Name: models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

אנו מודים ללין פוסטר על הסיוע הטכני במהלך הפיתוח של מודלים אלה. אנו מעריכים קרנות סטארט-אפ מהמחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ומהמרכז לחקר מחלות זיהומיות לנשים (ל-AL), ואת March of Dimes (פרס בזיל אוקונור ל-AL) שעזרו לתמוך בניסויים בשלבים מוקדמים. המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (R01 AI114635) תמך גם הוא בפיתוח מודלים אלה.

<ol>
	<li>Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+vaginal+flora,+H2O2-producing+lactobacilli,+and+bacterial+vaginosis+in+pregnant+women.">The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women.</a> Clinical Infectious Diseases. 16, 273-281 (1993).</li><li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women.">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).</li><li>Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriology+of+the+vagina.">Bacteriology of the vagina.</a> Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).</li><li>van de Wijgert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaginal+microbiome+and+sexually+transmitted+infections+are+interlinked:+Consequences+for+treatment+and+prevention.">The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention.</a> PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis:+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria.">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).</li><li>Shipitsyna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+vaginal+microbiota+in+women+of+reproductive+age-sensitive+and+specific+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis+is+possible.">Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible.</a> PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).</li><li>Brotman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+assessed+by+gram+stain+and+diminished+colonization+resistance+to+incident+gonococcal,+chlamydial,+and+trichomonal+genital+infection.">Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).</li><li>Peipert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis,+race,+and+sexually+transmitted+infections:+does+race+modify+the+association.">Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association.</a> Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).</li><li>Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+is+a+strong+predictor+of+Neisseria+gonorrhoeae+and+Chlamydia+trachomatis+infection.">Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).</li><li>Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+abnormal+vaginal+flora,+proinflammatory+cytokines+and+idiopathic+infertility+in+women+undergoing+IVF.">Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF.</a> The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).</li><li>Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+bacterial+vaginosis+on+conception+and+miscarriage+in+the+first+trimester:+cohort+study.">Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study.</a> BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).</li><li>Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+and+vaginal+microorganisms+in+idiopathic+premature+labor+and+association+with+pregnancy+outcome.">Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).</li><li>DiGiulio, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+prevalence,+diversity+and+abundance+in+amniotic+fluid+during+preterm+labor:+a+molecular+and+culture-based+investigation.">Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation.</a> PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).</li><li>Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+in+a+cohort+of+Danish+pregnant+women:+Prevalence+and+relationship+with+preterm+delivery,+low+birthweight+and+perinatal+infections.">Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections.</a> British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).</li><li>&#193;d&#225;m, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-+and+PCR-based+detection+of+BV+associated+microbiological+profile+of+the+removed+IUDs+and+correlation+with+the+time+period+of+IUD+in+place+and+the+presence+of+the+symptoms+of+genital+tract+infection.">Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection.</a> Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).</li><li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cervico-vaginal+microbiota+in+women+developing+persistent+high-risk+Human+Papillomavirus+infection.">Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).</li><li>Bullman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fusobacterium+persistence+and+antibiotic+response+in+colorectal+cancer.">Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer.</a> Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).</li><li>Brennan, C. A., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota,+inflammation,+and+colorectal+cancer.">Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer.</a> Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).