Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال أرقام منح المنح R37-CA260223 و R21CA246414. نشكر نواة قياس التدفق الخلوي NCSU على التدريب والتوجيه بشأن تحليل قياس التدفق الخلوي. تم إنشاء المخططات باستخدام Biorender.com

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على خلايا الأولوية البشرية ونواقل الفيروسات القهقرية وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية لجامعة ولاية كارولينا الشمالية ووافق عليها مكتب الصحة والسلامة البيئية. تم شراء خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية كمعاطف بافي من مصادر تجارية. يجب عزل الخلا...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

يستمر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في اكتساب الاهتمام لكل من التطبيقات البحثية والتجارية. على الرغم من النجاح الذي حققه العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في علاج سرطانات الدم، فإن التكلفة العالية للإجراء تحد من استخدامه. يقدم البروتوكول ا...

برز العلاج المناعي كنموذج ثوري لعلاج السرطان نظرا لقدرته على استهداف الأورام على وجه التحديد ، والحد من السمية الخلوية خارج الهدف ، ومنع الانتكاس. على وجه الخصوص ، اكتسب العلاج بالخلايا الخيمرية لمستقبلات المستضد T (CAR-T) شعبية بسبب نجاحه في علاج الأورام اللمفاوية وسرطان الدم. وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على أول علاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في عام 2017 ، ومنذ ذلك الحين ، وافقت على أربعة علاجات أخرى للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية1،2،3،4،5. تحتوي CARs على مجال التعرف على المستضد يتكون عادة من جزء متغير سلسلة واحدة من جسم مضاد وحيد النسيلة خاص بمستضدمرتبط بالورم 3,4. عندما يتفاعل CAR مع المستضد المرتبط بالورم ، يتم تنشيط الخلايا التائية CAR-T ، مما يؤدي إلى استجابة مضادة للأورام تتضمن إطلاق السيتوكين ، وتحلل الخلايا ، وتعبير عامل النسخ ، وتكاثر الخلايا التائية. لإنتاج الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية ، يتم جمع الدم من المريض للحصول على الخلايا التائية. تضاف مستقبلات المستضدات الخيمرية وراثيا إلى الخلايا التائية للمريض باستخدام فيروس. تزرع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في المختبر وتغرس مرة أخرى في المريض2،3،4،6. يتم تحديد التوليد الناجح للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من خلال كفاءة النقل ، والتي تصف عدد الخلايا التائية المعدلة وراثيا إلى خلايا تائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية.
حاليا ، المعيار الذهبي لتوليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية هو دوران الخلايا التائية المنشطة والفيروس على الألواح المطلية بالريترونيكتين 7,8. يبدأ النقل عندما تتفاعل الجسيمات الفيروسية مع سطح الخلايا التائية. يعزز Retronectin التمركز المشترك للفيروس والخلايا عن طريق زيادة كفاءة الربط بين الجسيمات الفيروسية والخلايا ، مما يعزز النقل 7,8. لا يعمل Retronectin بشكل جيد من تلقاء نفسه ويحتاج إلى أن يكون مصحوبا بالدوران ، مما يعزز نقل الجينات عن طريق تركيز الجسيمات الفيروسية وزيادة نفاذية سطح الخلية التائية ، مما يسمح بعدوى فيروسية أسهل8. على الرغم من نجاح الدوران على الألواح المطلية بالريترونيكتين ، إلا أنها عملية معقدة تتطلب دورات دوران متعددة وكواشف باهظة الثمن. لذلك ، فإن الطرق البديلة لنقل الجينات الفيروسية الأسرع والأرخص مرغوبة للغاية.
الجينات هي عديد السكاريد الأنيوني الطبيعي المستخدم على نطاق واسع في الصناعة الطبية الحيوية نظرا لتكلفتها المنخفضة ، وملف السلامة الجيد ، والقدرة على تكوين الهلاميات المائية عند الاختلاط مع الكاتيونات ثنائية التكافؤ9،10،11،12. الجينات عبارة عن بوليمر متوافق مع GMP ومعترف به عموما على أنه آمن (GRAS) من قبل إدارة الغذاء والدواءالأمريكية 13. يؤدي ربط الجينات مع الكاتيونات إلى إنشاء هلاميات مائية مستقرة تستخدم غالبا في التئام الجروح ، وتوصيل الأدوية والبروتينات الكيميائية الصغيرة ، ونقل الخلايا9،10،11،12،14،15،16. نظرا لخصائص التبلور الممتازة ، فإن الجينات هي المادة المفضلة لإنشاء سقالات مسامية عن طريق التجفيف بالتجميد10,17. هذه الخصائص للجينات تجعلها مرشحا جذابا لإنتاج سقالة يمكنها التوسط في نقل الجينات الفيروسية للخلايا المنشطة.
يوصف هنا بروتوكول لصنع سقالات الجينات الجافة الكبيرة التي يسهل اختراقها ، والمعروفة باسم سقالات Drydux ، والتي تنقل الخلايا التائية بشكل ثابت عن طريق نقل الجينات الفيروسية17,18. يوضح الشكل 1 عملية صنع هذه السقالات. هذه السقالات تلغي الحاجة إلى تدوير الألواح المطلية بالريترونيكتين. تشجع سقالات الجينات الكبيرة التي يسهل اختراقها تفاعل الجسيمات الفيروسية والخلايا التائية لتمكين نقل الجينات بكفاءة في خطوة واحدة دون التأثير على وظائف وصلاحية الخلايا التائية المهندسة17. عند اتباعها بشكل صحيح ، تتمتع سقالات الجينات الكبيرة التي يسهل اختراقها بكفاءة نقل لا تقل عن 80٪ ، مما يبسط ويقصر عملية النقل الفيروسي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> الشكل 1: التخطيطي والجدول الزمني للبروتوكول . (أ) الجدول الزمني لصنع سقالات الألجينات الجافة التي يسهل اختراقها. يرتبط الجينات مع الكالسيوم-D-غلوكونات ويتم تجميده بين عشية وضحاها. يتم تجفيف السقالات المجمدة بالتجميد لمدة 72 ساعة لإنشاء سقالات Drydux. ب: الجدول الزمني لنقل الخلايا المنشطة عبر الفيروس. يتم زرع الخلايا المنشطة والفيروسات (MOI 2) فوق السقالة ويتم تحضينها في وسائط كاملة مكملة ب IL-7 و IL-15. تمتص السقالات الخليط وتعزز نقل الجينات الفيروسية. يستخدم EDTA لإذابة السقالات وعزل الخلايا المحولة. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS ، يمكن استخدام حبيبات الخلية للتحليل. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ PBMCs = خلايا الدم أحادية النواة المحيطية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

