Name: models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

Bu modellerin geliştirilmesi sırasında teknik yardım için Lynne Foster'a teşekkür ederiz. Moleküler Mikrobiyoloji Bölümü ve Kadın Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Merkezi'nden (AL'ye) ve erken aşamadaki deneyleri desteklemeye yardımcı olan March of Dimes'ten (AL'ye Basil O'Connor ödülü) gelen başlangıç fonlarını takdir ediyoruz. Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (R01 AI114635) de bu modellerin geliştirilmesini destekledi.

Tüm hayvan deneyleri, kurumsal kılavuzlara ve California San Diego Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (UCSD, Protokol Numarası: S20057, 2020'den itibaren) ve bundan önce Washington Üniversitesi, St. Louis'de (Protokol 20110149, 2020'ye kadar) uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür.
NOT: Aşağıdaki protokol, aşılama sırasında 6-11 hafta yaşları arasında geleneksel olarak yetiştirilmiş dişi C57Bl / fareleri kullanır. Lütfen satıcı bilgilerini ve daha önce atıfta bulunulan ilgili çalışmada kullanılan belirli yaş aralıklarını dikkate alın.
1. β-estradiol 17-valeratın hazırlanması ve uygulanması
NOT: β-östradiol 17-valerat bir kanserojen ve deri yoluyla emilebilen bir üreme toksinidir27,28. Toz ve sıvı çözeltinin işlenmesi sırasında uygun KKD kullanın. Aynı zamanda bir su toksini29; uygun şekilde kapatılmış ve etiketlenmiş bir kaba uygun şekilde atın.
<ol><li>Filtre, 50 mL konik tüp vakum filtre sistemi kullanarak 0,22 μm filtre ile 50 mL'ye kadar susam yağını sterilize eder. Steriliteyi korumak için sadece bir biyogüvenlik kabininde açın.</li>
	<li>Deney için gereken β-östradiol valerat çözeltisinin hacmini hesaplayın: fare başına 200 μL artı şırınga doldurma sırasında numune kaybını hesaba katmak için ekstra 2-3 mL (örneğin; 10 farelik bir deney toplamda 4 mL gerektirir). 5 mg / mL'lik bir çözelti yapmak için gereken β-östradiol valerat miktarını hesaplayın ve doğrudan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte tartın.</li>
	<li>14 mL tüpü sıkıca kapatın ve tozdaki kümeleri parçalamak için vorteks yapın (bu, β-estradiol valeratın daha hızlı çözünmesini sağlayacaktır). 14 mL tüpe steril filtrelenmiş susam yağı ekleyin, böylece β-estradiol valeratın son konsantrasyonu 5 mg / mL olur.</li>
	<li>Sıkıca kapatılmış 14 mL tüpü, katı toz tamamen çözünene kadar 37 ° C'de 30-40 dakika boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin. Farelere enjeksiyondan önce çözeltinin homojenliğini görsel olarak onaylayın. 37 °C'de inkübasyon, susam yağının viskozitesini azaltarak enjekte edilmesini kolaylaştırır.</li>
	<li>β-estradiol valerat çözeltisini 1 mL'lik bir şırıngaya (iğnesiz) hazırlayın. Bunu kabarcıklar sokmadan yapmak için, önce çözeltinin bir kısmını çekin, ardından şırınganın ucunu susam yağında tutarken yavaşça dışarı atın. Çözeltiyi tekrar yavaşça hazırlayın, 100 μL işaretini biraz geçin.</li>
	<li>Şırınganın üzerine iğne içinde 25 G x 5/8 yerleştirin. Daha sonra, susam yağı çözeltisini iğne ucundan çıkmaya başlayana kadar yavaşça dışarı atarak iğneyi hazırlayın. Şırınga 100 μL işaretine gelene kadar çözeltiyi dışarı atın. Fare başına bir şırınga hazırlayın.</li>
	<li>β-estradiol 17-valeratı aşılamadan önce 48 saat veya 72 saatte intraperitoneal enjeksiyonla uygulayın. Her fareye, dahaönce açıklandığı gibi 5 mg / mL β-estradiol valerat çözeltisinin (0.5 mg β-estradiol valerat / fare) 100 μL'sini enjekte edin. Kalan çözeltiyi bir sonraki enjeksiyona kadar 72 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>β-estradiol valerat çözeltisini, farelerin vajinal aşılamasından hemen önce, aşılama gününde tekrar uygulayın. Çözeltiyi 4 °C'den çıkarın ve susam yağının ısınmasına ve daha az viskoz hale gelmesine izin vermek için enjeksiyondan önce 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir rotatöre yerleştirin. Adım 1.7'de açıklandığı gibi enjeksiyonlara devam edin.</li>
</ol>2. İnokulum hazırlanması
NOT: Bu bölüm, anaerobik olarak yetiştirilen streptomisin'e dirençli Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR24,25,31,32'den inoküla hazırlanması için genel adımları içermektedir. Bu bölümdeki tüm adımlar anaerobik bir odada yapılmalıdır.