</li><li>Hill, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+birth:+associations+with+genital+and+possibly+oral+microflora.">Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora.</a> Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).</li><li>Hitti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+indicators+of+amniotic+fluid+infection+in+preterm+labor.">Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).</li><li>DiGiulio, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+microbes+in+amniotic+fluid.">Diversity of microbes in amniotic fluid.</a> Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).</li><li>Patras, K. A., Doran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+Group+B+Streptococcus+vaginal+colonization.">A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).</li><li>Jerse, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-treated+female+mice+as+surrogate+hosts+for+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections.">Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).</li><li>Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+bacterial+vaginosis+in+a+murine+model+of+vaginal+infection+with+Gardnerella+vaginalis.">Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis.</a> PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).</li><li>Gilbert, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardnerella+vaginalis+and+Prevotella+bivia+trigger+distinct+and+overlapping+phenotypes+in+a+mouse+model+of+bacterial+vaginosis.">Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).</li><li>Agarwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+cross-feeding+supports+mutualism+between+Fusobacterium+and+the+vaginal+microbiota.">Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota.</a> PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).</li><li>Liehr, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+estradiol+a+genotoxic+mutagenic+carcinogen.">Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).</li><li>Yager, J. D., Davidson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+carcinogenesis+in+breast+cancer.">Estrogen carcinogenesis in breast cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation,+foraging,+and+depletion+of+mucus+sialoglycans+by+the+vagina-adapted+Actinobacterium+Gardnerella+vaginalis.">Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).</li><li>Robinson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+15+Gardnerella+vaginalis+strains+isolated+from+the+vaginas+of+women+with+and+without+bacterial+vaginosis.">Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis.</a> Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).</li><li>Adapted from &amp;#34;mouse posterior turn&amp;#34; by BioRender.com. BioRender.com Available from: <a target="_blank" href="https://app.biorender.com/biorender-templates">https://app.biorender.com/biorender-templates</a> (2022)</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).</li><li>Verollet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+step+towards+efficient+sample+preparation+with+bead-beating.">A major step towards efficient sample preparation with bead-beating.</a> Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

הדרך המשמעותית ביותר שבה שונה המודל המתואר כאן ממודלים של חיסון נרתיקי שפורסמו בעבר היא השימוש בחיידקים בתרבית אנאירובית, הדורשים שיקולים מיוחדים להכנת חיסון בר קיימא ולהתאוששות חיידקים מהעכברים. שלבים ספציפיים בפרוטוקול לעיל עשויים להשתנות מעט בהתאם למין/זן החיידקים שבהם נעשה שימוש, כפי שמוצע בקובץ משלים 1. בנוסף, כתב יד זה מתאר שיטה פרוצדורלית חדשה למתן חיידקים ושטיפות נרתיקיות, הדורשת פחות ניסיון מצד החוקר ופחות ריסון מצד העכברים. אם הנסיין אינו חש בנוח עם צורת האיפוק המתוארת בשלב 3.2. ושלב 3.3., ניתן במקום זאת לקשקש את העכברים כפי שתואר קודם לכן34 עם או בלי הרדמה בהתאם לתכנון הניסוי ולהנחיות IACUC המוסדיות.
אזהרה חשובה לשימוש בחיידקים בתרבית אנאירובית במודלים של מורין היא שצעדים מסוימים (כמו כל אלה המערבים בעלי חיים חיים) חייבים להיעשות מחוץ לתא האנאירובי. לכן, השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם אלה שבהם החיידקים המעניינים ייחשפו לסביבה אירובית, כגון במהלך חיסון העכברים. השימוש בכל אנאירוב חדש במודל זה ידרוש חקירה ראשונית של יכולתו לשמור על כדאיותו בעת חשיפה לחמצן (כגון השוואה בין CFUs לפני ואחרי החיסון כמתואר בשלב 2.5 ושלב 3.4). בהתאם למידת החמצן והרגישות PBS של האורגניזם, יש לשקול שיטות שונות להכנת חיסונים (קובץ משלים 1, שלב 2.4.5). עבור חיסונים באמצעות G. vaginalis JCP8151B, מצאנו כי ניתן להכין צינורית אחת של חיסון ב- PBS ולהשתמש בה כדי להדביק את כל העכברים. אם נעשה שימוש בחיידק אנאירובי אחר הרגיש יותר לחמצן, ניתן במקום זאת להכין את החיסון בצינורות נפרדים לכל עכבר, כך שלא יהיה צורך בפתיחה/סגירה חוזרת של הצינור. כמו כן, אם זן החיידקים המעניין הוא יותר קפדני / פחות מסוגל לשרוד PBS מאשר G. vaginalis, החיסון יכול להיות מוכן במקום זאת במדיה תרבית. אם המדיום המשמש מכיל חומרים מחזרים, כגון מדיום ה- CDC anaerobe המשמש לתרבית Prevotella bivia (קובץ משלים 1, שלב 2.1. ושלב 2.2.), אז לחיידקים תהיה גם הגנה מוגברת מפני חשיפה לחמצן.