أصبحت الهندسة الوراثية للخلايا التائية للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في طليعة علاج السرطان على مدى السنوات القليلة الماضية. يتم إنتاج الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عن طريق نقل الجينات الفيروسية إلى الخلايا التائية. يتضمن المعيار الذهبي الحالي لنقل الجينات الفيروسية تدوير الصفائح المغلفة بالريترونيكتين ، وهو أمر مكلف ويستغرق وقتا طويلا. هناك حاجة كبيرة لطرق فعالة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيع سقالات ألجينات غير مكلفة وجافة كبيرة المسام ، والمعروفة باسم سقالات Drydux ، والتي تعزز بكفاءة النقل الفيروسي للخلايا التائية المنشطة. تم تصميم السقالات لاستخدامها بدلا من الدوران القياسي الذهبي للصفائح المطلية بالريترونيكتين المزروعة بالفيروس وتبسيط عملية تحويل الخلايا. يتم ربط الجينات مع الكالسيوم-D-gluconate وتجميدها طوال الليل لإنشاء السقالات. يتم تجفيف السقالات المجمدة بالتجميد في مجفف بالتجميد لمدة 72 ساعة لإكمال تكوين السقالات الجافة التي يسهل اختراقها. تتوسط السقالات في نقل الجينات الفيروسية عندما يتم زرع الفيروس والخلايا التائية المنشطة معا فوق السقالة لإنتاج خلايا معدلة وراثيا. تنتج السقالات >85٪ من نقل الخلايا التائية الأولية ، وهو ما يمكن مقارنته بكفاءة نقل الدوران على الألواح المطلية بالريترونيكتين. توضح هذه النتائج أن سقالات الجينات الجافة التي يسهل اختراقها تعمل كبديل أرخص وأكثر ملاءمة لطريقة النقل التقليدية.