<ol><li>Hazırlanan NYC III et suyu, agar ve PBS dahil olmak üzere herhangi bir reaktifi, kullanımdan en az 24 saat önce dengelemek için anaerobik bir odaya döngüleyin. NOT: Burada,% 5 hidrojen gazı karışımı ile dengelenmiş bir vinil anaerobik oda kullanılmıştır. İç oksijen konsantrasyonu tipik olarak 0 ppm'de durur, ancak malzemeleri odaya çevirirken düşük seviyeli geçici artışlar (10-25 ppm) olabilir.</li>
	<li>Vajinal aşılamadan iki gün önce, Gardnerella'yı dondurulmuş bir gliserol stoğundan anaerobik odadaki bir NYC III agar plakasına yerleştirin. Gliserol stoğunu haznenin içine ve dışına taşıma sırasında donmuş halde tutmak için kuru buzla doldurulmuş küçük bir kap (boş bir pipet ucu kutusu gibi) kullanın.</li>
	<li>Vajinal aşılamadan 1 gün önce, 10 mL NYC III suyu aşılamak için plakadan 5-10 bireysel Gardnerella kolonisi kullanın. Sıvı kültürün 37 ° C'de 16 saat boyunca gece boyunca büyümesine izin verin. Kültür ortamının aşılamadan bırakılan ikinci bir 1 mL aliquot'unu ekleyin ve ortamın kirlenmemiş olduğunu doğrulamak için aşılanmış kültürün yanında inkübe edin.</li>
	<li>İnokulumu, aşağıda açıklandığı gibi sıvı kültürden hazırlayın. İnokulum preparatını anaerobik odada mümkün olduğunca yapın.<ol><li>1,5 mL'lik bir küvette (1:5 seyreltme) 800 μL taze ortama 200 μL kültür ekleyerek kültür optik yoğunluğunu (OD) belirleyin. Seyreltilmiş kültürün yoğunluğunu (OD) 600 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın (boş olarak yalnızca taze ortam içeren ayrı bir küvet kullanın). 16 saat kültürünün gerçek OD600'ünü elde etmek için OD okumasını 5 ile çarpın.</li>
		<li>Deney için gereken inokulum hacmini hesaplayın. Örneğin, 15 fareyi fare başına 20 μL'lik bir inokulum ile enfekte etmek için, 15 x 20 μL = 300 μL inokülum gereklidir. Gerekenden yaklaşık% 25 daha fazla inokülum hazırlayın, bu nedenle 15 fare için 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL inokülum hazırlayın.</li>
		<li>Adım 2.4.1.'de belirlenen OD 600'ü kullanarak, adım 2.4.2'de hesaplanan hacimde bir OD600 = 5.0 inokulum elde etmek için döndürülmesi ve yeniden askıya alınması gereken16 saatlik kültürün hacmini hesaplayın. Örneğin, kültürün OD600'ü 1.5 ise ve ihtiyaç duyulan inokülum hacmi 375 μL ise, döndürülecek kültürün hacmi (375 μL x 5) / 1.5 = 1250 μL'dir.</li>
		<li>Pipet, adım 2.4.3'te hesaplanan kültür hacmi. steril bir mikrosantrifüj tüpüne. 1-3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj yaparak bakterileri topaklayın.</li>
		<li>Süpernatantı çıkarın ve peleti adım 2.4.2'de hesaplanan hacimde anaerobik PBS'de yeniden askıya alın. İnokulum şimdi hesaplanan OD600 / 5.0'da olacaktır. Mümkünse, enfekte olmamış kontrol grubundaki fareler için bir araç kontrolü görevi görecek bir PBS tüpü hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İnokulum tüpünü anaerobik odadan çıkarmadan önce, PBS'de 1:10 ila 1:10 x 106 arasında bir seri seyreltme serisi hazırlayın. Spot plaka 5, inokulumun CFU'sunu belirlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her seyreltmenin bir agar plakasına kopyalanır. Bu aşılama öncesi CFU'dur.</li>
</ol>3. Gardnerella ile vajinal pre-lavaj ve aşılama
<ol><li>Anaerobik odada vajinal lavaj / yıkama tüpleri hazırlayın (bu, adım 2.4'te inokülum hazırlığı ile aynı anda yapılabilir). Pipet, fare numaralarıyla etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine 70 μL steril, anaerobik PBS'dir. Fare başına bir yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri sıkıca kapatın ve anaerobik odadan dışarı doğru çevirin.</li>
	<li>Adım 3.1'de hazırlanan ayrı tüplerden 50 μL anaerobik PBS ile her fareye vajinal lavaj yapın. Bu vajinal lavajlar aşılama öncesi yıkamalardır ve aşağı akış ölçümleri ve tahlilleri için kullanılabilir.<ol><li>İkinci β-östradiol valerat enjeksiyonunun uygulanmasından sonra (adım 1.8), her fareyi bir kafesin üstüne veya ön pençeleriyle kavrayabileceği temiz ve sert bir yüzeye yerleştirin. Kuyruğun orta kısmını yavaşça tutun ve kaldırın, böylece arka kısımlar hafifçe yükseltilir ve vajinal açıklık açığa çıkar.</li>
		<li>Bir pipet ve p-200 filtre ucu kullanarak, uygun fareye karşılık gelen yıkama tüpünden 50 μL PBS çekin. Pipet ucunu yavaşça vajinal lümene ~2-3 mm yerleştirin ve 50 μL hacmini 3x-4x yavaşça içeri ve dışarı pipetleyin.</li>
		<li>Toplanan yıkama malzemesini (~ 50 μL) geldiği aynı yıkama tüpüne geri aktarın, kalan 20 μL PBS'yi hala içeren yıkama tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Aşırı mukus varsa ve uç tıkanırsa, kalan malzemeyi toplamak ve aynı yıkama tüpüne yerleştirmek için temiz bir p-200 ucu kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Konsantre bakteriyel süspansiyonun 20 μL'sini veya araç kontrolünü vajinal olarak her farenin vajinasına uygulayın. Her fareyi, o fare için vajinal lavajdan hemen sonra aşılayın (yani, bir sonrakine geçmeden önce her fare için sırayla lavaj ve aşılama yapın). Bu işlemi basitleştirmek için, biri lavajlar için 50 μL'ye, diğeri aşılamalar için 20 μL'ye ayarlanmış iki p200 pipet kullanın.<ol><li>Fareyi adım 3.2.1'de açıklandığı gibi kısıtlayın. Bir p-200 ucu kullanarak, vajinaya 20 μL bakteriyel süspansiyon pipetin. İki farklı bakteri türü / suşu kullanan ko-aşılama deneyleri için, her bakteriyel süspansiyonun 10 μL'sini kullanın ve aşılamadan önce iki suşu karıştırmaktan kaçının. NOT: Vajinadan dışarı dökülmeyi önlemek için toplam aşılama hacmi 20 μL'yi geçmemelidir.</li>
		<li>Uygulanan hacmin vajinal introitusta hemen birikmesini önlemek için her farenin arka ucunu 10-20 s tutmaya devam edin. Ardından, fareyi yeni bir kafese/kaba veya daha önce aşılanmış kafes arkadaşlarına yerleştirin.</li>
		<li>3.2 adımını yineleyin. ve adım 3.3. her fare için. Fareleri asla henüz aşılanmamış hayvanların bulunduğu bir kafese geri koymayın. Bu, aşılamadan önce farelerin yanlışlıkla streptomisin'e dirençli bakterilere maruz kalmasını önler.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm fareler aşılandıktan sonra, inokülum tüpünü anaerobik odaya geri döndürün. Adım 2.5'te açıklandığı gibi başka bir seri seyreltme hazırlayın ve plakalayın. Bu aşılama sonrası CFU'dur. Hayvanların aşılaması sırasında anaerobik odanın dışındayken inokulumun canlılığının azalıp azalmadığını belirlemek için aşılama sonrası ve aşılama öncesi plakalardan CFU'ları karşılaştırın.</li>
	<li>Adım 3.2'de toplanan vajinal lavajları plakalayın. seçici agar üzerinde (bu durumda, 1 mg / mL streptomisin). Plakaları 37 ° C'de anaerobik bir odada 1-2 gün boyunca inkübe edin ve büyümeyi inceleyin. NOT: Büyüme, mikrobiyomun endojen üyelerinin seçim belirtecine dirençli olduğunu ve bu nedenle hedef organizmanın CFU sayımını gizleyebileceğini gösterir.</li>
</ol>4. Uygulanabilir Gardnerella kolonizasyonunu belirlemek için vajinal lavajların toplanması
<ol><li>Vajinal kolonizasyonu analiz etmek için vajinal yıkamaları belirli zaman noktalarında toplayın. Adım 3.2'de açıklandığı gibi toplayın.</li>
	<li>Toplandıktan hemen sonra, vajinal lavajları anaerobik bir odaya çevirin. Adım 2.5'te açıklandığı gibi seçici agar üzerine seri seyreltme ve kaplama yapmak için her lavajın 10 μL'sini kullanın. CFU sayımlarını Gardnerella (veya ilgi çekici başka bir anaerob) tarafından vajinal kolonizasyonun bir ölçüsü olarak kullanın.</li>
</ol>5. Kurban, diseksiyon ve doku homojenizasyonu