ניתן לשקול גם שיטות חלופיות להומוגניזציה, כגון מכות חרוזים22,35, אשר נעשה עם מכסה הצינור סגור ועשוי, לכן, להכניס פחות חמצן מאשר הומוגנייזר כף יד. בנוסף, אורגניזמים רגישים יותר לחמצן עשויים לדרוש זמן שיווי משקל ארוך יותר עבור מדיה. מחוון חמצן כגון resazurin יכול לשמש כדי לבדוק כי תנאים אנאירוביים הגיעו (שלב 2.1). שיטות חלופיות כגון צנצנות אנאירוביות עשויות להשפיע על התוצאות ויש לבדוק את כדאיות החיידקים לפני השימוש.
הרגישות לחמצן והקפדנות של אורגניזם הניסוי עשויות גם לשחק תפקיד בהתאוששות מוצלחת של חיידקים בני קיימא מהעכבר במהלך שטיפה/הומוגניזציה (קובץ משלים 1, שלב 3.2 ושלב 5.1). עבור אורגניזמים רגישים מאוד, הזמן בין לקיחת השטיפה לבין הציפוי עלול להוביל לאובדן הכדאיות ולגרום לאומדן נמוך באופן מלאכותי של התיישבות חיידקים בנרתיק. כדי למתן השפעה זו, ניתן לדלל מיד שטיפות שנאספו למדיה תרבית אנאירובית טרייה (עם חומר מפחית). באופן דומה, הומוגניזציה של איברים יכולה להיעשות במדיה תרבית טרייה ולא PBS כדי להגביר את הכדאיות החיידקית, וניתן לעשות זאת גם בתא האנאירובי עצמו כדי למזער את החשיפה לחמצן.
בהתאם למטרה של ניסוי נתון, הנסיין חייב לשים לב לקבוצות ביקורת. כדי לבחון השערות, מדדים בסיסיים של עכברי ביקורת לא נגועים שמטופלים בדחיקה ברכב בלבד יסייעו לקבוע אם יש אינדוקציה של כימוקינים/ציטוקינים או תוצאות ספציפיות אחרות של זיהום. רכב הבקרה המשמש חייב להיות זהה לרכב המשמש לחיסון, כך שאם החיידקים מחוסנים באמצעי תרבית, אזי יש להשתמש באמצעי תרבית לא מחוסנים כבקרה (קובץ משלים 1, שלב 2.4.5).
השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות גם על חיידקים פקולטטיביים המסוגלים לגדול באופן אנאירובי אך נחקרים באופן מסורתי באמצעות תנאי תרבית אירובית (כגון Escherichia coli או סטרפטוקוקוס מקבוצה B). זה יכול להיות רלוונטי במיוחד עבור זיהומים על ידי אורגניזמים אלה באתרי הגוף כי הם האמינו להכיל רמות נמוכות של חמצן, כגון צוואר הרחם. ייתכן שאורגניזם פקולטטיבי מדביק בהצלחה רבה יותר אתרים עם פחות חמצן כאשר החיסון מוכן באופן אנאירובי בהשוואה לאירובי. בניסוי כזה, התאוששות של חיידקים קיימא לספירת CFU עשויה שלא לדרוש תנאים אנאירוביים.

אצל יונקים, הנרתיק הוא ביתם של קונסורציום של מיני חיידקים. המיקרוביום של הנרתיק האנושי ייחודי בקרב יונקים בשפע של בני הסוג לקטובצילוס וב-pH נמוך בנרתיק (3.8-4.5)1,2,3,4. הפרעה בדומיננטיות זו של לקטובצילוס נקשרת למגוון תוצאות בריאותיות שליליות.
בוגינוזיס חיידקי (BV) יש פחות לקטובצילוס ושפע מוגבר של חיידקים אנאירוביים מגוונים, כגון Gardnerella vaginalis ו- Prevotella bivia 5,6. נשים עם כ"ד נמצאות בסיכון מוגבר לזיהומים המועברים במגע מיני 7,8,9, פוריות 10, הפסדי הריון 11, לידה מוקדמת 12,13,14, זיהומים תוך רחמיים 15, זיהומים בצוואר הרחם 16 וסרטן16,17,18 . BV קשורה גם לסבירות גבוהה יותר של התיישבות נרתיקית על ידי חיידקים פתוגניים פוטנציאליים, כגון Fusobacterium nucleatum 1,19,20, מבודד נפוץ מזיהומי מי שפיר 21.