من السهل صنع سقالات الجينات الكبيرة التي يسهل اختراقها ويجب أن تخرج من جهاز التجفيف بالتجميد كأقراص مسامية ورقيقة وبيضاء. على الرغم من عدم دراسته في هذه التجربة ، يمكن صب محلول ألجينات الكالسيوم في قوالب مختلفة لإنشاء سقالات بأشكال مختلفة ، اعتمادا على احتياجات المستخدم 9,...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

فيما يلي بروتوكول لإنشاء سقالات ألجينات جافة كبيرة المسام تتوسط في نقل الجينات الفيروسية الفعالة لاستخدامها في الهندسة الوراثية للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. تبين أن السقالات تقوم بتحويل الخلايا التائية الأولية المنشطة بنسبة >85٪.

تصنيع واستخدام سقالات الجينات الجافة الكبيرة المسامية للنقل الفيروسي للخلايا التائية

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

الموصوف في هذا الفيديو هو بروتوكول لإنشاء واستخدام سقالات الجينات الجافة التي يسهل اختراقها والمعروفة باسم Drydux والتي تعزز بكفاءة نقل الخلايا التائية المنشطة. تم تصميم Drydux ليتم استخدامه بدلا من الدوران القياسي الذهبي للألواح المطلية ب RetroNectin المزروعة بالفيروس ويبسط عملية تحويل الخلايا. يتمتع Drydux بكفاءة نقل مماثلة للدوران على الألواح المطلية ب RetroNectin ، ويعمل كبديل أرخص وأكثر ملاءمة لطريقة النقل التقليدية.أولا ، قم بإعداد محلول 0.4٪ من الكالسيوم-D-gluconate. أضف ماء DI المعقم المصفى إلى الكالسيوم-D-gluconate في دورق. يقلب على سرعة متوسطة حتى يذوب الكالسيوم-D-gluconate ، الأمر الذي يستغرق حوالي 1 1/2 ساعة.بمجرد إذابته ، قم بتصفية محلول الكالسيوم D-gluconate المعقم. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول ألجينات 2٪.يمكن تحقيق ذلك باستخدام قارورة غطاء لولبي أو دورق. سيتم عرض كلاهما هنا. أضف بعناية الجينات فائقة النقاء إلى الوعاء.أضف الكمية المناسبة من ماء DI إلى الجينات. اختر أكبر شريط تحريك ممكن لن يعيق الخلط وأضفه إلى الوعاء. حرك المحلول على درجة عالية حتى يذوب الجينات ، الأمر الذي يستغرق حوالي ساعة واحدة.إذا كان هناك أي كتل ألجينات كبيرة على جانب الوعاء ، فقم بإمالة الوعاء جانبيا لإزاحتها. سوف تذوب الكتل الصغيرة على مدار الساعة ، ولا تدعو للقلق. بمجرد أن يذوب محلول الجينات 2٪ ، قلل من سرعة التحريك.أضف ببطء حجما متساويا من محلول غلوكونات الكالسيوم-D إلى محلول الجينات. ستساعد إضافته ببطء على منع تكون كتل الربط المتقاطع. عند إضافة محلول غلوكونات الكالسيوم ، قم بزيادة سرعة التحريك ، وحركه بقوة لمدة 15 دقيقة.قم بإمالة الوعاء جانبيا لإزالة أي كتل قد تكون تشكلت. بعد التقليب بقوة لمدة 15 دقيقة ، تأكد من عدم وجود كتل في المحلول. ماصة الحل في لوحة 48 ، أو 24 بئر.للحصول على لوحة من 48 بئرا ، ماصة 300 ميكرولتر في كل بئر. تأكد من الإلقاء ببطء وتغيير النصائح في كثير من الأحيان ، لأن المحلول سيكون لزجا ، وقد يلتصق بالطرف. للحصول على لوحة من 24 بئرا ، ماصة ملليلتر واحد في كل بئر.مرة أخرى ، يلقي ببطء ، وتغيير نصائح ماصة في كثير من الأحيان. قم بتغطية ألواح البئر بغطاء ، وقم بتجميدها عند سالب 20 درجة مئوية طوال الليل. قم بإعداد الألواح لجهاز التجفيف بالتجميد عن طريق إزالة الأغطية وتأمين الجزء العلوي بالمناديل والأربطة المطاطية.ضع الألواح في أنبوب المجفف بالتجميد ، وضعها على جهاز التجفيف بالتجميد لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة ، أخرج اللوحة من جهاز التجفيد. السقالات جاهزة الآن لاستخدامها في النقل.إذا لم تستخدم السقالات على الفور ، أغلق الطبق ب Parafilm واحفظه في درجة حرارة أربع درجات مئوية لحين الحاجة. للتخزين طويل الأجل ، يوصى بإغلاق اللوحة بالمكنسة الكهربائية بالإضافة إلى الختم باستخدام Parafilm. تركيز طاف الفيروسية عن طريق الطرد المركزي اثنين ملليلتر من محلول فيروسي من خلال مرشح الطرد المركزي في 1،500 غرام لمدة 10 دقائق.