<ol><li>Her fareden toplanan her organ için 5 mL'lik bir tüp hazırlayın (örneğin, vajina, serviks ve uterusun hepsi toplanıyorsa, fare başına üç tüp hazırlayın). Her tüpü anaerobik haznede steril anaerobik 1x PBS (veya başka bir homojenizasyon ortamı) ile doldurun. Vajinaları ve serviksleri toplamak için kullanılan tüpler için 1 mL PBS ve uterus boynuzlarını toplamak için kullanılan tüpler için 750 μL kullanın.</li>
	<li>PBS eklendikten sonra, her bir tüpü tartın (bu, toplama öncesi ağırlıktır ve hasat edilen her dokunun toplam ağırlığını belirlemek için kullanılacaktır). Anaerobik odada bir kantar yoksa, tüpleri sıkıca kapatın ve tartılacak odadan dışarı doğru çevirin, ardından tekrar içeri sikletin. NOT: Tüp hazırlama ve ağırlık toplama fedakarlıktan 1 gün önce yapılabilir, ancak tüpler buharlaşmayı önlemek için kapakları sıkıca kapatılmış olarak anaerobik odada tutulmalıdır.</li>
	<li>Adım 3.1'de açıklandığı gibi bir dizi vajinal lavaj tüpü hazırlayın. kurban keserken son lavajı toplamak. Ayrıca, kurban sırasında standart çelik diseksiyon aletlerinin durulanması ve sterilize edilmesinde kullanılmak üzere 50 mL'lik bir deiyonize (DI) su kabı ve% 70-90 etanolden oluşan ikinci bir 50 mL beher hazırlayın.</li>
	<li>PBS dolu organ toplama tüplerini anaerobik odadan dışarı çıkarın. Dokular eklenmeye hazır olana kadar tüpleri sıkıca kapalı tutun.</li>
	<li>IACUC onaylı yöntemleri kullanarak her fareyi feda edin. Son lavajı adım 3.2.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirin. ve 3.2.3. ya kurban edilmeden hemen önce ya da hemen sonra.</li>
	<li>Diseksiyon ve doku toplamaya başlayın. Her farenin karnını ve sırtını% 70 etanol ile püskürtün. Makası bir etanol kabında sterilize edin, kurumasını bekleyin ve ardından fare abdominopelvik boşluğunu tek bir dikey kesim yapın.</li>
	<li>Cildi geri çekmek için steril forseps kullanın ve bağırsakları vücut boşluğundan ve üreme sistemini açığa çıkaracak açık alanın kenarına hafifçe itin. NOT: Bağırsakları delmemeye veya delmemeye dikkat edin, çünkü deneysel sonuçları karıştırabilecek streptomisin'e dirençli bakterileri barındırabilirler.</li>
	<li>Maksimum vajinal dokuyu toplamak için, nekropsi sırasında kasık kemiğini kırın. Steril makas kullanarak, vajinayı kesmemeye dikkat ederken kasık kemiğinin merkezini (kasık simfizi) kırpın. İki set steril forseps kullanarak, pelvisin her iki tarafını tutun ve pelvisi yanal olarak çekerek vajinanın alt kısmını altına maruz bırakın.</li>
	<li>Serviksi nazikçe kavramak için forseps kullanın (çevreleyen dokuya kıyasla daha sert bir yapı). Vajinanın arkasına gizlenmiş ve yakından bağlı olan kolonu ortaya çıkarmak için rahim ağzını yavaşça yukarı çekin.</li>
	<li>Vajinayı dış bağ dokularından serbest bırakmak için küçük makas kullanın. Vajinayı kolondan dikkatlice ayırın ve bağırsak sistemini delmekten kaçının. Tamamen serbest bırakıldığında, vajinayı introitusa makasla yaklaştırın ve fare gövdesinden serbest bırakmak için kırpın.</li>
	<li>Rahim boynuzlarını daha görünür hale getirmek için hafifçe yukarı çekerken rahim ağzı üzerinde nazik bir tutuş sağlayın. Öte yandan, uterus boynuzlarını serbest bırakmak için sağ ve sol taraftaki yumurtalıkların hemen altından kesin. Şimdi bağlantısı kesilmiş üreme sistemini vücut boşluğundan çıkarın ve steril bir Petri plakasına yerleştirin.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı kullanarak, uterus boynuzlarını, serviksi ve vajinayı ayırın. Her dokuyu kendi etiketli toplama tüpüne yerleştirin. Sitokinler toplanacaksa, doku ilavesinden sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Doku eklendikten sonra her tüpü tekrar tartın. Bu, koleksiyon sonrası ağırlıktır. Dokunun toplam ağırlığını elde etmek için toplama öncesi ağırlığı toplama sonrası ağırlıktan çıkarın.</li>
	<li>Toplama tüplerindeki organları homojenize etmek için elde taşınan bir homojenizatör kullanın. Gardnerella JCP8151B için, bu adımı biyogüvenlik kabininde (aerobik olarak) veya anaerobik odada gerçekleştirin.<ol><li>Numuneler arasında el tipi homojenizatörün yıkanması ve aseptik olarak işlenmesi için birkaç tüp seti hazırlayın. Her setin üç adet 50 mL konik tüpe sahip olduğundan emin olun: biri DI suyuyla, biri %70 etanol ve üçüncüsü 1x PBS ile doldurulur. Her fare tedavi grubu için ayrı bir yıkama tüpü seti hazırlayın.</li>
		<li>Homojenizatörü temizlemek için, bıçakları her yıkama tüpündeki sıvıya indirin ve cihazı maksimum hıza getirin. Homojenizatörü üç tüpün her birinde yaklaşık 3 saniye tutun. Yıkama sırası DI suyu (fiziksel kalıntıları gidermek için), daha sonra etanol (sterilize etmek için) ve son olarak 1x PBS'dir (nötralize etmek için). Her durulama arasındaki fazla sıvıyı gidermek için probu bir kağıt havlu veya tek kullanımlık tezgah pedi üzerine çalkalayın.</li>
		<li>İlk durulamayı takiben, homojenizatör probunu toplama tüpünün altına indirerek dokuları homojenleştirin ve dokuyu altındaki dokuyu hapsedin. Dokuyu öğütmek için homojenizatörü açın, suya batırılmış kalırken probu yaklaşık 5 kat yukarı ve aşağı hareket ettirin. Her organı yaklaşık 15-30 s homojenize edin.</li>
		<li>Homojenizatörü kapatıp tüpten çıkardıktan sonra, doku bozulmasının tam olarak sağlanması için içeriği görsel olarak inceleyin. Bu, bazen sonda tarafından yakalanamayan serviks ve vajina için özellikle önemlidir. NOT: Rahim boynuzlarındaki fazla yağların tamamen homojenleşmemesi sorun değildir.</li>
		<li>5.14.1.-5.14.4. adımlarını tekrarlayın, probu her numune arasında yıkayın ve sterilize edin. Her deney grubu için yeni bir yıkama tüpü setine geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Homojenize numuneler içeren tüpleri anaerobik odaya taşıyın. Her dokunun bakteri yükünü belirlemek için, karıştırmak için numunenin kısa nazik vorteksini uygulayın, ardından seri seyreltme için 100 μL doku homojenatını çıkarın ve CFU tayini için seçici agar üzerine kaplama yapın (ilk seyreltme 1 x 100'dır). Daha düşük bir algılama sınırı gerekiyorsa, 200-250 μL seyreltilmemiş homojenatın yayılma kaplamasını gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+vaginal+flora,+H2O2-producing+lactobacilli,+and+bacterial+vaginosis+in+pregnant+women.">The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women.</a> Clinical Infectious Diseases. 16, 273-281 (1993).</li><li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women.">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).</li><li>Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriology+of+the+vagina.">Bacteriology of the vagina.</a> Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).</li><li>van de Wijgert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaginal+microbiome+and+sexually+transmitted+infections+are+interlinked:+Consequences+for+treatment+and+prevention.">The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention.</a> PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis:+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria.">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).</li><li>Shipitsyna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+vaginal+microbiota+in+women+of+reproductive+age-sensitive+and+specific+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis+is+possible.">Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible.</a> PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).