Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health gennem Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. Vi takker NCSU-flowcytometrikernen for træning og vejledning i flowcytometrianalyse. Skemaer blev oprettet med Biorender.com

Alle procedurer, der involverede humane forrangceller og retrovirale vektorer, blev udført i overensstemmelse med North Carolina State University's retningslinjer for biologisk sikkerhed og godkendt af Environmental Health and Safety Office. Humane perifere blodmononukleære celler blev købt som buffy frakker fra kommercielle kilder. Primære humane celler skal isoleres fra fraktioner af human buffy coat og kræve godkendelse på biosikkerhedsniveau 2 og detaljerede standardprocedurer og godkendelse fra den institution...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

CAR-T-celleterapi fortsætter med at få interesse for både forskning og kommercielle anvendelser. På trods af den succes, CAR-T-celleterapi har haft med at behandle blodkræft, begrænser de høje omkostninger ved proceduren dens anvendelse. Protokollen, der præsenteres her, introducerer en ny metode til viral genoverførsel af T-celler uden behov for spinokulation af retronectinbelagte plader. Fremstilling af tørre makroporøse alginatstilladser til mediering af transduktion er relativt enkel og er en passende bill...

Immunterapi er opstået som et revolutionerende kræftbehandlingsparadigme på grund af dets evne til specifikt at målrette tumorer, begrænse off-target cytotoksicitet og forhindre tilbagefald. Især har kimær antigenreceptor T (CAR-T) celleterapi vundet popularitet på grund af dens succes med behandling af lymfomer og leukæmier. FDA godkendte den første CAR-T-celleterapi i 2017 og har siden da godkendt yderligere fire CAR-T-celleterapier 1,2,3,4,5. CAR'er har et antigengenkendelsesdomæne, der normalt består af et enkelt kædevariabelt fragment af et monoklonalt antistof, der er specifikt for et tumorassocieret antigen 3,4. Når en CAR interagerer med sit tumorassocierede antigen, aktiveres CAR-T-cellerne, hvilket fører til et antitumorrespons, der involverer cytokinfrigivelse, cytolytisk degranulering, transkriptionsfaktorekspression og T-celleproliferation. For at producere CAR-T-celler opsamles blod fra patienten for at få deres T-celler. CAR'er tilsættes genetisk til patientens T-celler ved hjælp af en virus. CAR-T-cellerne dyrkes in vitro og infunderes tilbage i patienten 2,3,4,6. Vellykket generering af CAR-T-celler bestemmes af transduktionseffektiviteten, som beskriver antallet af T-celler, der er genetisk modificeret til CAR-T-celler.
I øjeblikket er guldstandarden for CAR-T-cellegenerering spinokulation af aktiverede T-celler og virus på retronectinbelagte plader 7,8. Transduktion begynder, når virale partikler går i indgreb med overfladen af T-cellerne. Retronectin fremmer colokalisering af virus og celler ved at øge bindingseffektiviteten mellem de virale partikler og cellerne, hvilket forbedrer transduktion 7,8. Retronectin fungerer ikke godt alene og skal ledsages af spinokulation, som forbedrer genoverførslen ved at koncentrere de virale partikler og øge T-cellens overfladepermeabilitet, hvilket giver mulighed for lettere virusinfektion8. På trods af succesen med spinokulation på retronectinbelagte plader er det en kompleks proces, der kræver flere spincyklusser og dyre reagenser. Derfor er alternative metoder til viral genoverførsel, der er hurtigere og billigere, meget ønskelige.
Alginat er et naturligt anionisk polysaccharid, der i vid udstrækning anvendes i den biomedicinske industri på grund af dets lave omkostninger, gode sikkerhedsprofil og evne til at danne hydrogeler ved blanding med divalente kationer 9,10,11,12. Alginat er en GMP-kompatibel polymer og er generelt anerkendt som sikker (GRAS) af FDA13. Tværbinding af alginat med kationer skaber stabile hydrogeler, der ofte bruges til sårheling, levering af små kemiske lægemidler og proteiner og celletransport 9,10,11,12,14,15,16. På grund af dets fremragende geleringsegenskaber er alginat det foretrukne materiale til at skabe porøse stilladser ved frysetørring10,17. Disse egenskaber ved alginat gør det til en attraktiv kandidat til fremstilling af et stillads, der kan formidle viral genoverførsel af aktiverede celler.
Beskrevet her er en protokol til fremstilling af tørre makroporøse alginatstilladser, kendt som Drydux-stilladser, der statisk transducerer T-celler ved viral genoverførsel17,18. Processen til fremstilling af disse stilladser er vist i figur 1. Disse stilladser eliminerer behovet for spinokulation af retronectinbelagte plader. De makroporøse alginatstilladser tilskynder til interaktion mellem virale partikler og T-celler for at muliggøre effektiv genoverførsel i et enkelt trin uden at påvirke funktionaliteten og levedygtigheden af de konstruerede T-celler17. Når de følges korrekt, har disse makroporøse alginatstilladser en transduktionseffektivitet på mindst 80%, hvilket forenkler og forkorter den virale transduktionsproces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figur 1: Skematisk og tidslinje for protokollen . (A) Tidslinje for fremstilling af de tørre makroporøse alginatstilladser. Alginat er tværbundet med calcium-D-gluconat og frosset natten over. De frosne stilladser fryses i 72 timer for at skabe Drydux-stilladserne. (B) Tidslinje for viral transduktion af aktiverede celler. Aktiverede celler og virus (MOI 2) podes oven på stilladset og inkuberes i komplette medier suppleret med IL-7 og IL-15. Stilladserne absorberer blandingen og fremmer viral genoverførsel. EDTA bruges til at opløse stilladserne og isolere de transducerede celler. Efter vask to gange med PBS kan cellepelleten bruges til analyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