בשל חשיבותם של חיידקים אנאירוביים בבריאות הנרתיק האנושי, יש צורך במודלים של בעלי חיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הביולוגיה והפתוגנזה של אורגניזמים אלה. במאמר זה, אנו מתארים שיטות לחיסון נרתיקי והתאוששות בת קיימא של Gardnerella vaginalis בעכברים אסטרוגניים ומציעים אסטרטגיות נוספות עבור Prevotella bivia ו - Fusobacterium nucleatum. מודלים אחרים של התיישבות נרתיקית מורין תוארו בעבר, אך אלה התמקדו בחיסון והחלמה של חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים כגון סטרפטוקוקוס22 מקבוצה B ו- Neisseria gonorrhoeae23 שגודלו בתרבית אירובית. חיסון והתאוששות של אנאירובים מחייבים ניתן להשיג בהצלחה עם אסטרטגיות ניסוי מתאימות. אנו דנים בגישות להתאוששות בת-קיימא של מספר טקסי חיידקים ומציעים הערכה אמפירית של התנאים לכדאיות של מינים/זנים נוספים בעלי עניין.
השיטה הקלאסית להערכת התיישבות על ידי חיידקים חיים היא התאוששות של יחידות יוצרות מושבה (CFU). בעכברים שגודלו באופן קונבנציונלי עם מיקרוביוטה אנדוגנית משלהם, זה דורש התאוששות על מצע אגר שבוחר נגד חברי המיקרוביוטה הנרתיקית האנדוגנית תוך מתן אפשרות לזן החיידקים המחוסן לגדול. כאן, אנו משתמשים במבודד עמיד לסטרפטומיצין של G. vaginalis24 שניתן לשחזר באופן סלקטיבי על מדיום אגר המכיל סטרפטומיצין. כדי להבטיח שהמדיום סלקטיבי מספיק, ולהפך, שחיידקים עמידים לסטרפטומיצין אינם נמצאים במיקרוביום האנדוגני, יש לצפות שטיפות נרתיקיות שנאספו ממש לפני החיסון על אגר סלקטיבי (המכיל סטרפטומיצין).
השיטה הטובה ביותר להכנת חיסונים עשויה להשתנות בין מינים וזנים של חיידקים. לפני תחילת הניסויים בעכברים, יש לבצע עבודה מקדימה כדי לקבוע תנאים מועדפים למדיום התרבית, לנקודת הקצה של הצמיחה ולהכנת החיסון, כמו גם את הרגישות לחמצן ואת הכדאיות ב- PBS. במקרה של חיידקים רגישים יותר לחמצן, ניתן לשקול תכשירים חלופיים של החיסון (למשל, במדיום תרבית אנאירובית עם קבוצת ביקורת מתאימה ברכב)25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1631</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m, 50 mL Steriflip vacuum filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;SCGP00525</td>
			<td>sterile filtering sesame oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190-proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>&#160;V1105M</td>
			<td>dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT21040CM</td>
			<td>vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G &#215; 5/8 -in needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td>7200000</td>
			<td>Growth of anaerobic bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0140074</td>
			<td>G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118170</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbia broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0944170</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>DSB500</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;11008-13</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogenizer</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>3305500</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>SHS500</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)</td>
			<td>Matheson</td>
			<td></td>