</li><li>Brotman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+assessed+by+gram+stain+and+diminished+colonization+resistance+to+incident+gonococcal,+chlamydial,+and+trichomonal+genital+infection.">Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).</li><li>Peipert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis,+race,+and+sexually+transmitted+infections:+does+race+modify+the+association.">Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association.</a> Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).</li><li>Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+is+a+strong+predictor+of+Neisseria+gonorrhoeae+and+Chlamydia+trachomatis+infection.">Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).</li><li>Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+abnormal+vaginal+flora,+proinflammatory+cytokines+and+idiopathic+infertility+in+women+undergoing+IVF.">Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF.</a> The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).</li><li>Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+bacterial+vaginosis+on+conception+and+miscarriage+in+the+first+trimester:+cohort+study.">Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study.</a> BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).</li><li>Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+and+vaginal+microorganisms+in+idiopathic+premature+labor+and+association+with+pregnancy+outcome.">Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).</li><li>DiGiulio, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+prevalence,+diversity+and+abundance+in+amniotic+fluid+during+preterm+labor:+a+molecular+and+culture-based+investigation.">Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation.</a> PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).</li><li>Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis+in+a+cohort+of+Danish+pregnant+women:+Prevalence+and+relationship+with+preterm+delivery,+low+birthweight+and+perinatal+infections.">Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections.</a> British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).</li><li>&#193;d&#225;m, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-+and+PCR-based+detection+of+BV+associated+microbiological+profile+of+the+removed+IUDs+and+correlation+with+the+time+period+of+IUD+in+place+and+the+presence+of+the+symptoms+of+genital+tract+infection.">Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection.</a> Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).</li><li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cervico-vaginal+microbiota+in+women+developing+persistent+high-risk+Human+Papillomavirus+infection.">Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).</li><li>Bullman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fusobacterium+persistence+and+antibiotic+response+in+colorectal+cancer.">Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer.</a> Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).</li><li>Brennan, C. A., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota,+inflammation,+and+colorectal+cancer.">Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer.</a> Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).</li><li>Hill, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+birth:+associations+with+genital+and+possibly+oral+microflora.">Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora.</a> Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).</li><li>Hitti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+indicators+of+amniotic+fluid+infection+in+preterm+labor.">Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).</li><li>DiGiulio, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+microbes+in+amniotic+fluid.">Diversity of microbes in amniotic fluid.</a> Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).</li><li>Patras, K. A., Doran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+Group+B+Streptococcus+vaginal+colonization.">A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).</li><li>Jerse, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-treated+female+mice+as+surrogate+hosts+for+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections.">Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).</li><li>Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features+of+bacterial+vaginosis+in+a+murine+model+of+vaginal+infection+with+Gardnerella+vaginalis.">Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis.</a> PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).</li><li>Gilbert, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardnerella+vaginalis+and+Prevotella+bivia+trigger+distinct+and+overlapping+phenotypes+in+a+mouse+model+of+bacterial+vaginosis.">Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).</li><li>Agarwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+cross-feeding+supports+mutualism+between+Fusobacterium+and+the+vaginal+microbiota.">Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota.</a> PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).</li><li>Liehr, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+estradiol+a+genotoxic+mutagenic+carcinogen.">Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).</li><li>Yager, J. D., Davidson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+carcinogenesis+in+breast+cancer.">Estrogen carcinogenesis in breast cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation,+foraging,+and+depletion+of+mucus+sialoglycans+by+the+vagina-adapted+Actinobacterium+Gardnerella+vaginalis.">Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).</li><li>Robinson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+15+Gardnerella+vaginalis+strains+isolated+from+the+vaginas+of+women+with+and+without+bacterial+vaginosis.">Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis.</a> Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).</li><li>Adapted from &amp;#34;mouse posterior turn&amp;#34; by BioRender.com. BioRender.com Available from: <a target="_blank" href="https://app.biorender.com/biorender-templates">https://app.biorender.com/biorender-templates</a> (2022)</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).</li><li>Verollet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+step+towards+efficient+sample+preparation+with+bead-beating.">A major step towards efficient sample preparation with bead-beating.</a> Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan modelin daha önce yayınlanmış vajinal aşılama modellerinden farklı olmasının en önemli yolu, canlı inokülumun hazırlanması ve bakterilerin farelerden geri kazanılması için özel hususlar gerektiren anaerobik olarak kültürlenmiş bakterilerin kullanılmasıdır. Yukarıdaki protokoldeki belirli adımlar, Ek Dosya 1'de önerildiği gibi, kullanılan bakteri türüne / suşuna bağlı olarak biraz değişebilir. Ek olarak, bu makale, araştırmacı tarafından daha az deneyim gerektiren bakteri ve vajinal yıkamaların uygulanması için yeni bir prosedürel yöntemi ve fareler için daha az kısıtlama gerektirmektedir. Deneyci, adım 3.2'de açıklanan kısıtlama biçiminden memnun değilse. ve adım 3.3., fareler bunun yerine deneysel tasarıma ve kurumsal IACUC kılavuzlarına göre anestezi ile veya anestezi olmadan daha önce tarif edildiği gibi34 olarak karıştırılabilir.