Genteknologi af T-celler til CAR-T-celleterapi er kommet i spidsen for kræftbehandling i løbet af de sidste par år. CAR-T-celler produceres ved viral genoverførsel til T-celler. Den nuværende guldstandard for viral genoverførsel involverer spinokulation af retronectinbelagte plader, hvilket er dyrt og tidskrævende. Der er et betydeligt behov for effektive og omkostningseffektive metoder til at generere CAR-T-celler. Beskrevet her er en metode til fremstilling af billige, tørre makroporøse alginatstilladser, kendt som Drydux-stilladser, der effektivt fremmer viral transduktion af aktiverede T-celler. Stilladserne er designet til at blive brugt i stedet for guldstandard spinokulation af retronectinbelagte plader podet med virus og forenkle processen til transducering af celler. Alginat er tværbundet med calcium-D-gluconat og frosset natten over for at skabe stilladserne. De frosne stilladser frysetørres i en frysetørrer i 72 timer for at fuldføre dannelsen af de tørre makroporøse stilladser. Stilladserne formidler viral genoverførsel, når virus og aktiverede T-celler podes sammen oven på stilladset for at producere genetisk modificerede celler. Stilladserne producerer >85% primær T-celletransduktion, hvilket kan sammenlignes med transduktionseffektiviteten af spinokulation på retronectinbelagte plader. Disse resultater viser, at tørre makroporøse alginatstilladser tjener som et billigere og mere bekvemt alternativ til den konventionelle transduktionsmetode.

Disse makroporøse alginatstilladser er nemme at fremstille og bør komme ud af fryseapparatet som porøse, fluffy og hvide skiver. Selvom det ikke er undersøgt i dette eksperiment, kan calciumalginatopløsning støbes i forskellige forme for at skabe stilladser i forskellige former afhængigt af brugerens behov 9,10. Stilladserne er elektrostatiske og kan klæbe til låget på brøndpladen eller til en behandsket finger. Figur 2 vi...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Heri er en protokol til oprettelse af tørre makroporøse alginatstilladser, der formidler effektiv viral genoverførsel til brug i genteknologi af T-celler, herunder T-celler til CAR-T-celleterapi. Stilladserne viste sig at transducere aktiverede primære T-celler med >85% transduktion.