			<td>Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>mouse anaethesia at sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1626</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>for making media and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-200 filter tips</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>&#160;P-1237-200</td>
			<td>vaginal lavages and bacterial inoculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic digest of casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70169</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone #3</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;14084-08</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;ICN15662191</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge surgical carbon steel razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to agar media to make selective plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin slip tip 1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitaim K3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95271</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria

נרתיק היונקים יכול להיות מאוכלס על ידי טקסי חיידקים רבים. מיקרוביום הנרתיק האנושי נשלט לעתים קרובות על ידי מיני לקטובצילוס , אך אחת מכל ארבע נשים חווה וגינוזיס חיידקי, שבו רמה נמוכה של לקטובצילוס מלווה בצמיחת יתר של חיידקים אנאירוביים מגוונים. מצב זה נקשר לסיבוכים בריאותיים רבים, כולל סיכונים לבריאות הרבייה והמין. בעוד שישנן עדויות הולכות וגדלות המראות את האופי המורכב של אינטראקציות מיקרוביאליות בבריאות הנרתיק האנושי, התפקידים האישיים של חיידקים אנאירוביים שונים אלה אינם מובנים במלואם. זה מסובך בגלל היעדר מודלים מתאימים לחקר חיידקים וגינליים שגדלו אנאירובית. מודלים של עכברים מאפשרים לנו לחקור את הביולוגיה והארסיות של אורגניזמים אלה in vivo. מודלים עכבריים אחרים של חיסון חיידקי בנרתיק תוארו בעבר. במאמר זה אנו מתארים שיטות לחיסון חיידקים שגודלו באופן אנאירובי והחלמתם המעשית בעכברי C57Bl/6 שגודלו באופן קונבנציונלי. מתוארת גם שיטה פרוצדורלית חדשה, פחות מלחיצה, לחיסון נרתיקי ושטיפת הנרתיק. חיסון והתאוששות קיימא של Gardnerella מתוארים בפירוט, ואסטרטגיות עבור anaerobes נוספים כגון Prevotella bivia ו Fusobacterium nucleatum נדונים.

ייצוג סכמטי של ניסוי לדוגמה מראה חלק מהדרכים שבהן ניתן לבצע את הפרוטוקול המתואר (איור 1).
חלק מבעלי החיים יישאו חיידקים אנדוגניים במיקרוביום הנרתיק שלהם שיגדלו על מדיה לא סלקטיבית. השיטות המתוארות כאן מסתמכות על מבודדים עמידים לסטרפטומיצין של זני החיידקים הנחקרים, יחד עם מדיה סלקטיבית המכילה סטרפטומיצין, כדי לבחור נגד חיידקים אנדוגניים (איור 2A,B). עמידות לסטרפטומיצין עלולה להתפתח באופן ספונטני, ולכן בדיקת עכברים לפני ההדבקה (יום 0 לשטיפה) יכולה לעזור לקבוע אם זו עלולה להיות בעיה.
התאוששות של חיידקים קיימא משטיפות בנרתיק מושגת על ידי דילול סדרתי וציפוי על מצע אגר. צלחת פטרי סטנדרטית יכולה להכיל עד 6 x 6 מערך של 5 μL כתמים, מה שמאפשר ספירה של טיטרים חיידקיים משישה כתמים משוכפלים על פני שישה סדרי גודל עבור כל דגימה אם משתמשים בדילול סדרתי פי 10 (איור 3A). השיטה הזו יכולה לשמש לספירת טיטרים של חיידקים, החל מגארדנרלה ועד פרבוטלה ופוסובקטריום (איור 3B-D).