Murin modellerinde anaerobik olarak kültürlenmiş bakterilerin kullanımına ilişkin önemli bir uyarı, belirli adımların (canlı hayvanları içeren herhangi biri gibi) anaerobik odanın dışında yapılması gerektiğidir. Bu nedenle, bu protokoldeki en kritik adımlar, ilgilenilen bakterilerin, farelerin aşılanması sırasında olduğu gibi aerobik bir ortama maruz kalacağı adımlardır. Bu modelde herhangi bir yeni anaerobun kullanılması, oksijene maruz kaldıktan sonra canlılığını sürdürme kabiliyeti hakkında ön araştırma gerektirecektir (örneğin, adım 2.5. ve adım 3.4'te açıklandığı gibi aşılama öncesi ve sonrası CFU'ların karşılaştırılması gibi). Organizmanın oksijen derecesine ve PBS duyarlılığına bağlı olarak, farklı inokulum hazırlama yöntemleri düşünülmelidir (Ek Dosya 1, adım 2.4.5.). G. vaginalis JCP8151B kullanan aşılar için, PBS'de tek bir inokülum tüpünün hazırlanabileceğini ve tüm fareleri enfekte etmek için kullanılabileceğini bulduk. Oksijene daha duyarlı farklı bir anaerobik bakteri kullanılıyorsa, inokülum bunun yerine her fare için ayrı tüplerde hazırlanabilir, böylece tüpün tekrar tekrar açılması / kapatılması gerekmez. Aynı şekilde, ilgilenilen bakteri türleri PBS'de G. vaginalis'ten daha titiz / daha az hayatta kalabiliyorsa, aşılama bunun yerine kültür ortamında hazırlanabilir. Kullanılan ortam, Prevotella bivia'yı kültürlemek için kullanılan CDC anaerobe ortamı gibi indirgeyici maddeler içeriyorsa (Ek Dosya 1, adım 2.1. ve adım 2.2.), bakteriler ayrıca oksijene maruz kalmaya karşı daha fazla korumaya sahip olacaktır.
Homojenizasyon için, tüp kapağı kapalıyken yapılan ve bu nedenle el tipi homojenizatörden daha az oksijen sağlayabilen boncuk çırpma22,35 gibi alternatif yöntemler de düşünülebilir. Ek olarak, daha oksijene duyarlı organizmalar, ortam için daha uzun bir denge süresi gerektirebilir. Anaerobik koşullara ulaşıldığını kontrol etmek için resazurin gibi bir oksijen göstergesi kullanılabilir (adım 2.1.). Anaerobik kavanozlar gibi alternatif yöntemler sonuçları etkileyebilir ve kullanımdan önce bakteriyel canlılık açısından incelenmelidir.
Deneysel organizmanın oksijen duyarlılığı ve titizliği, lavajlar / homojenizasyon sırasında canlı bakterilerin fareden başarılı bir şekilde geri kazanılmasında da rol oynayabilir (Ek Dosya 1, adım 3.2. ve adım 5.1.). Son derece hassas organizmalar için, alınan ve kaplanan lavaj arasındaki süre, canlılık kaybına yol açabilir ve yapay olarak düşük bir bakteriyel vajinal kolonizasyon tahminine neden olabilir. Bu etkiyi hafifletmek için, toplanan lavajlar derhal taze anaerobik kültür ortamına (indirgeyici madde ile) seyreltilebilir. Benzer şekilde, organ homojenizasyonu, bakteriyel canlılığı artırmak için PBS yerine taze kültür ortamında yapılabilir ve ayrıca oksijen maruziyetini en aza indirmek için anaerobik odanın kendisinde de yapılabilir.
Belirli bir deneyin amacına bağlı olarak, deneyci kontrol gruplarına dikkat etmelidir. Hipotezleri test etmek için, sadece araçla alay edilen enfekte olmamış kontrol farelerinin temel ölçümleri, kemokinlerin / sitokinlerin indüksiyonunun veya enfeksiyonun diğer spesifik sonuçlarının olup olmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır. Kullanılan kontrol aracı, aşılama için kullanılan araçla aynı olmalıdır, bu nedenle bakteriler kültür ortamında aşılanmışsa, aşılanmamış kültür ortamı kontrol olarak kullanılmalıdır (Ek Dosya 1, adım 2.4.5.).
Bu protokolde açıklanan yöntemler, anaerobik olarak büyüyebilen ancak geleneksel olarak aerobik kültür koşulları ( Escherichia coli veya Grup B Streptococcus gibi) kullanılarak incelenen fakültatif bakterilere de uygulanabilir. Bu, özellikle serviks gibi düşük oksijen seviyeleri içerdiğine inanılan vücut bölgelerindeki bu organizmaların enfeksiyonları için geçerli olabilir. Fakültatif bir organizmanın, inokülum aerobik olarak aerobik olarak aerobik olarak hazırlandığında bölgeleri daha az oksijenle daha başarılı bir şekilde enfekte etmesi olabilir. Böyle bir deneyde, CFU sayımı için canlı bakterilerin geri kazanımı anaerobik koşullar gerektirmeyebilir.

Memelilerde, vajina bakteri türlerinden oluşan bir konsorsiyuma ev sahipliği yapar. İnsan vajinal mikrobiyomu, Lactobacillus cinsinin üyelerinin bolluğu ve buna karşılık gelen düşük vajinal pH (3.8-4.5) 1,2,3,4 ile memeliler arasında benzersizdir. Bu Lactobacillus baskınlığının bozulması, çeşitli olumsuz sağlık sonuçları ile ilişkilidir.
Bakteriyel vajinoziste (BV) daha az laktobasil ve Gardnerella vaginalis ve Prevotella bivia 5,6 gibi çeşitli anaerobik bakterilerin bolluğu artar. BV'li kadınlar cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar 7,8,9, kısırlık 10, gebelik kayıpları 11, erken doğum12,13,14, rahim içi enfeksiyonlar 15, servikal enfeksiyonlar 16 ve kanser 16,17,18 riski altındadır. . BV ayrıca, amniyotik sıvı enfeksiyonlarından ortak bir izole olan Fusobacterium nucleatum 1,19,20 gibi potansiyel olarak patojenik bakteriler tarafından vajinal kolonizasyon olasılığının daha yüksek olması ile ilişkilidir 21.