Fremstilling og anvendelse af tørre makroporøse alginatstilladser til viral transduktion af T-celler

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Beskrevet i denne video er en protokol til oprettelse og brug af tørre makroporøse alginatstilladser kendt som Drylux, der effektivt fremmer transduktion af aktiverede T-celler. Drydux er designet til at blive brugt i stedet for guldstandard spinokulation af RetroNectin-belagte plader podet med virus og forenkler processen til transducering af celler. Drydux har en transduktionseffektivitet, der kan sammenlignes med spinokulation på RetroNectin-belagte plader, og fungerer som et billigere og mere bekvemt alternativ til den konventionelle transduktionsmetode.Først fremstilles en 0,4% opløsning af calcium-D-gluconat. Tilsæt sterilt filtreret DI-vand til calcium-D-gluconat i et bægerglas. Rør på medium hastighed, indtil calcium-D-gluconatet er opløst, hvilket tager ca. 1 1/2 time.Når den er opløst, filtreres calcium-D-gluconatopløsningen sterilt. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur. Derefter fremstilles en 2% alginatopløsning.Dette kan opnås ved hjælp af et hætteglas med skruelåg eller et bægerglas. Begge vil blive vist her. Tilsæt forsigtigt ultrarent alginat til beholderen.Tilsæt den passende mængde DI-vand til alginatet. Vælg den størst mulige rørestang, der ikke forhindrer blanding, og tilsæt den til beholderen. Rør opløsningen på højt, indtil alginatet opløses, hvilket tager cirka en time.Hvis der er store alginatklumper på siden af beholderen, skal du vippe beholderen sidelæns for at løsne dem. Små klumper opløses i løbet af timen og giver ikke anledning til bekymring. Når 2%alginatopløsningen er opløst, reduceres omrøringshastigheden.Tilsæt langsomt et lige stort volumen af calcium-D-gluconatopløsningen til alginatopløsningen. Tilføjelse af det langsomt vil hjælpe med at forhindre tværbindingsklumper i at danne sig. Når calciumgluconatopløsningen er tilsat, øges omrøringshastigheden og omrøres kraftigt i 15 minutter.Vip beholderen sidelæns for at fjerne eventuelle klumper, der måtte være dannet. Efter kraftig omrøring i 15 minutter skal du sikre dig, at der ikke er klumper i opløsningen. Pipetter opløsningen til en 48- eller 24-brøndsplade.For en 48-brøndsplade pipetteres 300 mikroliter i hver brønd. Sørg for at kaste langsomt og skift spidser ofte, da opløsningen vil være tyktflydende og kan klæbe til spidsen. For en 24-brønds plade pipetteres en milliliter i hver brønd.Kast igen langsomt, og skift ofte pipettespidser. Dæk brøndpladerne med et låg, og frys ved negative 20 grader Celsius natten over. Forbered pladerne til fryseapparatet ved at fjerne lågene og fastgøre toppen med klude og gummibånd.Placer pladerne i lyofilisatorrøret, og sæt på lyofilisatoren i 72 timer. Efter 72 timer skal du fjerne pladen fra fryseren. Stilladserne er nu klar til at blive brugt til transduktion.Hvis du ikke bruger stilladserne med det samme, skal du forsegle pladen med Parafilm og opbevare ved fire grader Celsius, indtil det er nødvendigt. Til langtidsopbevaring anbefales det at vakuumforsegle pladen ud over tætning med Parafilm. Koncentrer viral supernatant ved centrifugering af to milliliter viral opløsning gennem et centrifugalfilter ved 1.500 g i 10 minutter.Der kræves 100 til 200 mikroliter koncentreret virus pr. Stillads. Spin i et par ekstra minutter, hvis det koncentrerede virusopløsningsvolumen er større end 200 mikroliter. For hvert stillads fremstilles en aliquot på 1 million aktiverede T-celler suspenderet i 50 mikroliter komplette cellekulturmedier.Tilsæt den koncentrerede virus til cellesuspensionen. Det samlede volumen af cellevirussuspensionen må ikke overstige 200 mikroliter for et stillads med 48 brønde eller 350 mikroliter for et stillads med 24 brønde. Tilsæt