalis, P. bivia et F. nucleatum à partir de lavages vaginaux. (A) UFC de l’inoculum G. vaginalis JCP8151B-SmR, plaqué réplique en série de dilution sur gélose NYC III. (B-D) Récupération de (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 et (D) F. nucleatum26 viables à partir des lavages vaginaux d’animaux mono-infectés. Pour chaque graphique (B-D), les données sont combinées à partir de deux expériences indépendantes, avec 10-15 souris par expérience24,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> Figure 4 : Analyse plus approfondie de la colonisation bactérienne anaérobie dans un modèle murin d’inoculation vaginale. (A) Les titres de G. vaginalis dans les lavages vaginaux sont en corrélation avec les titres de G. vaginalis récupérés à partir d’homogénats de tissus vaginaux 24 h et 72 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, n = 10 chacune). Signification déterminée par le test de corrélation de rang de Spearman)24. (B) La co-infection par G. vaginalis entraîne une augmentation des titres de P. bivia dans le tissu de la corne utérine par rapport aux animaux mono-infectés par P. bivia 48 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, chacune avec 6 à 10 souris par groupe). Signification déterminée par le test U de Mann-Whitney, **p = 0,0017)25. (C) Le mutant F. nucleatum avec transporteur d’acide sialique perturbé (Ω SiaT) a diminué les titres dans les lavages vaginaux de souris mono-infectées par rapport à F. nucleatum de type sauvage 72 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, chacune avec 10 souris par groupe. Signification déterminée par le test U de Mann-Whitney, **p < 0,01)26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Exemples de méthodes utilisées pour différentes bactéries vaginales cultivées dans des conditions anaérobies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

Le protocole présente un modèle murin de colonisation vaginale avec des bactéries vaginales humaines en culture anaérobie. Nous nous concentrons sur Gardnerella vaginalis, tout en incluant des suggestions pour Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum. Ce protocole peut également être utilisé comme guide pour les inoculations vaginales et la récupération viable d’autres bactéries cultivées en anaérobiose.