יחד, שיטות אלה מאפשרות לבחון השערות ולתת פרשנויות לגבי נשאות/זיהום חיידקי במערכת הרבייה הנשית. לדוגמה, השוואה בין טיטרים של גרדנרלה בתרחיצי נרתיק והומוגנאטים של רקמת הנרתיק הדגימה התאמה בין השיטות האלה (איור 4A). באופן דומה, במודל של חיסון משותף בנרתיק, טיטרים של Prevotella ברקמת הרחם היו גבוהים משמעותית (בערך פי 20) במהלך זיהום משותף של Gardnerella בהשוואה לזיהום מונו של Prevotella (איור 4B). לבסוף, ניתן להשוות זני חיידקים פראיים לעומת מוטנטיים במודלים אלה כדי לקבוע את התפקידים שממלאים גנים ספציפיים ותוצריהם בתהליכי התיישבות/זיהום בדרכי הרבייה. לדוגמה, זן מוטנטי של פוסובקטריום חסר יכולת להעביר ולצרוך את החומצה הסיאלית הפחמימה הוביל לרמות נמוכות יותר של נשאות עד 3 ימים לאחר החיסון (איור 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של ניסוי לדוגמה33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> איור 2: גדילה של חיידקי נרתיק מורין אנדוגניים על אגר סלקטיבי לעומת לא סלקטיבי. שטיפות נרתיק מחמש נקבות C57Bl/6 עכברים (1-5) פוזרו על שתי לוחיות אגר NYC III שונות והודגרו באופן אנאירובי. (A) הלוחית משמאל אינה מכילה אנטיביוטיקה ומאפשרת צמיחה של חיידקים אנאירוביים אנדוגניים מדרכי הנרתיק המורין. (B) הצלחת מימין מכילה סטרפטומיצין במינון 1 מ"ג/מ"ל ובוררת כנגד גדילה של חיידקים אנדוגניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> איור 3: התאוששות של G. vaginalis, P. bivia ו-F. nucleatum CFUs מתרחיצי הנרתיק. (A) CFUs של G. vaginalis JCP8151B-SmR inoculum, מצופים העתק כסדרת דילול על אגר NYC III. (ב-ד) החלמה של קיימא (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25, ו- (D) F. nucleatum26 משטיפות הנרתיק של בעלי חיים נגועים מונו. עבור כל גרף (B-D), הנתונים משולבים משני ניסויים בלתי תלויים, עם 10-15 עכברים לכל ניסוי24,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> איור 4: ניתוח נוסף של התיישבות חיידקים אנאירובית במודל חיסון נרתיקי מוריני. (A) G. vaginalis titers בשטיפות נרתיקיות מתואמות עם G. vaginalis titers שנמצאו מהומוגנאטים ברקמת הנרתיק 24 שעות ו-72 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים בלתי תלויים, n = 10 כל אחד. מובהקות שנקבעה על פי מבחן מתאם הדרגות של ספירמן)24. (B) זיהום משותף עם G. vaginalis מוביל לעלייה בטיטרים של P. bivia ברקמת קרן הרחם בהשוואה לבעלי חיים נגועים ב- P. bivia mono infection 48 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים עצמאיים, כל אחד עם 6-10 עכברים לקבוצה. המשמעות נקבעה על ידי מבחן U-Mann-Whitney, **p = 0.0017)25. (C) F. nucleatum mutant with disrupted sialic acid transporter (Ω SiaT) הביא לירידה בטיטרים בשטיפות נרתיקיות של עכברים חד-נגועים בהשוואה ל-F. nucleatum wild-type 72 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים עצמאיים, כל אחד עם 10 עכברים לקבוצה. המשמעות נקבעה על ידי מבחן U-Mann-Whitney, **p < 0.01)26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: דוגמאות לשיטות המשמשות חיידקים נרתיקיים שונים הגדלים בתנאים אנאירוביים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

הפרוטוקול מציג מודל עכברי של התיישבות נרתיקית עם חיידקי נרתיק אנושיים בתרבית אנאירובית. אנו מתמקדים ב- Gardnerella vaginalis, תוך הכללת הצעות עבור Prevotella bivia ו - Fusobacterium nucleatum. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כמדריך לחיסונים וגינליים והתאוששות בת קיימא של חיידקים אחרים שגדלו באנאירוב.