cellevirusblandingen dråbevis til toppen af det tørre stillads.Til negative kontroleksperimenter skal du bruge komplette cellekulturmedier i stedet for koncentreret virus. Tilsæt denne cellesuspension til toppen af det tørre stillads. Inkuber stilladserne i cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius i 45 til 60 minutter.Fjern stilladserne fra inkubatoren. Stilladserne skal absorbere opløsningen fuldt ud i løbet af denne tid. For at fremkalde spredning tilsættes komplette cellekulturmedier suppleret med IL-7 og IL-15 til hver brønd.IL-2 kan også bruges. For et stillads med 24 brønde tilsættes en milliliter. For et stillads med 48 brønde tilsættes 500 mikroliter.Inkubere ved 37 grader Celsius i 72 timer. Cellerne vil sprede sig i løbet af de 72 timer, hvilket kan gøre mediet orange. Fjern overskydende medier fra hver brønd.For at isolere celler fra stilladset tilsættes 0,25 molær EDTA-opløsning til hvert stillads. Tilsæt en milliliter til 24-brønds stilladser eller 300 mikroliter til 48-brønds stilladser. Lad pladen sidde, eller omrør forsigtigt i tre til fire minutter.Når det for det meste er opløst, pipetteres forsigtigt ind og ud inde i brønden. Et par ind- og udpipetteringstrin kan være nødvendige for at opløse stilladset helt. Overfør opløsningen til et 15 ml centrifugerør.Vask cellerne to gange med PBS. Der tilsættes 12 ml PBS til hvert centrifugerør. Centrifuge ved 400 g i fem minutter.Der dannes en cellepellet i bunden af røret. Aspirer supernatantopløsningen, og gentag vasken. Vær forsigtig med at fjerne supernatant helt med hver vask, da det er afgørende at slippe af med al EDTA.Efter vask med PBS en anden gang er cellepellet klar til analyse. Flowcytometri blev brugt til at bestemme transduktionseffektiviteten for hver gruppe. Ikke-transducerede celler blev brugt som en negativ kontrol og viste ingen transduktion.Celler podet på stilladser uden GFP retrovirus viste heller ingen transduktion. Drylux-gruppen, som havde aktiveret celler podet på de tørre makroporøse alginatstilladser, viste 85% transduktion, lige lavere end RetroNectin-gruppen. Disse resultater viser, at Drydux stilladser effektivt transducerede celler ved retroviral genoverførsel uden behov for spinokulation af RetroNectin-belagte plader.Drydux stilladser udviser høj transduktionseffektivitet, der kan sammenlignes med RetroNectin, hvilket giver en alternativ metode til transducering af T-celler. På grund af de lave omkostninger ved fremstilling af Drydux stilladser har denne proces potentialet til at sænke omkostningerne ved CAR T-celleterapier betydeligt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Brug af menneskelige perivaskulær stamceller til Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabrikation af mekanisk Tunable og bioaktive Metal Stilladser til biomedicinske anvendelser

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation af ESC-afledt Mouse Airway epitelceller Brug decellulariserede Lung Stilladser

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelte Electrospinning skrivning af tre-dimensionelle Poly(ε-caprolactone) stilladser med kontrollerbare morfologier for Tissue Engineering applikationer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fremstilling og karakterisering af Griffithsin-ændret Fiber stilladser til forebyggelse af seksuelt overførte infektioner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikation af Decellularized brusk-afledte Matrix stilladser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Transduktion og udvidelse af primære T-celler i ni dage med vedligeholdelse af central hukommelsefænotype

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Indbyrdes forbundne makroporøse 3D-stilladser fra Microgel-stænger

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...