Modèles de colonisation vaginale murine par des bactéries de culture anaérobie

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Cette méthode aidera les chercheurs à étudier la biologie et la physiopathologie des bactéries anaérobies qui vivent dans l’appareil reproducteur féminin et qui causent des infections dans celui-ci. Les modèles précédents d’inoculation vaginale murine se sont concentrés sur les bactéries cultivées et récupérées dans des conditions aérobies. Notre méthode enseigne sur l’inoculation et la récupération des bactéries obligatoirement anaérobies, qui nécessitent des stratégies supplémentaires pour minimiser l’exposition à l’oxygène.Selon leur degré de fastidieuseté, les nouvelles souches bactériennes utilisées dans ce modèle peuvent nécessiter des modifications à certaines étapes. Nous avons fourni des suggestions de modifications potentielles dans le premier tableau du manuscrit. Pour commencer, ajoutez 200 microlitres d’une culture bactérienne vieille de 16 heures à une cuvette de 1,5 millilitre avec 800 microlitres de média frais dans une chambre anaérobie.Ensuite, on a mesuré la densité optique, ou OD, de la culture diluée à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre, en utilisant une cuvette séparée avec uniquement des milieux comme blanc. Pour obtenir la valeur OD réelle de la culture, multipliez la lecture du spectrophotomètre par cinq, puis déterminez le volume d’inoculum requis pour l’expérience et calculez le volume de la culture bactérienne nécessaire pour atteindre la densité d’inoculum requise. Ensuite, pipeter le volume requis de culture bactérienne dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifuger à 16 000 fois G pendant une à trois minutes.Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille dans du PBS anaérobie pour obtenir le volume requis d’inoculum calculé précédemment. Pour déterminer le nombre d’unités formant colonies bactériennes dans l’inoculum préparé, utilisez d’abord 10 microlitres de suspension bactérienne pour effectuer plusieurs dilutions en série dans du PBS et utilisez une pipette multicanal pour repérer les dilutions d’inoculum sur plaque sur des plaques de gélose. Dans le même temps, préparez les tubes de lavage vaginal dans la chambre anaérobie en pipetant 70 microlitres de PBS anaérobie stérile dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre étiquetés avec des numéros de souris.Fermez bien les tubes et sortez-les de la chambre. Pour effectuer un lavage vaginal, placez d’abord une souris sur une cage qu’elle peut saisir avec ses pattes antérieures. Ensuite, saisissez doucement la partie médiane de la queue et soulevez-la de sorte que les quartiers postérieurs soient légèrement surélevés et que l’ouverture vaginale soit exposée.Après avoir prélevé 50 microlitres de PBS à partir du tube de lavage étiqueté, insérez doucement l’embout de la pipette de deux à trois millimètres dans la lumière vaginale pour le laver avec du PBS en le pipetant trois à quatre fois. Ensuite, transférez le matériau de lavage dans le tube de lavage d’origine avec les 20 microlitres restants de PBS inutilisé. Immédiatement après ce lavage vaginal, inoculez chaque souris en transférant par voie vaginale 20 microlitres de la suspension bactérienne ou du contrôle du véhicule.Pour les expériences de co-inoculation avec deux souches bactériennes différentes, inoculer séparément avec 10 microlitres de chaque suspension bactérienne, plutôt que de mélanger les souches au préalable. Pour éviter que le volume administré ne s’accumule immédiatement au niveau de l’introït vaginal, continuez à maintenir la partie postérieure de la souris pendant 10 à 20 secondes. Transférez la souris inoculée dans une nouvelle cage ou avec des compagnons de cage déjà inoculés, et répétez la procédure avec les autres souris.Après avoir inoculé toutes les souris, obtenir les unités formant colonie post-inoculum en plaquant des dilutions en série de l’inoculum dans la chambre anaérobie. Pour prélever des organes de souris, préparez des tubes de prélèvement d’organes de cinq millilitres dans la chambre anaérobie en ajoutant un millilitre de PBS anaérobie stérile à chaque tube pour les vagins et les cervices. Ajouter 750 millilitres de PBS aux tubes marqués pour les cornes utérines.Pour recueillir le lavage final au sacrifice, préparez une autre série de tubes de lavage vaginal comme démontré précédemment. De plus, pour le rinçage et la stérilisation des instruments de dissection, préparez un bécher de 50 millilitres d’eau désionisée et un bécher de 50 millilitres d’éthanol à 70 à 90%. Immédiatement avant ou après le sacrifice des souris, effectuez le lavage final comme démontré précédemment.Après le sacrifice, vaporisez l’abdomen et le dos d’une souris avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, utilisez des ciseaux stérilisés à l’éthanol et séchés pour ouvrir la cavité pelvienne abdominale de la souris avec des coupes verticales. Ensuite, utilisez la pince pour retirer la peau.Pour exposer l’appareil reproducteur, poussez doucement les intestins hors de la cavité corporelle vers le côté du champ ouvert et retirez la vessie de la souris pour accéder à la partie inférieure de l’appareil reproducteur. Après cela, coupez le centre de l’os pubien avec des ciseaux sans couper le vagin. Ensuite, utilisez deux paires de forceps pour saisir chaque côté du bassin et ouvrez le bassin latéralement pour exposer la partie inférieure du vagin en dessous.Saisissez doucement le col de l’utérus avec une pince et tirez-le vers le haut pour exposer le côlon. Après cela, utilisez de petits ciseaux pour libérer le vagin des tissus conjonctifs externes. Libérez soigneusement le vagin du côlon sans perforer le tractus intestinal.Lorsque le vagin est complètement libéré du côlon, utilisez des ciseaux pour flanquer le vagin au niveau de l’introïtus, puis coupez pour le retirer du corps de la souris. En maintenant une légère prise sur le col de l’utérus, tirez-le vers le haut pour rendre les cornes utérines plus visibles et coupez directement sous les ovaires sur les côtés droit et gauche pour libérer les cornes utérines. Ensuite, retirez l’appareil reproducteur du corps de la souris et placez-le dans une boîte de Petri stérile.Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, séparez les cornes utérines, le col de l’utérus et le vagin. Placez chaque tissu dans son tube de prélèvement étiqueté respectif. Pour homogénéiser les organes, préparez un homogénéisateur portatif dans une armoire de biosécurité.Tout d’abord, préparez un ensemble de trois tubes de 50 millilitres avec de l’eau désionisée, de l’éthanol à 70% et du PBS, respectivement, pour laver les lames de l’homogénéisateur après homogénéisation de chaque organe. Pour nettoyer l’homogénéisateur, plongez la lame dans le tube d’eau et allumez la machine à pleine vitesse pendant environ trois secondes. Ensuite, secouez la lame sur une serviette en papier pour éliminer l’excès d’eau.Rincer la lame successivement dans de l’éthanol à 70% et du PBS. Après le rinçage initial, abaissez la sonde homogénéisante au fond d’un tube avec des organes pour piéger le tissu en dessous. Ensuite, allumez l’homogénéisateur pour broyer le tissu et déplacez doucement la sonde de haut en bas environ cinq fois, en la maintenant immergée.Éteignez et retirez l’homogénéisateur et assurez-vous visuellement d’une perturbation complète des tissus. Après homogénéisation, recycler l’échantillon dans la chambre anaérobie et effectuer une dilution en série pour la récupération de l’UFC. En suivant ce protocole, la récupération des bactéries viables et le dénombrement des unités formant des colonies à partir des lavages vaginaux pourraient être effectués avec succès pour les souches bactériennes, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum.De plus, le nombre d’unités formant des colonies de Gardnerella vaginalis obtenues à partir de lavages vaginaux était corrélé à celles récupérées à partir des homogénats de tissus vaginaux. Cette méthode a également révélé que les titres de Prevotella bivia et les tissus utérins de souris étaient significativement plus élevés lors de la co-infection par Gardnerella vaginalis par rapport à la mono-infection à Prevotella. De plus, cette méthode pourrait être utilisée avec succès pour comparer la persistance vaginale d’une souche mutante de Fusobacterium nucleatum à celle du type sauvage 24 et 72 heures après l’inoculation.Pour étudier la réponse immunitaire à l’inoculation bactérienne vaginale, des tests de cytokines peuvent être effectués sur les homogénats tissulaires. Alternativement, les tissus pourraient être conservés pour un examen histologique afin d’évaluer les signes d’inflammation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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