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

שיטה זו תסייע לחוקרים לחקור את הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של חיידקים אנאירוביים החיים וגורמים לזיהומים במערכת הרבייה הנשית. מודלים קודמים של חיסון וגינלי התמקדו בחיידקים שגדלו והתאוששו בתנאים אירוביים. השיטה שלנו מדריכה על חיסון והחלמה של חיידקים אנאירוביים אלכסוניים, הדורשים אסטרטגיות נוספות כדי למזער את החשיפה לחמצן.בהתאם למידת ההקפדה שלהם, זני חיידקים חדשים המשמשים במודל זה עשויים לדרוש שינויים בשלבים מסוימים. סיפקנו הצעות לשינויים אפשריים בטבלה הראשונה של כתב היד. ראשית, הוסף 200 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בת 16 שעות לקובט 1.5 מיליליטר עם 800 מיקרוליטר של מדיה טרייה בתא אנאירובי.לאחר מכן מדד את הצפיפות האופטית, או OD, של התרבית המדוללת ב -600 ננומטר בספקטרופוטומטר, באמצעות קובטה נפרדת עם מדיה בלבד כריק. כדי לקבל את ערך ה-OD האמיתי של התרבית, הכפילו את קריאת הספקטרופוטומטר בחמש, ואז קבעו את נפח החיסון הדרוש לניסוי וחשבו את נפח תרבית החיידקים הדרוש להשגת צפיפות החיסון הנדרשת. לאחר מכן, פיפטה את הנפח הנדרש של תרבית חיידקים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G למשך דקה עד שלוש דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-PBS אנאירובי כדי להשיג את נפח החיסון הנדרש שחושב לפני. כדי לקבוע את מספר היחידות יוצרות מושבת חיידקים באינוקולום המוכן, ראשית, השתמש ב -10 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים כדי לבצע מספר דילולים סדרתיים ב- PBS והשתמש בפיפטה רב ערוצית כדי לזהות דילול צלחות אינוקולום על צלחות אגר. במקביל, הכינו את צינורות שטיפת הנרתיק בתא האנאירובי על ידי החדרת 70 מיקרוליטר של PBS אנאירובי סטרילי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר המסומנים במספרי עכברים.סגור את הצינורות בחוזקה והוציאו אותם מהחדר. לביצוע שטיפה נרתיקית, ראשית, הניחו עכבר על גבי כלוב שהוא יכול לתפוס בכפותיו הקדמיות. לאחר מכן, אחזו בעדינות בחלק האמצעי של הזנב והרימו אותו כך שהרבעים האחוריים מוגבהים מעט ופתח הנרתיק חשוף.לאחר שאיבת 50 מיקרוליטר של PBS מצינור השטיפה המסומן, הכנס בעדינות את קצה הפיפטה שניים עד שלושה מילימטרים לתוך לומן הנרתיק כדי לשטוף אותו עם PBS על ידי פיפטינג פנימה והחוצה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן, העבירו את חומר הכביסה בחזרה לצינור הכביסה המקורי עם 20 המיקרוליטרים הנותרים של PBS שאינו בשימוש. מיד לאחר שטיפת נרתיק זו, לחסן כל עכבר על ידי העברה נרתיקית של 20 מיקרוליטר של המתלה החיידקי או בקרת הרכב.לניסויי חיסון משותף עם שני זני חיידקים שונים, יש לחסן בנפרד עם 10 מיקרוליטר של כל תרחיף חיידקי, במקום לערבב את הזנים מראש. כדי למנוע הצטברות מיידית של הנפח הניתן באינטרואיטוס הנרתיק, המשך להחזיק את החלק האחורי של העכבר למשך 10 עד 20 שניות. העבירו את העכבר המחוסן לכלוב חדש או עם חברים לכלוב שכבר חוסנו, וחזרו על התהליך עם העכברים האחרים.לאחר חיסון כל העכברים, קבל את היחידות יוצרות המושבה שלאחר החיסון על ידי ציפוי דילולים סדרתיים של האינוקולום בתא האנאירובי. כדי לאסוף איברי עכבר, הכינו צינורות איסוף איברים של חמישה מיליליטר בתא האנאירובי על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS אנאירובי סטרילי לכל צינור לנרתיק וצוואר הרחם. הוסף 750 מיליליטר של PBS לצינורות המסומנים עבור קרני הרחם.