هناك حاجة إلى 100 إلى 200 ميكرولتر من الفيروس المركز لكل سقالة. تدور لبضع دقائق إضافية إذا كان حجم محلول الفيروس المركز أكبر من 200 ميكرولتر. لكل سقالة ، اصنع حصصا من 1 مليون خلية تائية نشطة معلقة في 50 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا الكاملة.أضف الفيروس المركز إلى تعليق الخلية. يجب ألا يتجاوز الحجم الكلي لتعليق فيروس الخلية 200 ميكرولتر لسقالة 48 بئرا ، أو 350 ميكرولتر لسقالة 24 بئرا. أضف خليط فيروس الخلية قطرة إلى الجزء العلوي من السقالة الجافة.بالنسبة لتجارب التحكم السلبية ، استخدم وسائط زراعة الخلايا الكاملة بدلا من الفيروس المركز. أضف معلق الخلية هذا إلى الجزء العلوي من السقالة الجافة. احتضان السقالات في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة.إزالة السقالات من الحاضنة. يجب أن تمتص السقالات المحلول بالكامل خلال هذا الوقت. للحث على الانتشار ، أضف وسائط زراعة الخلايا الكاملة المكملة ب IL-7 و IL-15 إلى كل بئر.يمكن أيضا استخدام IL-2. للحصول على سقالة 24 بئرا ، أضف ملليلتر واحد. للحصول على سقالة 48 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر.احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. سوف تتكاثر الخلايا على مدار 72 ساعة ، مما قد يحول الوسائط إلى اللون البرتقالي. قم بإزالة الوسائط الزائدة من كل بئر.لعزل الخلايا عن السقالة ، أضف محلول EDTA 0.25 المولي إلى كل سقالة. أضف ملليلتر واحد للسقالات ذات 24 بئرا ، أو 300 ميكرولتر للسقالات ذات 48 بئرا. دع الطبق يجلس ، أو حرك بلطف لمدة ثلاث إلى أربع دقائق.بمجرد أن يذوب في الغالب ، ماصة داخل وخارج بلطف داخل البئر. قد تكون بعض خطوات السحب للداخل والخارج ضرورية لإذابة السقالة بالكامل. نقل الحل إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر.اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 12 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي. جهاز طرد مركزي عند 400 غرام لمدة خمس دقائق.سوف تتشكل بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح محلول طافي ، وكرر الغسيل. احرص على إزالة المادة الطافية تماما مع كل غسلة لأنه من الضروري التخلص من كل EDTA.بعد الغسيل باستخدام PBS مرة ثانية ، تكون حبيبات الخلية جاهزة للتحليل. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد كفاءة النقل لكل مجموعة. تم استخدام الخلايا غير المنقولة كعنصر تحكم سلبي ، ولم تظهر أي نقل.كما لم تظهر الخلايا المصنفة على سقالات بدون فيروس GFP القهقري أي نقل. أظهرت مجموعة Drydux ، التي نشطت الخلايا المزروعة على سقالات الجينات الجافة التي يسهل اختراقها ، 85٪ من النقل ، أي أقل بقليل من مجموعة RetroNectin. توضح هذه النتائج أن سقالات Drydux تنقل الخلايا بشكل فعال عن طريق نقل الجينات الفيروسية القهقرية دون الحاجة إلى تدوير الصفائح المطلية ب RetroNectin.تظهر سقالات Drydux كفاءة نقل عالية مماثلة ل RetroNectin ، مما يوفر طريقة بديلة لتحويل الخلايا التائية. نظرا لانخفاض تكلفة تصنيع سقالات Drydux ، فإن هذه العملية لديها القدرة على خفض تكلفة علاجات الخلايا التائية CAR T-cell بشكل كبير.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

استخدام الخلايا الجذعية البشرية ارتشاح لتجديد العظام

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

تصنيع ميكانيكيا الانضباطي والحيويه المعادن سقالات للتطبيقات الطبية الحيوية

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

تصنيع وتوصيف السقالات جريفيثسين تعديل الألياف للوقاية من الأمراض المنقولة

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

نقل وتوسيع الخلايا التائية الأولية في تسعة أيام مع الحفاظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

سقالات 3D مترابطة من قضبان Microgel

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...