Anaerobik bakterilerin insan vajinal sağlığındaki önemi nedeniyle, bu organizmaların biyolojisini ve patogenezini araştırmak için kullanılabilecek hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Burada, östrojenize farelerde vajinal aşılama ve Gardnerella vaginalis'in canlı iyileşmesi için yöntemleri tarif ediyoruz ve Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için ek stratejiler öneriyoruz. Murin vajinal kolonizasyonunun diğer modelleri daha önce tanımlanmıştır, ancak bunlar aerobik olarak kültürlenen Grup B Streptococcus22 ve Neisseria gonorrhoeae23 gibi fakültatif anaerobik bakterilerin aşılanması ve geri kazanılmasına odaklanmıştır. Zorunlu anaerobların aşılanması ve geri kazanımı uygun deneysel stratejilerle başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Birkaç bakteri taksonunun uygulanabilir geri kazanımı için yaklaşımları tartışıyoruz ve ilgilenilen ek türlerin / suşların yaşayabilirliği için koşulların ampirik olarak değerlendirilmesini öneriyoruz.
Canlı bakteriler tarafından kolonizasyonu tahmin etmenin klasik yöntemi, koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) geri kazanılmasıdır. Geleneksel olarak yetiştirilen ve kendi endojen mikrobiyotaları olan farelerde, bu, endojenöz vajinal mikrobiyotanın üyelerine karşı seçim yapan ve aynı zamanda aşılanmış bakteri suşunun büyümesine izin veren agar ortamında iyileşme gerektirir. Burada, streptomisin içeren bir agar ortamında seçici olarak geri kazanılabilen G. vaginalis24'ün streptomisin'e dirençli bir izolatını kullanıyoruz. Ortamın yeterince seçici olduğundan ve tersine, streptomisin'e dirençli bakterilerin endojen mikrobiyomda bulunmadığından emin olmak için, aşılamadan hemen önce toplanan vajinal lavajlar seçici (streptomisin içeren) agar üzerine kaplanmalıdır.
İnokulum hazırlığı için en iyi yöntem, bakteri türleri ve suşları arasında değişebilir. Farelerde deneylerin başlamasından önce, kültür ortamı, büyüme bitiş noktası ve inokulumun hazırlanması için tercih edilen koşulları ve ayrıca PBS'de oksijene duyarlılığı ve yaşayabilirliği belirlemek için ön çalışma yapılmalıdır. Daha fazla oksijene duyarlı bakteri olması durumunda, inokulumun alternatif preparatları düşünülebilir (örneğin, uygun bir araç kontrol grubuna sahip anaerobik bir kültür ortamında)25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1631</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m, 50 mL Steriflip vacuum filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;SCGP00525</td>
			<td>sterile filtering sesame oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190-proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>&#160;V1105M</td>
			<td>dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT21040CM</td>
			<td>vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G &#215; 5/8 -in needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Tissue collection and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td>7200000</td>
			<td>Growth of anaerobic bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0140074</td>
			<td>G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118170</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbia broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0944170</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>DSB500</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;11008-13</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogenizer</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>3305500</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hemostat</td>
			<td>SHS500</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen)</td>
			<td>Matheson</td>
			<td></td>
			<td>Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>mouse anaethesia at sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1626</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>for making media and homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Gas for anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-200 filter tips</td>
			<td>ISC Bio</td>
			<td>&#160;P-1237-200</td>
			<td>vaginal lavages and bacterial inoculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic digest of casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70169</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone #3</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>&#160;14084-08</td>
			<td>mouse/tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;ICN15662191</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge surgical carbon steel razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to agar media to make selective plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin slip tip 1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>estrogenization of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitaim K3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td>Columbia media for F. nucleatum growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95271</td>
			<td>CDC anaerobic media for P. bivia growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>NYCIII media for G. vaginalis growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models of murine vaginal colonization by anaerobically grown bacteria

Memeli vajinası birçok bakteri taksonu tarafından kolonize edilebilir. İnsan vajinal mikrobiyomuna genellikle Lactobacillus türleri hakimdir, ancak dört kadından biri, düşük bir laktobasil seviyesine çeşitli anaerobik bakterilerin aşırı büyümesinin eşlik ettiği bakteriyel vajinozis yaşar. Bu durum, üreme ve cinsel sağlık riskleri de dahil olmak üzere birçok sağlık komplikasyonu ile ilişkilendirilmiştir. İnsan vajinal sağlığındaki mikrobiyal etkileşimlerin karmaşık doğasını gösteren artan kanıtlar olsa da, bu farklı anaerobik bakterilerin bireysel rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, anaerobik olarak yetiştirilen vajinal bakterileri incelemek için yeterli modellerin bulunmaması nedeniyle karmaşıktır. Fare modelleri, bu organizmaların biyolojisini ve virülansını in vivo olarak araştırmamıza izin verir. Vajinal bakteriyel aşılamanın diğer fare modelleri daha önce tanımlanmıştır. Burada, anaerobik olarak yetiştirilen bakterilerin aşılanması ve geleneksel olarak yetiştirilmiş C57Bl / 6 farelerde uygulanabilir iyileşmeleri için yöntemleri açıklıyoruz. Vajinal aşılama ve yıkama için yeni, daha az stresli bir prosedürel yöntem de tanımlanmıştır. Gardnerella'nın aşılanması ve uygulanabilir geri kazanımı ayrıntılı olarak özetlenmiş ve Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum gibi ek anaeroblar için stratejiler tartışılmıştır.

Örnek bir deneyin şematik bir gösterimi, açıklanan protokolün gerçekleştirilebileceği bazı yolları gösterir (Şekil 1).
Bazı hayvanlar, vajinal mikrobiyomlarında, seçici olmayan ortamlarda büyüyecek endojen mikroplar taşıyacaktır. Burada tarif edilen yöntemler, endojen bakterilere karşı seçim yapmak için, çalışılan bakteri suşlarının streptomisin'e dirençli izolatlarına, streptomisin içeren seçici ortamlarla birlikte dayanır (Şekil 2A, B). Streptomisin direncinin kendiliğinden gelişmesi mümkündür, bu nedenle enfeksiyondan önce fareleri kontrol etmek (0. gün yıkamaları) bunun bir sorun olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir.
Vajinal yıkamalardan canlı bakterilerin geri kazanımı, agar ortamında seri seyreltme ve kaplama ile gerçekleştirilir. Standart bir petri kabı, 6 x 6 diziye kadar 5 μL nokta tutabilir ve 10 kat seri seyreltme kullanılıyorsa, her numune için altı büyüklük sırası boyunca altı replika noktasından bakteri titrelerinin numaralandırılmasına izin verir (Şekil 3A). Bu yöntem, Gardnerella'dan Prevotella ve Fusobacterium'a kadar değişen bakteri titrelerini numaralandırmak için kullanılabilir (Şekil 3B-D).