לאיסוף השטיפה האחרונה בעת הקרבת הקורבן, הכינו סט נוסף של צינורות שטיפת נרתיק כפי שהודגם קודם לכן. כמו כן, עבור שטיפה ועיקור מכשירי דיסקציה, להכין 50 מיליליטר של מים deionized ו 50 מיליליטר של 70 עד 90% אתנול. מיד לפני או אחרי הקרבת העכברים, בצעו את השטיפה הסופית כפי שהודגם קודם לכן.לאחר ההקרבה, רססו את בטנו וגבו של עכבר באתנול 70%. לאחר מכן, השתמש במספריים מעוקרים ומיובשים אתנול כדי לפתוח את חלל האגן של העכבר עם חתכים אנכיים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור לאחור.כדי לחשוף את מערכת הרבייה, לדחוף בעדינות את המעיים מתוך חלל הגוף לצד של השדה הפתוח ולהסיר את שלפוחית השתן מן העכבר כדי לגשת לחלק התחתון של מערכת הרבייה. לאחר מכן, קליפ את מרכז עצם הערווה עם מספריים מבלי לחתוך את הנרתיק. לאחר מכן, השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי לתפוס כל צד של האגן ולמשוך את האגן פתוח לרוחב כדי לחשוף את החלק התחתון של הנרתיק מתחת.תפסו בעדינות את צוואר הרחם במלקחיים ומשכו אותו למעלה כדי לחשוף את המעי הגס. לאחר מכן, השתמש מספריים קטנים כדי לשחרר את הנרתיק מרקמות החיבור החיצוניות. בזהירות לשחרר את הנרתיק מן המעי הגס מבלי לנקב את מערכת העיכול.כאשר הנרתיק משתחרר במלואו מהמעי הגס, השתמש במספריים כדי לאגף את הנרתיק באינטרואיטוס ולאחר מכן לחתוך כדי להסיר אותו מגוף העכבר. שמירה על אחיזה עדינה על צוואר הרחם, למשוך אותו למעלה כדי להפוך את קרני הרחם גלוי יותר לחתוך ישירות מתחת לשחלות בצד ימין ושמאל כדי לשחרר את קרני הרחם. לאחר מכן, הסר את מערכת הרבייה מגוף העכבר והניחו אותו בצלחת פטרי סטרילית.לאחר מכן, באמצעות סכין גילוח, להפריד את קרני הרחם, צוואר הרחם, הנרתיק. הניחו כל רקמה בצינור האיסוף המסומן המתאים לה. עבור הומוגניזציה של האיברים, לעשות homogenizer כף יד מוכן בארון בטיחות ביולוגית.ראשית, להכין קבוצה של שלושה צינורות 50 מיליליטר עם מים deionized, 70% אתנול, ו PBS, בהתאמה, לשטוף את להבי homogenizer לאחר הומוגניזציה של כל איבר. כדי לנקות את ההומוגנייזר, טבלו את הלהב בצינור המים והפעילו את המכונה במלוא המהירות למשך כשלוש שניות. לאחר מכן, נערו את הלהב על מגבת נייר כדי להסיר עודפי מים.יש לשטוף את הלהב ברצף ב-70% אתנול ו-PBS. לאחר השטיפה הראשונית, הורידו את בדיקת ההומוגנייזר לתחתית צינור עם איברים כדי ללכוד את הרקמה מתחת. לאחר מכן, הפעל את ההומוגנייזר כדי לטחון את הרקמה והזז בעדינות את הבדיקה למעלה ולמטה כחמש פעמים, תוך שמירה על שקוע.כבה והסר את ההומוגנייזר והבטח חזותית הפרעה מלאה לרקמות. לאחר הומוגניזציה, מחזור הדגימה בחזרה לתוך התא האנאירובי ולבצע דילול סדרתי להתאוששות CFU. בעקבות פרוטוקול זה, התאוששות של חיידקים בני קיימא וספירה של יחידות יוצרות מושבה מתרחיצי הנרתיק יכולה להיעשות בהצלחה עבור זני החיידקים, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, ו- Fusobacterium nucleatum.יתר על כן, מספר היחידות יוצרות מושבת הנרתיק של גרדנרלה שהתקבלו משטיפות נרתיקיות היו בקורלציה עם אלה שנמצאו מההומוגנאטים של רקמת הנרתיק. שיטה זו גילתה גם כי הטיטרים של Prevotella bivia ורקמות הרחם של העכבר היו גבוהים משמעותית במהלך זיהום משותף עם Gardnerella vaginalis לעומת Prevotella mono-infection. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש בהצלחה כדי להשוות את ההתמדה בנרתיק של זן Fusobacterium nucleatum מוטנטי עם זה של סוג פראי 24 ו 72 שעות לאחר החיסון.כדי לחקור את התגובה החיסונית לחיסון חיידקי בנרתיק, ניתן לבצע בדיקות ציטוקינים על הומוגנאטים ברקמות. לחלופין, ניתן לשמור רקמות לבדיקה היסטולוגית כדי להעריך סימנים של דלקת.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...