Birlikte, bu yöntemler hipotezleri test etmeye ve kadın üreme sisteminin bakteriyel kolonizasyonu / enfeksiyonu hakkında yorumlar yapmaya izin verir. Örneğin, vajinal yıkamalarda ve vajinal doku homojenatlarında Gardnerella titrelerinin karşılaştırılması, bu yöntemler arasında uyum olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). Benzer şekilde, vajinal ko-aşılama modelinde, uterus dokusundaki Prevotella titreleri, Prevotella mono-enfeksiyonuna kıyasla Gardnerella ko-enfeksiyonu sırasında anlamlı derecede daha yüksekti (yaklaşık 20 kat) (Şekil 4B). Son olarak, üreme sistemi kolonizasyonu / enfeksiyonu süreçlerinde spesifik genlerin ve ürünlerinin oynadığı rolleri belirlemek için bu modellerde vahşi tipe karşı mutant bakteri suşları karşılaştırılabilir. Örneğin, karbonhidrat sialik asidi taşıma ve tüketme kabiliyetinden yoksun bir mutant Fusobacterium suşu, aşılamadan 3 gün sonra daha düşük kolonizasyon seviyelerine yol açmıştır (Şekil 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> Şekil 1: Örnek bir deneyin şeması33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> Şekil 2: Endojen murin vajinal mikroplarının seçici ve seçici olmayan agar üzerinde büyümesi. Beş dişi C57Bl / 6 fareden (1-5) vajinal lavajlar iki farklı NYC III agar plakasına dizildi ve anaerobik olarak inkübe edildi. (A) Soldaki plaka herhangi bir antibiyotik içermez ve murin vajinal yoldan endojen anaerobik bakterilerin büyümesine izin verir. (B) Sağdaki plaka 1 mg/mL streptomisin içerir ve endojen bakterilerin büyümesine karşı seçim yapar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> Şekil 3: Vajinal yıkamalardan canlı G. vaginalis, P. bivia ve F. nucleatum CFU'ların geri kazanılması. (A) NYC III AGAR'da seyreltme serisi olarak çoğaltılmış G. vaginalis JCP8151B-SmR inokulumunun CFU'ları. (B-D) Mono-enfekte hayvanların vajinal lavajlarından canlı (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 ve (D) F. nucleatum26'nın geri kazanılması. Her grafik (B-D) için, veriler iki bağımsız deneyden birleştirilir ve deney başına 10-15 fare24,25,26 olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> Şekil 4: Bir murin vajinal aşılama modelinde anaerobik bakteriyel kolonizasyonun daha ileri analizi. (A) Vajinal yıkamalardaki G. vaginalis titreleri, aşılama sonrası 24 saat ve 72 saat vajinal doku homojenatlarından elde edilen G. vajinalis titreleri ile ilişkilidir (her biri n = 10 saat olmak üzere iki bağımsız deneyin kombinasyonu). Spearman'ın rütbe korelasyon testi ile belirlenen anlamlılık)24. (B) G. vaginalis ile birlikte enfeksiyon, aşılama sonrası 48 saatte P. bivia mono-enfekte hayvanlarla karşılaştırıldığında uterus boynuz dokusunda P. bivia titrelerinin artmasına neden olur (her biri grup başına 6-10 fare ile iki bağımsız deneyin kombinasyonu. Mann-Whitney U-testi tarafından belirlenen anlamlılık, **p = 0.0017)25. (C) Bozulmuş sialik asit taşıyıcılı F. nucleatum mutantı (Ω SiaT), mono-enfekte farelerin vajinal lavajlarındaki titreleri, aşılama sonrası 72 saatte F. nucleatum vahşi tipine kıyasla azaltmıştır (her biri grup başına 10 fareye sahip iki bağımsız deneyin kombinasyonu). Mann-Whitney U-testi tarafından belirlenen anlamlılık, **p < 0.01)26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Anaerobik koşullar altında yetiştirilen farklı vajinal bakteriler için kullanılan yöntemlere örnekler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria at JoVE.com

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

Protokol, anaerobik olarak kültürlenmiş insan vajinal bakterileri ile vajinal kolonizasyonun bir fare modelini sunar. Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için öneriler eklerken Gardnerella vaginalis'e odaklanıyoruz. Bu protokol aynı zamanda vajinal aşılamalar ve diğer anaerobik olarak yetiştirilen bakterilerin canlı iyileşmesi için bir rehber olarak da kullanılabilir.

Yapay Olarak Yetiştirilen Bakteriler Tarafından Murin Vajinal Kolonizasyon Modelleri

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Bu yöntem, araştırmacıların kadın üreme sisteminde yaşayan ve enfeksiyonlara neden olan anaerobik bakterilerin biyolojisini ve patofizyolojisini incelemelerine yardımcı olacaktır. Önceki murin vajinal aşılama modelleri, aerobik koşullar altında yetiştirilen ve geri kazanılan bakterilere odaklanmıştır. Yöntemimiz, oksijen maruziyetini en aza indirmek için ek stratejiler gerektiren zorunlu anaerobik bakterilerin aşılanması ve geri kazanılması konusunda talimat verir.Ne kadar titiz olduklarına bağlı olarak, bu modelde kullanılan yeni bakteri suşları belirli adımlarda değişiklik gerektirebilir. Makalenin birinci tablosunda potansiyel değişiklikler için önerilerde bulunduk. Başlangıç olarak, anaerobik bir odada 800 mikrolitre taze ortam içeren 1.5 mililitrelik bir küvete 200 mikrolitre 16 saatlik bakteri kültürü ekleyin.Daha sonra, seyreltilmiş kültürün optik yoğunluğunu veya OD'yi, bir spektrofotometrede 600 nanometrede, yalnızca boş olarak ortam bulunan ayrı bir küvet kullanarak ölçtü. Kültürün gerçek OD değerini elde etmek için, spektrofotometre okumasını beşle çarpın, ardından deney için gerekli olan inokulum hacmini belirleyin ve gerekli inokulum yoğunluğunu elde etmek için gereken bakteri kültürünün hacmini hesaplayın. Daha sonra, gerekli bakteri kültürü hacmini steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve bir ila üç dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüj yapın.Süpernatanı çıkardıktan sonra, daha önce hesaplanan gerekli inokülum hacmini elde etmek için peleti anaerobik PBS'de yeniden askıya alın. Hazırlanan inokulumdaki bakteriyel koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için, ilk olarak, PBS'de birkaç seri seyreltme yapmak için 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon kullanın ve agar plakalarındaki plaka inokülum seyreltmelerini tespit etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Aynı zamanda, vajinal lavaj tüplerini anaerobik odadaki 70 mikrolitre steril anaerobik PBS'yi fare numaralarıyla etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine pipetleyerek hazırlayın.Tüpleri sıkıca kapatın ve odadan çıkarın. Vajinal lavaj yapmak için, ilk önce, ön pençeleriyle tutabileceği bir kafesin üstüne bir fare yerleştirin. Ardından, kuyruğun orta kısmını yavaşça tutun ve arka çeyrekler hafifçe yükselecek ve vajinal açıklık açığa çıkacak şekilde kaldırın.Etiketli yıkama tüpünden 50 mikrolitre PBS çektikten sonra, pipet ucunu vajinal lümenin içine iki ila üç milimetre yavaşça yerleştirin ve üç ila dört kez pipetleyerek PBS ile yıkayın. Ardından, yıkama malzemesini kalan 20 mikrolitre kullanılmayan PBS ile orijinal yıkama tüpüne geri aktarın. Bu vajinal lavajdan hemen sonra, her fareyi vajinal olarak 20 mikrolitre bakteriyel süspansiyon veya araç kontrolü aktararak aşılayın.İki farklı bakteri suşu ile birlikte aşılama deneyleri için, suşları önceden karıştırmak yerine, her bir bakteriyel süspansiyonun 10 mikrolitresi ile ayrı ayrı aşılayın. Uygulanan hacmin vajinal introitusta hemen birikmesini önlemek için, farenin arka kısmını 10 ila 20 saniye boyunca tutmaya devam edin. Aşılanmış fareyi yeni bir kafese veya önceden aşılanmış kafes arkadaşlarına aktarın ve prosedürü diğer farelerle tekrarlayın.Tüm fareleri aşıladıktan sonra, anaerobik odadaki inokulumun seri seyreltilerini kaplayarak inokulum sonrası koloni oluşturan birimleri alın. Fare organlarını toplamak için, vajinalar ve serviksler için her tüpe bir mililitre steril anaerobik PBS ekleyerek anaerobik odada beş mililitrelik organ toplama tüpleri hazırlayın. Rahim boynuzları için işaretlenmiş tüplere 750 mililitre PBS ekleyin.Son lavajı kurban olarak toplamak için, daha önce gösterildiği gibi başka bir vajinal lavaj tüpü seti hazırlayın. Ayrıca, diseksiyon aletlerini durulamak ve sterilize etmek için, 50 mililitrelik deiyonize su kabı ve% 70 ila% 90 etanollük 50 mililitrelik bir beher hazırlayın. Fareleri kurban etmeden hemen önce veya sonra, daha önce gösterildiği gibi son lavajı gerçekleştirin.Fedakarlıktan sonra, bir farenin karnını ve sırtını% 70 etanol ile püskürtün. Daha sonra, farenin karın pelvik boşluğunu dikey kesiklerle açmak için etanol sterilize edilmiş ve kurutulmuş makas kullanın. Ardından, cildi geri çekmek için forsepsleri kullanın.Üreme sistemini açığa çıkarmak için, bağırsakları vücut boşluğundan açık alanın yanına yavaşça itin ve üreme sisteminin alt kısmına erişmek için mesaneyi fareden çıkarın. Bundan sonra, vajinayı kesmeden kasık kemiğinin merkezini makasla klipsleyin. Daha sonra, pelvisin her iki tarafını tutmak için iki set forseps kullanın ve vajinanın alt kısmını altına maruz bırakmak için pelvisi yanal olarak açın.Serviksi forseps ile yavaşça tutun ve kolonu ortaya çıkarmak için yukarı çekin. Bundan sonra, vajinayı dış bağ dokularından serbest bırakmak için küçük makas kullanın. Bağırsak sistemini delmeden vajinayı kolondan dikkatlice serbest bırakın.Vajina kolondan tamamen serbest bırakıldığında, vajinayı introitusa sarmak için makas kullanın ve ardından fare gövdesinden çıkarmak için kırpın. Serviks üzerinde nazik bir tutuş sağlayarak, uterus boynuzlarını daha görünür hale getirmek için yukarı doğru çekin ve uterus boynuzlarını serbest bırakmak için sağ ve sol taraftaki yumurtalıkların hemen altında kesin. Ardından, üreme sistemini fare gövdesinden çıkarın ve steril bir Petri kabına yerleştirin.Daha sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak, uterus boynuzlarını, serviksi ve vajinayı ayırın. Her dokuyu kendi etiketli toplama tüpüne yerleştirin. Organların homojenizasyonu için, bir biyogüvenlik kabininde el tipi homojenizatörü hazır bulundurun.İlk olarak, her organı homojenize ettikten sonra homojenizatör bıçaklarını yıkamak için sırasıyla deiyonize su,% 70 etanol ve PBS içeren üç adet 50 mililitrelik tüp seti hazırlayın. Homojenizatörü temizlemek için, bıçağı su borusuna batırın ve makineyi yaklaşık üç saniye boyunca tam hızda açın. Ardından, fazla suyu gidermek için bıçağı bir kağıt havlu üzerinde sallayın.Bıçağı art arda %70 etanol ve PBS ile durulayın. İlk durulamadan sonra, homojenizatör probunu, altındaki dokuyu yakalamak için organları olan bir tüpün dibine indirin. Ardından, dokuyu öğütmek için homojenizatörü açın ve probu yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek suya batırılmış halde tutun.Homojenizatörü kapatıp çıkarın ve görsel olarak dokunun tamamen bozulmasını sağlayın. Homojenizasyondan sonra, numuneyi anaerobik odaya geri döngüleyin ve CFU geri kazanımı için seri seyreltme gerçekleştirin. Bu protokolü takiben, canlı bakterilerin geri kazanımı ve vajinal yıkamalardan koloni oluşturan birimlerin sayımı, bakteriyel suşlar, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için başarıyla yapılabilir.Ayrıca, vajinal yıkamalardan elde edilen Gardnerella vaginalis koloni oluşturan ünitelerin sayısı, vajinal doku homojenatlarından elde edilenlerle korelasyon göstermiştir. Bu yöntem aynı zamanda Prevotella bivia titrelerinin ve fare uterus dokularının, Gardnerella vaginalis ile birlikte enfeksiyon sırasında Prevotella mono-enfeksiyonuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, bu yöntem, mutant bir Fusobacterium nucleatum suşunun vajinal kalıcılığını, aşılamadan 24 ve 72 saat sonra vahşi tipinkiyle karşılaştırmak için başarıyla kullanılabilir.Vajinal bakteriyel aşılamaya karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için, doku homojenatları üzerinde sitokin testleri yapılabilir. Alternatif olarak, dokular inflamasyon belirtilerini değerlendirmek için histolojik inceleme için saklanabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...